李建勛，李小林，李鑫，王雨萌，張文娟，宋文軍

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

啤酒是以麥芽、水、啤酒花為主要原料，經(jīng)酵母發(fā)酵含有二氧化碳，起泡的，低酒精度的發(fā)酵酒[1]。隨著經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，添加輔料的新興保健啤酒出現(xiàn)在大眾眼前，如姜汁保健啤酒[2]、中藥保健啤酒[3]、菊花保健啤酒[4]等。目前，保健啤酒的研究成果雖然很多，但少數(shù)能實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。因此，增加啤酒品種，大力發(fā)展保健啤酒，將會(huì)是未來啤酒工業(yè)的一個(gè)新的發(fā)展方向[5]。

口蘑[6]又名白蘑、白蘑菇、蒙古口蘑等，富含多種生物活性物質(zhì)，包括多糖[7]、多肽[8]、總酚酸[9]、漆酶[10]等。口蘑多糖[11]是由糖苷鍵結(jié)合在一起的單糖單元組成的碳水化合物聚合物，具有抗氧化[12-13]、抗腫瘤[14-15]、增強(qiáng)免疫力[16]等多種活性作用，在醫(yī)藥、食品、保健食品等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。

目前鮮見以口蘑為原料制作的啤酒，本研究以口蘑多糖提取液和大麥芽為原料，釀造口蘑啤酒。以酒精度和感官評分為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)確定口蘑多糖啤酒的適宜條件，采用響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵工藝，為口蘑多糖啤酒的工業(yè)化提供技術(shù)支持和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

口蘑、澳麥芽、薩茲啤酒花：市售；CN36安琪啤酒活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；鄰苯二胺：上海羅恩化學(xué)技術(shù)有限公司；3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、葡萄糖：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；對二甲氨基苯甲醛：西隴科學(xué)股份有限公司；硫酸：天津市鑫橋化工貿(mào)易有限公司；苯酚：天津市江天化工技術(shù)有限公司；二甲氨基苯甲醛：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；異戊醇、異丁醇：天津市光復(fù)科技有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

WZS 32 Brix 0-32%型手持式折射儀：上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司；XFH-30CA型高壓蒸汽滅菌鍋：浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；6202型高速粉碎機(jī)：欣鎮(zhèn)精密企業(yè)有限公司；酒精計(jì)：武強(qiáng)縣恒翔儀器儀表有限公司；LR10-2.4A高速冷凍離心機(jī)：北京雷勃爾離心機(jī)有限公司；TU-1810型紫外可見光分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；HH-6恒溫水浴鍋：上海力辰邦西儀器科技有限公司；101-1ASB電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司；6202高速粉碎機(jī)：欣鎮(zhèn)精密企業(yè)有限公司；PHS-2F PH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 口蘑多糖提取

挑選新鮮口蘑洗凈置于55℃烘箱烘干至恒重，用高速粉碎機(jī)粉碎，將粉碎好的口蘑粗粉裝在保鮮袋室溫25℃保存。口蘑多糖采用熱水浸提法提取[17]。取4 g口蘑粗粉，加入蒸餾水，料液比1∶30（g/mL），提取溫度90℃，提取時(shí)間3 h，3 000 r/min離心10 min，過濾取上清液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 口蘑提取液多糖含量測定

口蘑提取液總糖含量測定參照文獻(xiàn)[18]的方法稍加改動(dòng)，適當(dāng)稀釋口蘑多糖提取液，取1 mL稀釋液，加入1 mL蒸餾水，1 mL 6%苯酚溶液以及5 mL濃硫酸，搖勻，室溫25℃靜置30 min后于490 nm波長測定吸光度，用2.0 mL蒸餾水作為空白對照。

