晉宇軒，陳之林，杜致輝，許紅娟，楊 瀾，張朝君

(貴州省園藝研究所，貴州 貴陽 550006)

0 引言

【研究意義】苦苣苔科(Gesneriaceae)植物在我國主要分布于華南地區(qū)，尤以廣西、廣東和貴州等地的山地石灰?guī)r地區(qū)分布最為集中[1]。永福報春苣苔(P.yungfuensis)是我國廣西地區(qū)特有種，主要分布在桂林、永福及臨桂，多見于海拔200～450 m的石灰?guī)r石山陰處[2]。永福報春苣苔葉面斑紋復(fù)雜多變，花葶欣長，花朵碩大清麗，具有極高的觀賞價值。目前，永福報春苣苔的人工繁育技術(shù)主要為播種和葉插，有性繁殖的方式容易造成后代群體性狀分離[3]，而葉插繁殖技術(shù)難度低、便于操作、成活率高且成本低廉，通過葉插技術(shù)得到的種苗根系完整且易于保留優(yōu)良性狀[4]，被廣泛應(yīng)用于報春苣苔屬的種苗繁育[5-6]。分析永福報春苣苔葉片扦插過程中內(nèi)源激素的動態(tài)變化，對永福報春苣苔的繁育及苦苣苔科的繁育研究具有指導(dǎo)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】通過外施植物激素調(diào)節(jié)報春苣苔屬葉插繁殖已有一些研究。閆海霞等[7-8]研究表明，適宜濃度的IBA處理牛耳朵葉片、尖萼唇柱苣苔、硬葉唇柱苣苔、粉綠異裂苣苔、微斑唇柱苣苔和紅苞半蒴苣苔，可獲得較好的扦插繁殖效果；潘春柳等[9]發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的IAA和NAA處理可適用于弄崗唇柱苣苔的葉片扦插繁殖?！狙芯壳腥朦c】現(xiàn)有的關(guān)于報春苣苔屬葉片扦插繁殖的研究仍停留在插穗材料、扦插方法、基質(zhì)配比和后期管理等[10-13]技術(shù)層面的優(yōu)化與改進(jìn)，對于其葉片插穗離體到生根以及形成新芽過程中內(nèi)源激素變化的研究未見報道，對于永福報春苣苔葉插過程中內(nèi)源激素變化的研究亦無相關(guān)報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】測定永福報春苣苔葉片扦插過程中內(nèi)源激素的動態(tài)變化，初步確定影響其扦插繁育的關(guān)鍵內(nèi)源激素，為永福報春苣苔繁育技術(shù)研究及外源激素調(diào)控研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 永福報春苣苔 供試永福報春苣苔為葉插繁殖獲得的無性系，栽培在貴州省園藝研究所溫室內(nèi)。

1.1.2 試劑 吲哚乙酸(Indole acetic acid,IAA)、吲哚丁酸(Indole butyric acid,IBA)、異戊烯基腺苷(Isopentenyl adenosine,IPA)、脫落酸(Abscisic acid,ABA)、玉米素(Zeatin,ZT)、反式玉米素核苷(Transzeatin riboside,TZR)及赤霉素(Gibberellin,GA1/4/7)標(biāo)準(zhǔn)品均購于Sigma公司，甲醇購于Tidea公司。

1.1.3 儀器 試驗儀器包括臺式高速離心機(jī)(德國 SORVAL公司)、AR5120 電子天平(美國 AHOΜS 公司)、Aglient1290 高效液相色譜儀(美國 Aglient 公司)、AB SCIEX-6500Qtrap(MS/MS)(美國 AB 公司)和UYC-200 全溫培養(yǎng)搖床(上海新苗醫(yī)療器械制造公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 扦插及取樣 選取健康、無病蟲害的永福報春苣苔植株為母株，挑選大小均勻的葉片，剪下帶有部分葉柄的整葉作為插穗，斜插入基質(zhì)中，基質(zhì)稍沒過葉片與葉柄連接處。扦插完成后，澆透水并放入帶透明塑料蓋的育苗箱中保濕，置于陰涼通風(fēng)處。育苗箱內(nèi)空氣濕度80%，外界環(huán)境光照強(qiáng)度2 000 lx，溫度19～21℃。

