趙俊鑫,李亞輝,祁翰蒙,陳彥澤,張怡雯,馮如意,喬富強(qiáng),姚華
(北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京102206)
乳制品中含有人體生長(zhǎng)發(fā)育所必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),如蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)、維生素等,可為不同階段人群提供能量。當(dāng)前乳制品主要為牛乳制品,輔以羊乳、駝乳等,加工成乳粉、煉乳、液態(tài)乳和干酪等食品。不同加工方式、不同畜種來(lái)源、不同保存方式對(duì)乳成分含量均有一定影響,因此國(guó)內(nèi)外相繼建立了乳及乳制品標(biāo)準(zhǔn),檢測(cè)內(nèi)容主要有污染物指標(biāo)、獸藥殘留指標(biāo)、微生物指標(biāo)、營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)和體細(xì)胞指標(biāo)[1]。檢測(cè)技術(shù)主要包括酶聯(lián)免疫法、近紅外光譜法、凝膠電泳法、氣相色譜和氣相色譜質(zhì)譜法、高效液相色譜法及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等。本文基于多種方法在乳制品分析上的應(yīng)用,分析和探討不同方法的優(yōu)劣,為乳制品的開發(fā)及其相關(guān)行業(yè)應(yīng)用提供理論依據(jù)。
酶聯(lián)免疫法是一種在免疫基礎(chǔ)上,根據(jù)抗原與酶標(biāo)抗體特異性親和,然后通過(guò)顯色來(lái)進(jìn)行定量或定性分析的一種方法[2]。目前乳制品中主要應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)。牛乳中蛋白質(zhì)含量約3.0%~3.7%,有抗菌、抗病毒、參與免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性功能[3],是乳制品的重要組成部分。相較于人乳,牛乳在蛋白質(zhì)類型和同源性上存在較大差異,有研究表明,牛奶過(guò)敏是兒童早期最常見(jiàn)的食物過(guò)敏之一,且可能持續(xù)到成年[4]。因此對(duì)乳蛋白的分析至關(guān)重要。
1999年,張英華等[5]率先應(yīng)用酶聯(lián)免疫法測(cè)定牛初乳中乳鐵蛋白的含量,最小檢出量為0.5 ng/mL LF,線性范圍在0.8~100 ng/mL之間,結(jié)果較為理想。黨慧杰等[6]也對(duì)基于ELISA等技術(shù)對(duì)牛乳中主要致敏蛋白的檢測(cè)進(jìn)行了闡述。李媛媛等[7]以商業(yè)兔抗αs-酪蛋白、兔抗β-乳球蛋白、兔抗牛血清白蛋白(BSA)多克隆抗體為一抗,標(biāo)記HRP的羊抗兔IgG為二抗,TMB為底物,建立了一種重復(fù)性好,靈敏度高,可用于牛乳中3種蛋白致敏性測(cè)定的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA(ic ELISA)法。Montiel等[8]研究中開發(fā)了一種用于測(cè)定β-乳球蛋白(β-LG)的高靈敏性的磁免疫傳感器,檢測(cè)限達(dá)到8 ng/mL。在樣品稀釋后成功應(yīng)用于檢測(cè)不同類型牛奶中的β-LG,沒(méi)有任何基質(zhì)效應(yīng)。
酶聯(lián)免疫法操作簡(jiǎn)單、所需樣品量少、專一性強(qiáng),只能對(duì)單一蛋白進(jìn)行檢測(cè),如商業(yè)化試劑盒可檢測(cè)骨橋蛋白和酪蛋白。酶聯(lián)免疫法廣泛應(yīng)用于乳制品摻假的現(xiàn)場(chǎng)快速測(cè)定,確保乳制品的質(zhì)量與真實(shí)性,而更高的靈敏度和更低的檢出限成為酶聯(lián)免疫法未來(lái)發(fā)展與實(shí)際應(yīng)用中的必然趨勢(shì)與要求[9]。
王建明等[13]利用傅里葉變換近紅外光譜技術(shù)采集被阪崎腸桿菌、金葡萄球菌、大腸桿菌3種致病菌污染的牛奶樣品的近紅外透射光譜(NP),先對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理,再結(jié)合偏最小二乘判別分析進(jìn)行探究。研究表明,利用FT-NIR技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法經(jīng)過(guò)合適預(yù)處理方法后能有效用于乳制品中這3種菌的鑒別。Al-Qadiri H M等[24]用近紅外光譜技術(shù)檢測(cè)不同溫度下儲(chǔ)存不同時(shí)間的巴氏奶中菌落總數(shù),通過(guò)將光譜特征的變化與細(xì)菌增殖和牛奶腐敗的水平相關(guān)聯(lián),使用短波長(zhǎng)近紅外光譜快速、無(wú)損的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)牛奶腐敗程度。Nicolaou N[25]等以全脂、半脫脂和脫脂奶為樣品,采用傅里葉變換近紅外光譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)了牛奶樣品中腐敗微生物的快速定量檢測(cè)。