口蘑提取液還原糖含量測定參照高文軍等[19]的方法稍加改動(dòng)。適當(dāng)稀釋口蘑多糖提取液，取1 mL稀釋液加入 2 mL 3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）試劑，沸水浴中加熱2 min后然后迅速冷卻，加入9.0 mL蒸餾水，搖勻，在540 nm波長處測定吸光度，以1.0 mL蒸餾水作為空白對照。

口蘑多糖含量的計(jì)算公式如下。

多糖含量/（mg/mL）=（總糖含量-多糖含量）×0.9

1.3.3 工藝流程

具體步驟：將大麥用粉碎機(jī)粉碎過40目篩，大麥粉與水比例為1∶4（g/mL）進(jìn)行浸出糖化過濾得到麥芽汁，麥芽汁煮沸過程中保持沸騰50 min，啤酒花加入量為0.1%，調(diào)整麥芽汁濃度為10°P，接入酵母量為0.8 g/L進(jìn)行發(fā)酵。設(shè)定主發(fā)酵時(shí)間8 d，后發(fā)酵時(shí)間10 d，在后發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行官評價(jià)和理化檢測。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

1.3.4.1 主發(fā)酵溫度對口蘑多糖啤酒的影響

將得到的麥汁過濾后分裝于三角瓶中，麥汁體積為200 mL，進(jìn)行煮沸。設(shè)定主發(fā)酵溫度分別12、14、16、18、20℃，并且在主發(fā)酵階段加入口蘑多糖提取液，口蘑多糖提取液添加量為5.0 mL，其他工藝按照1.3.3操作，考察主發(fā)酵溫度對口蘑多糖啤酒的影響。

1.3.4.2 口蘑多糖提取液添加量對口蘑多糖啤酒的影響

將得到的麥汁過濾后分裝于三角瓶中，麥汁體積為200 mL，進(jìn)行煮沸。在主發(fā)酵過程分別向麥汁中添加口蘑多糖提取液 1.0、3.0、5.0、7、9.0 mL。設(shè)定主發(fā)酵溫度為16℃，其他工藝按照1.3.3操作，考察口蘑多糖提取液添加量對口蘑多糖啤酒的影響。

1.3.4.3 口蘑多糖提取液加入階段對口蘑多糖啤酒的影響

將得到的麥汁過濾后分裝于三角瓶中，麥汁體積為 200 mL，進(jìn)行煮沸。分別在煮沸 20、30、40 min、主發(fā)酵、后發(fā)酵階段添加口蘑多糖提取液。設(shè)定主發(fā)酵溫度為16℃口蘑多糖添加量為5.0 mL，其他工藝按照1.3.3操作，考察口蘑多糖提取液加入階段對口蘑多糖啤酒的影響。

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

以釀造口蘑多糖啤酒的單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，以影響啤酒酒精度和感官評分的主發(fā)酵溫度、口蘑多糖提取液添加量、口蘑多糖提取液加入時(shí)機(jī)為試因素，感官評分為響應(yīng)值，以Box-Behnken為原理建立三因素三水平的中心組合試驗(yàn)。響應(yīng)面法試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 Box-Behnken中心組合試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken central composite design

1.3.6 感官評分標(biāo)準(zhǔn)

參照 GB/T 4928—2008《啤酒分析法》和 GB/T 4927—2008《啤酒》對口蘑多糖啤酒的色澤、香氣、泡沫、口感進(jìn)行感官評定。感官評分見表2。

表2 口蘑多糖啤酒評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Scoring standards of Tricholoma mongolicum polysaccharide beer

1.3.7 指標(biāo)測定

1.3.7.1 酒精度的測定

參考文獻(xiàn)[20]的方法，采用蒸餾法測量酒精度。

1.3.7.2 總酸的測定

參考文獻(xiàn)[21]方法，采用電位滴定法測定總酸含量。

1.3.7.3 雙乙酰的測定

參考文獻(xiàn)[22]的方法進(jìn)行雙乙酰含量測定。

1.3.7.4 色度的測定

參考文獻(xiàn)[23]的方法，采用紫外分光光度計(jì)法測量啤酒色度。

1.3.7.5 雜醇的測定

參考文獻(xiàn)[24]的方法，采用紫外分光光度法測定啤酒中雜醇含量。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析采用Design Expert 8.0.6，采用Origin 2022軟件進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，苯酚-硫酸法測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1 苯酚-硫酸法葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of phenol-sulfuric acid method for glucose