扦插后，定期對插穗的生根動態(tài)進(jìn)行觀察，包括插穗愈傷組織，根系和不定芽的形成情況。選取扦插后不同生長階段插穗作為后續(xù)試驗材料，每個樣品3次重復(fù)。每次取樣將所選插穗清洗干凈后，剪碎混勻，液氮處理后存入超低溫冰箱備用。

1.2.2 內(nèi)源激素含量測定 取出超低溫保存樣本，于研缽中加入適量液氮研磨至干粉狀，稱取適量樣品置于玻璃試管中，向玻璃試管中加入異丙醇-水-鹽酸混合提取液，然后添加濃度為1 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液8 μL，低溫振蕩30 min，再加入適量二氯甲烷，低溫振蕩30 min；13 000 r/min低溫離心5 min，取下層有機(jī)相，避光條件下以氮氣吹干，再以甲醇(0.1%甲酸)復(fù)溶；13 000 r/min 低溫離心10 min，取上清液過0.22 μm 濾膜用于HPLC-MS/MS 檢測。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

測定數(shù)據(jù)采用Excel 進(jìn)行初步整理和歸納；使用SPSS進(jìn)行各激素含量在不同扦插階段的顯著性檢驗；使用R語言拓展工具RStudio對數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性及主成分分析，并對分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 生根過程的形態(tài)與階段劃分

永福報春苣苔葉片插穗生根類型主要為愈傷組織生根型。經(jīng)形態(tài)觀察，將永福報春苣苔葉片扦插生根進(jìn)程大致劃分為5個階段(圖1)。階段1，插穗離開母體；階段2，插穗切口處開始出現(xiàn)白色的愈傷組織，其葉片背部開始呈現(xiàn)紅色；階段3，插穗切口處開始出現(xiàn)不定根；階段4，插穗切口處不定根大量發(fā)生，葉柄處開始呈現(xiàn)紅色；階段5，插穗傷口處的根開始伸長生長，葉柄處不定芽開始發(fā)生。

2.2 葉插過程中內(nèi)源激素含量的變化

由表1可知，永福報春苣苔插穗剛離開

圖1 永福報春苣苔葉插生根過程各階段及形態(tài)Fig.1 Leaf morphological change of P. yungfuensis at different rooting stages during leaf cutting process

母體時，生長素IAA、IBA和IPA含量均處于較低水平，隨著愈傷組織的形成，其含量大幅提高，并達(dá)到各自的峰值1.916 ng/g、0.159 ng/g和1.07 ng/g后開始下降，3種生長素類激素含量的變化整體呈先升后降趨勢。細(xì)胞分裂素ZT和TZR含量呈下降-上升-下降趨勢，即插穗離體后呈大幅度下降，之后呈快速上升后下降趨勢；ABA含量呈先升后降再升趨勢；GA1含量在離體至愈傷出現(xiàn)階段微降，之后迅速升至峰值后下降；GA4和GA7含量整體呈下降趨勢，即在扦插初期大幅下降，之后趨于動態(tài)穩(wěn)定并保持在較低的水平。

表1 永福報春苣苔葉插各階段植物內(nèi)源激素含量Table 1 Plant endogenous hormones of P. yungfuensis at different culture stages during leaf cutting process ng/g