近紅外光譜技術(shù)操作簡(jiǎn)單、時(shí)間短、可多組分同時(shí)檢測(cè)、無(wú)需任何化學(xué)試劑,成本低,同時(shí)存在信號(hào)提取困難、靈敏度低等問(wèn)題,受檢測(cè)條件、溫濕度、儀器和樣品狀態(tài)等因素影響,尚需進(jìn)行深入研究[26-30]。
近紅外光譜是一種波長(zhǎng)范圍為780~2526 nm的電磁波,通過(guò)掃描待測(cè)樣品的近紅外光譜,樣品中的分子選擇性地吸收不同頻率的近紅外光,透射出來(lái)的近紅外光線攜帶樣品中有機(jī)物的信息。通過(guò)檢測(cè)器分析透射光或反射光的光密度,來(lái)對(duì)待測(cè)組分進(jìn)行定性或定量分析[10-12]。
乳制品被微生物感染變質(zhì),摻假、以次充好等現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生,誤食后可能引起腹瀉、頭痛等,嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致中毒,危及生命[13-14]。我國(guó)在2010年陸續(xù)發(fā)布了7項(xiàng)[15-21]針對(duì)乳及乳制品中菌落總數(shù)限量及大腸菌群、沙門氏菌等微生物指標(biāo)的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。目前,利用近紅外光譜技術(shù)能夠反應(yīng)微生物細(xì)胞的分子振動(dòng)信息特點(diǎn),并且檢測(cè)過(guò)程快速、高效、準(zhǔn)確、成本低,可以有效監(jiān)管乳制品中微生物的存在,品牌鑒別和溯源方面也有初步的應(yīng)用研究,甚至可應(yīng)用于乳制品化學(xué)成分檢測(cè),促進(jìn)乳品行業(yè)發(fā)展[14,22]。
MARTOS等[23]應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)檢測(cè)牛奶中的大腸桿菌和銅綠假單胞菌,發(fā)現(xiàn)當(dāng)污染水平高于5 log CFU/mL時(shí),偏最小二乘判別模型便可區(qū)分出牛奶基質(zhì)中的這兩種菌,在高濃度污染下(8~9 log CFU/mL)分離效果更明顯,且以牛奶為培養(yǎng)基生長(zhǎng)的樣品比先在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)后懸置于牛奶中的樣品鑒別效果好。
聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)在乳制品蛋白質(zhì)分離分析中應(yīng)用廣泛,分為變性(SDS-PAGE)和非變性(native-PAGE)聚丙烯酰胺凝膠電泳兩種,前者添加SDS和疏基乙醇變性劑,并需要加熱才能將聚合蛋白質(zhì)變性為亞基從而進(jìn)行分離,而后者不含變性劑,大部分在低溫條件下就可以對(duì)天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離[31]。我國(guó)2010年頒布的GB 10765-2010和GB 10767-2010食品國(guó)家安全標(biāo)準(zhǔn)中中規(guī)定0~6月齡、6~12月齡及12~36月齡嬰兒配方食品每100 k J所含蛋白質(zhì)應(yīng)在0.45~0.75 g和0.7~1.2 g之間,包括現(xiàn)行GB 19301—2010國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)也規(guī)定生乳中蛋白質(zhì)含量應(yīng)不低于2.8 g/100 g[21,32,17]。當(dāng)前,由于不同研究目的采用凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)乳制品中蛋白質(zhì)含有的方法已有報(bào)道,如表1所示,結(jié)果顯示從乳球蛋白到酪蛋白的檢測(cè),均可采用經(jīng)條件優(yōu)化的電泳技術(shù),滿足檢測(cè)的基本需要。吳儀凡等[33]采用兩種方法分析綿羊乳與其他乳種之間營(yíng)養(yǎng)成分及乳清蛋白組分的差異,揭示了不同乳種之間其蛋白質(zhì)、脂肪等宏觀營(yíng)養(yǎng)素含量有顯著差別。韓奕奕等[34]建立了一種快速準(zhǔn)確檢測(cè)乳與乳制品中β-乳球蛋白含量的SDS-PAGE方法,其線性范圍在0.238~7.128 mg之間,液態(tài)奶及奶粉的檢出限分別為24 mg/100 mL和240 mg/100 g。
表1 凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)乳品中蛋白質(zhì)含量