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，DNS法測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 DNS葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of glucose by DNS method

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 主發(fā)酵溫度對口蘑多糖啤酒的影響

主發(fā)酵溫度對口蘑多糖啤酒的影響見圖3。

圖3 主發(fā)酵溫度對口蘑多糖啤酒的影響Fig.3 Effect of main fermentation temperature on the Tricholoma mongolicum polysaccharide beer

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，口蘑多糖啤酒感官評分和酒精度均呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)主發(fā)酵溫度為16℃，酒精度為4.92%vol，感官評分為75.55。當(dāng)主酵溫度較低時(shí)，酵母發(fā)酵速度緩慢，產(chǎn)生的酯香味淡薄；當(dāng)主發(fā)酵溫度較高時(shí)，酵母代謝能力增強(qiáng)，發(fā)酵速度快，產(chǎn)生副產(chǎn)物高級醇等含量高，產(chǎn)酒精能力增強(qiáng)，對整體口感影響大[25]。因此，主發(fā)酵溫度為16℃合適口蘑多糖啤酒。

2.2.2 口蘑多糖提取液添加量對口蘑多糖啤酒的影響

口蘑多糖提取液添加量對口蘑多糖啤酒的影響見圖4。

圖4 口蘑多糖提取液添加量對口蘑多糖啤酒的影響Fig.4 Effect of Tricholoma mongolicum polysaccharide extract addition on the T.mongolicum

由圖4可知，隨著口蘑多糖提取液添加量的增加，酒精度和感官評分均呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)口蘑多糖提取液的添加量為5.0 mL時(shí)，酒精度為4.68%vol，感官評分為84.8，麥芽香和口蘑香味突出。當(dāng)口蘑多糖提取液添加量較低時(shí)，感官得分較低，由于口蘑多糖提取液添加量過低，造成口蘑香氣口感不突出；而口蘑多糖提取液添加量過高，又會(huì)導(dǎo)致口蘑香味覆蓋麥芽和酒花的香味，使得產(chǎn)品口感單薄[26]。所以將口蘑多糖提取液的添加量選為5.0 mL較為合適。

2.2.3 口蘑多糖提取液加入階段對口蘑多糖啤酒的影響

口蘑多糖提取液加入階段對口蘑多糖啤酒的影響見圖5。

圖5 口蘑多糖提取液加入階段對口蘑多糖啤酒的影響Fig.5 Effect of Tricholoma mongolicum polysaccharide extract adding stage on the T.mongolicum polysaccharide beer

由圖5可知，隨著口蘑多糖提取液加入階段的改變口蘑多糖啤酒的酒精度基本保持穩(wěn)定，感官評分呈現(xiàn)先升高后降低，在煮沸階段加入口蘑多糖提取液，煮沸時(shí)間過長，影響口蘑多糖啤酒口感，造成口蘑香氣不足，在主發(fā)酵階段添加口蘑多糖提取液，口蘑香氣突出，酒精度為4.46%vol，感官評分最高為79.8。在后發(fā)酵加入口蘑多糖提取液，口蘑香氣太重，造成口蘑多糖啤酒口感和氣味不協(xié)調(diào)[27]。所以將口蘑多糖提取液的加入階段為主發(fā)酵較為合適。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 口蘑多糖啤酒發(fā)酵工藝優(yōu)化回歸分析