(續(xù)表1)
毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)是根據(jù)不同分子量的蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中遷移速度不同來(lái)進(jìn)行蛋白分離,然后通過(guò)紫外線吸收來(lái)完成蛋白含量的檢測(cè)[35]。孫娜娜等[36]研究利用乳鐵蛋白和DNA序列的特異性結(jié)合,根據(jù)毛細(xì)管凝膠電泳后游離DNA序列的峰面積是否減少以及減少程度,建立了一種全自動(dòng)毛細(xì)管凝膠電泳定量檢測(cè)的方法,操作簡(jiǎn)便、分析時(shí)間短、高通量,適用于乳及其制品中乳鐵蛋白的定性和定量分析。經(jīng)過(guò)對(duì)毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離中緩沖液種類、緩沖液p H、分離溫度和添加劑等條件的優(yōu)化,可以實(shí)現(xiàn)各種β-CN變異體的分離,且方法的精密度和準(zhǔn)確度高,適用于對(duì)乳制品中(液態(tài)奶和奶粉)A2β-CN和總β-CN的分析測(cè)定[37]。吳亞君等[38]實(shí)驗(yàn)采用毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù)建立了牛乳中外源蛋白成分快速檢測(cè)方法,并與SDSPAGE垂直板電泳及蛋白芯片電泳進(jìn)行比較,以驗(yàn)證毛細(xì)管電泳結(jié)果的準(zhǔn)確性。劉鳴暢等[39]用毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù),構(gòu)建聚類分析模型,篩選不同乳源乳品靶標(biāo)蛋白峰以及判定標(biāo)準(zhǔn)。驗(yàn)證方法穩(wěn)定性、重復(fù)性、檢出限等參數(shù),并對(duì)市售樣品進(jìn)行檢測(cè),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)乳源蛋白的快速篩查。
目前電泳技術(shù)在差異蛋白質(zhì)檢測(cè)中應(yīng)用十分廣泛,其檢測(cè)速度、靈敏度、重現(xiàn)性、準(zhǔn)確性得到提升,新的分離模式和聯(lián)用方法也將得到更廣泛的應(yīng)用[40]。
高效液相色譜技術(shù)是一種快速有效的有機(jī)化合物分析技術(shù),以液體為流動(dòng)相,采用高壓輸液系統(tǒng),樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相,被流動(dòng)相載入裝有固定相的色譜柱內(nèi),在柱內(nèi)各成分被分離后,通過(guò)檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。該方法已應(yīng)用到化工、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域中[41]。文獻(xiàn)顯示,采用高效液相色譜檢測(cè)技術(shù)對(duì)乳制品中的維生素進(jìn)行定量檢測(cè),如表2所示,一方面保障了乳制品的質(zhì)量,另一方面也對(duì)乳制品成分和功能的深入分析提供了借鑒[42]。
表2 高效液相色譜法檢測(cè)乳品中維生素含量
綦艷等[43]在GB5413.9-2010基礎(chǔ)上優(yōu)化樣品前處理提取過(guò)程,采用高效液相色譜技術(shù),成功建立乳制品中維生素A的快速定量分析方法。Campos-Giménez等[44]采用含有氰化鈉的乙酸鈉緩沖液提取(100℃,30 min)維生素B12,經(jīng)免疫親和柱純化和濃縮后,用紫外檢測(cè)(361 nm)液相色譜法測(cè)定,該方法具有良好的線性范圍。Sun等[45]先將樣品脂肪酶水解,皂化提取,甲醇復(fù)溶后,首先在Xbridge C18柱上分離維生素K,然后在鋅粉還原柱上進(jìn)一步分離,并使用熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè),外標(biāo)法定量。后期可采用高效液相色譜-柱后還原法測(cè)定調(diào)制奶粉中維生素K1和維生素K2含量。施鵬飛等[46]進(jìn)一步優(yōu)化GB5009.82-2016中高效液相色譜法,樣品先經(jīng)氫氧化-鉀皂化后,以石油醚為萃取溶劑,萃取液經(jīng)無(wú)水硫酸鈉洗脫、旋蒸、定容,用正相高效液相色譜硅膠柱凈化維生素D,反相超高效液相色譜用以甲醇/水(v甲醇∶v水=97∶3)為流動(dòng)相,紫外檢測(cè),內(nèi)標(biāo)法定量,實(shí)現(xiàn)應(yīng)用反相超高效液相色譜技術(shù)檢測(cè)乳及乳制品中維生素D的含量。Schmidt A等[47]首次對(duì)牛奶中的4-吡哆酸進(jìn)行綜合調(diào)查。建立了一種快速、簡(jiǎn)單的超高效液相色譜法用于同時(shí)測(cè)定天然B6維生素吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺、它們的單磷酯和4-吡哆酸以及維生素B2和核黃素及其磷酯核黃素5-磷酸,該方法通過(guò)反相和p H梯度洗脫可在6 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)分離。Sazali NH等[48]研究分別以乙腈和硫酸銨為萃取溶劑和鹽析劑。采用Hypersil ODS(250x i.d 4.6 mm,5μm)高效液相色譜柱,二極管陣列檢測(cè)器對(duì)維生素D3提取物進(jìn)行分離。維生素D2作內(nèi)標(biāo)定量,實(shí)現(xiàn)了牛奶樣品中維生素D3含量的測(cè)定。該方法簡(jiǎn)化樣品制備,可實(shí)現(xiàn)樣品高通量。優(yōu)于酶的樣品制備方法不僅大大縮短了分析的總時(shí)間,而且還維持了所研究維生素的天然成分。
高效液相色譜技術(shù)作為食品安全檢測(cè)行業(yè)一種有效的分離手段,得到了廣泛應(yīng)用,但是沒(méi)有一種方法能夠面面俱到,因此有效整合使用多種色譜技術(shù),才能更好的服務(wù)社會(huì),滿足行業(yè)需求。
液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)也被稱作為液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS),早期主要應(yīng)用于食品行業(yè)的農(nóng)藥殘留和毒素檢測(cè)[49],是在液相色譜分離技術(shù)的基礎(chǔ)上逐漸發(fā)展而來(lái)的。其原理是以液相色譜為分離系統(tǒng),樣品混合溶液經(jīng)過(guò)液相色譜儀分離后,在離子源被離子化,以質(zhì)譜為檢測(cè)系統(tǒng),通過(guò)檢測(cè)器形成相應(yīng)的質(zhì)譜圖。利用被測(cè)組分的含量與其在質(zhì)譜圖中響應(yīng)的特定關(guān)系實(shí)現(xiàn)對(duì)其有效成分的定性和定量分析,實(shí)驗(yàn)分析流程如圖1所示。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)相比傳統(tǒng)試劑法,具有很高的選擇性和靈敏度,是現(xiàn)在分離科學(xué)中較為實(shí)用的技術(shù)[50]。
圖1 LC-MS實(shí)驗(yàn)分析流程圖
質(zhì)譜技術(shù)促進(jìn)了蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展,MIRANDA等[51]基于液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)技術(shù),準(zhǔn)確測(cè)定了6種主要的乳蛋白,包括等位基因和剪接變異,以及翻譯后修飾所產(chǎn)生的異構(gòu)體,旨在建立乳制品特征蛋白的質(zhì)量數(shù)據(jù)庫(kù)。液相色譜-串聯(lián)譜法可以實(shí)現(xiàn)乳制品中乳酸鏈球菌素的含量的檢測(cè),樣品經(jīng)提取凈化后,用超高效液相色譜分離后,以PLRPS-S為色譜柱,電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析,方法線性關(guān)系大于0.99,回收率達(dá)到89.01%~104.52%[52]。NGUYEN等[53]建立了一種超高高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜(UHPLC-HRMS)法,可對(duì)牛奶中的β-酪蛋白(β-CN)表型進(jìn)行分析,共檢出3種β-CN變異株A1、A2和I,5個(gè)β-CN表型A1A1、A1A2、A1I、A2A2和A2I,其中β-CN表型A2A2相較于其他表型比例較高。
2008年三鹿奶粉事件中的三聚氰胺與環(huán)丙氨嗪、雙氰胺和縮二脲被稱為偽蛋白,這些化合物含氮量較高、穩(wěn)定、成本低,添加到乳制品中可以使產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量高于實(shí)際值,但對(duì)人類健康帶來(lái)了風(fēng)險(xiǎn)。單藝等[54]以縮二脲-13C2和環(huán)丙氨嗪-D4為印記分子,以Fe3O4為磁性組分,建立磁性分子印跡聚合物提取的超高效液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)法,用于檢測(cè)乳及乳制品中這4種偽蛋白,在5~200 ng/mL的線性范圍良好,準(zhǔn)確度高。隨著人們消費(fèi)需求的增強(qiáng),一些含有功能性成分的乳制品不斷涌現(xiàn),選擇合適的方法分析測(cè)定不同乳及乳制品的組分和含量,建立標(biāo)準(zhǔn)方法,是乳品研發(fā)和質(zhì)量控制與監(jiān)管的重要環(huán)節(jié)。將不同技術(shù)方法與質(zhì)譜儀聯(lián)用,縮短檢測(cè)時(shí)間,提高準(zhǔn)確性和靈敏度,將會(huì)給乳成分準(zhǔn)確定量和品質(zhì)控制提供更多的可能性。