響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and results

由表2可知，以感官評分（Y）為因變量，主發(fā)酵溫度（A）、口蘑多糖提取液添加量（B）和口蘑多糖添加階段（C）為自變量，進(jìn)行回歸擬合，方程如下。

回歸方程分析見表3。

表3 回歸方程分析Table 3 Regression equation analysis

續(xù)表3 回歸方程分析Continue table 3 Regression equation analysis

由表3可知，在感官評價(jià)中回歸模型p＜0.01，表示差異極顯著（p＜0.01），失擬項(xiàng) P=0.271 1＞0.05，失擬項(xiàng)差異不顯著；由F值可知，3個(gè)因素影響大小關(guān)系為A＞B＞C；一次項(xiàng) A、B、交互項(xiàng) AB 及二次項(xiàng) A2、B2、C2對感官評分的影響極顯著（p＜0.01）；一次項(xiàng)C和交互項(xiàng)AC、BC對結(jié)果影響不顯著；方差分析表明該模型不存在失擬因素，擬合程度好，可用于分析口蘑多糖啤酒感官的評分。

2.3.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面分析見圖6。

圖6 各因素交互作用對感官評分的影響Fig.6 Influence of interaction of various factors on the sensory score

由圖6可以看出，主發(fā)酵溫度與口蘑多糖提取液添加量交互作用最強(qiáng)，其次是主發(fā)酵溫度與口蘑多糖提取液加入階段，而口蘑多糖提取液添加量與口蘑多糖提取液加入階段交互作用最弱。

模型預(yù)測最優(yōu)條件為主發(fā)酵溫度為16℃、口蘑多糖提取液加入量為4.41 mL，口蘑多糖提取液加入階段為主發(fā)酵期間。在此條件下口蘑多糖啤酒感官評分最高為89.715 9。為進(jìn)一步確定口蘑多糖啤酒在實(shí)際生產(chǎn)中的可靠性與可行性，方便于實(shí)際操作，將工藝條件修改為主發(fā)酵溫度16℃、口蘑多糖提取液加入量4.4 mL、口蘑多糖提取液加入階段為主發(fā)酵期間，并以其為條件進(jìn)行擴(kuò)大性試驗(yàn)驗(yàn)證，經(jīng)品評后，感官評分為90.0，與模型預(yù)測值89.715 9分基本一致，表明模型有效可靠。

2.4 口蘑多糖啤酒理化分析

在主發(fā)酵溫度16℃、口蘑多糖提取液加入量4.4 mL，主發(fā)酵加入口蘑多糖提取液條件下，對口蘑多糖啤酒色度、酒精度、總酸及雜醇等含量進(jìn)行檢測，結(jié)果見表4。

表4 口蘑多糖啤酒理化分析Table 4 Physical and chemical analysis of the Tricholoma mongolicum polysaccharide beer

由表4可知，在最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下，口蘑多糖啤酒均符合GB/T 4928—2008《啤酒分析法》和GB/T 4927—2008《啤酒》?？谀⒍嗵瞧【粕珴山瘘S，無懸浮物，泡沫較持久潔白，細(xì)膩，具有和諧的酒香，口蘑香和麥芽香，口感醇正，無異味。

3 結(jié)論

本研究采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法分析對口蘑多糖啤酒釀造工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，口蘑多糖啤酒最佳釀造工藝條件為主發(fā)酵溫度16℃、口蘑多糖提取液加入量為4.4 mL，口蘑多糖提取液加入階段為主發(fā)酵階段，其感官評分為90。在最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下進(jìn)行理化指標(biāo)檢測，口蘑多糖啤酒符合GB/T 4928—2008《啤酒分析法》和GB/T 4927—2008《啤酒》，酒體色澤呈金黃，無明顯懸浮物；泡沫持久潔白，細(xì)膩；具有口蘑、麥芽特有香氣；口感醇正，無酸味。本研究為口蘑多糖啤酒的發(fā)酵生產(chǎn)可行性提供了理論和實(shí)踐基礎(chǔ)，對口蘑的有效利用有重要的指導(dǎo)和意義。