氣相色譜利用固定相對(duì)有機(jī)化合物有效的分離能力,可對(duì)各種物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。而氣相質(zhì)譜在結(jié)合氣相色譜分辨能力的同時(shí),以質(zhì)譜(mass spectrograph,MS)為檢測(cè)器,準(zhǔn)確鑒定化合物,完成對(duì)未知化合物的分離,在乳制品檢測(cè)中應(yīng)用廣泛。
1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯(OPO)是一種嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑,可以促進(jìn)脂肪和鈣的吸收,有效降低脂肪酸皂的形成。木其爾等[55]采用濃鹽酸水解樣品,應(yīng)用氫火焰離子化檢測(cè)器-氣相色譜儀,內(nèi)標(biāo)法定量準(zhǔn)確測(cè)定了奶粉樣品中OPO含量,同時(shí)為OPO國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法的建立提供技術(shù)支持。劉春霞等[56]應(yīng)用氣相色譜技術(shù)建立了乳與乳制品以及植物蛋白飲料中膽固醇的檢測(cè)方法。樣品先皂化再提取,提取液濃縮至干,定容,外標(biāo)法定量。膽固醇的添加量為1~40 mg時(shí),回收率可達(dá)到90.5%~94.5%,本方法的方法檢出限、定量限分別是0.3 mg/100 g和1 mg/100 g。翁晨等[57]以市場(chǎng)中7種乳制品為研究對(duì)象,通過(guò)氣相色譜分析奶粉中甘油三酯和磷脂的脂肪酸含量,液相色譜測(cè)定其膽固醇含量,分析不同年齡段、不同處理方式以及不同乳源乳制品的脂質(zhì)特點(diǎn)。結(jié)果表明全價(jià)營(yíng)養(yǎng)奶粉與中老年?duì)I養(yǎng)奶粉的脂肪酸組成與含量較為相似;不飽和脂肪酸含量在添加磷脂的嬰幼兒配方奶粉中較高;純牛奶、奶酪和發(fā)酵酸奶的膽固醇含量與脂肪含量呈正相關(guān);乳制品膽固醇含量與其乳源有關(guān)。Sanchez等[58]基于核磁共振(NMR)和氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)的化學(xué)指紋識(shí)別,首次對(duì)羊奶粉的液體和揮發(fā)性組分進(jìn)行了全面檢測(cè),共發(fā)現(xiàn)全羊奶粉液體部分中來(lái)自脂肪族、糖族和芳香族區(qū)域的44種代謝物及50種揮發(fā)物包括醛類、酮類、芳香烴和硫類化合物等。
氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了氣相色譜的分離技術(shù)和質(zhì)譜的鑒定技術(shù),二者優(yōu)勢(shì)互補(bǔ),有效提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性。近年來(lái),氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)廣泛應(yīng)用于食品分析檢測(cè)領(lǐng)域,操作簡(jiǎn)便,分離效果好。
全球乳制品需求不斷增長(zhǎng),行業(yè)面臨新的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。因此,明確乳制品的成分及含量,不僅有利于評(píng)價(jià)乳制品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,完善行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),保障消費(fèi)者權(quán)益,同時(shí)對(duì)乳制品的開發(fā)、市場(chǎng)需求的滿足起著重要作用。未來(lái)在乳制品分析的過(guò)程中,提高現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性,對(duì)先樣品確證,再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),節(jié)約耗材,也減少了人為誤差,從而提高檢測(cè)效率。進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)室方法的前處理過(guò)程,降低有機(jī)試劑的使用頻率,減少環(huán)境污染;未來(lái)借鑒多組學(xué)技術(shù),根據(jù)檢測(cè)需求優(yōu)化調(diào)整不同聯(lián)用方法,優(yōu)勢(shì)互補(bǔ),不斷提高檢測(cè)速度和精確度,使檢測(cè)過(guò)程不斷智能化、自動(dòng)化,促進(jìn)乳品行業(yè)良性健康發(fā)展。