2.3 葉插生根過程中各內(nèi)源激素含量的相關(guān)性

對插穗生根進(jìn)程的5個階段9種內(nèi)源激素含量進(jìn)行相關(guān)性分析，9種激素兩兩關(guān)聯(lián)后共得到36個相關(guān)性分析組合(表2)，有18個組合的相關(guān)性達(dá)顯著水平(P<0.05)，其中，有11個組合的相關(guān)性達(dá)極顯著水平(P<0.01)；極顯著水平下，正、負(fù)相關(guān)系數(shù)最高的組合分別為ABA-IPA和IAA-GA4，相關(guān)系數(shù)分別為0.96和-0.97；顯著水平下，負(fù)相關(guān)關(guān)系主要存在于GA4、GA7、ZT與其他激素之間；IAA顯著相關(guān)的激素多達(dá)6種(除IBA和ABA)，且IAA關(guān)聯(lián)到的激素大部分為正相關(guān)；其次為ZT，其顯著相關(guān)的激素達(dá)到3種。各激素含量變化之間廣泛存在關(guān)聯(lián)情況，說明其信息發(fā)生重疊，可采用主成分分析方法對其進(jìn)行降維簡化處理并尋找關(guān)鍵因素。

2.4 插穗生根階段各主成分貢獻(xiàn)率

從圖2看出，在主成分構(gòu)成中，主成分因子PC1和PC2的累積貢獻(xiàn)率達(dá)92.73%，且PC1和PC2的貢獻(xiàn)率皆遠(yuǎn)大于PC3，說明信息主要集中在主成分PC1和PC2中，PC1和PC2基本可反映出插穗5個不同階段的激素含量特征。以各階段PC1和PC2值為橫縱坐標(biāo)作圖(圖3)，5個階段在空間上可以完全分開，且各階段內(nèi)部的3個重復(fù)較集中，說明以PC1和PC2為特征向量，完全可以對5個階段的激素含量特征進(jìn)行較好的描述與分辨。

圖2 插穗生根階段各主成分貢獻(xiàn)率Fig.2 The contribution rate of principal components at rooting stage of P. yungfuensis leaf cutting

圖3 插穗生根5個階段的主成分PC1和PC2分布Fig.3 Distribution of PC1 and PC2 at five rooting stages of P. yungfuensis leaf cutting

由表3可知，主成分因子PC1中，載荷最高且為正值的因素為IAA，其載荷值高達(dá)0.762，遠(yuǎn)高于載荷值第2位的因素TZR(0.354)，說明主成分因子PC1主要反映的因素為IAA；主成分因子PC2中，載荷最高且為正值的因素是ZT和TZR，載荷值分別為0.454和0.329，遠(yuǎn)高于其他因素的載荷值，說明此2種激素為主成分因子PC2主要反映的因素。綜上，生長素中的IAA和細(xì)胞

表3 旋轉(zhuǎn)后主成分因子的載荷矩陣Table 3 The loading matrix of principal component factors after rotation

分裂素中的ZT及TZR是永福報春苣苔葉片插穗生根進(jìn)程中的關(guān)鍵植物激素，此3種激素含量的水平對插穗生根進(jìn)程中多種植物激素含量的變化存在重要影響。

3 討論

植物內(nèi)源激素的含量是影響插穗不定根形成和發(fā)生的重要因素[14]，且扦插時插穗內(nèi)各激素不是單獨作用，而是相互協(xié)同參與根原基和芽原基的分化與發(fā)育[15]，外源植物生長調(diào)節(jié)劑主要也是通過調(diào)控內(nèi)源激素的含量來促進(jìn)插穗的生根和發(fā)芽[16]。植物內(nèi)源激素的種類、含量和比值等對扦插生根過程發(fā)揮著不同的作用。生長素類物質(zhì)對扦插生根的影響作用已有廣泛研究，其中IAA參與調(diào)節(jié)植物根原基的誘導(dǎo)、愈傷組織的形成與不定根發(fā)育生長每個階段[17]，一般認(rèn)為其具有顯著促進(jìn)愈傷組織和不定根形成的作用[18]。無患子(SapindusmukorossiGaertn.)硬枝、歐洲云杉(Piceaabies)等樹種與山木通(Clematisfinetiana)等藤本植物內(nèi)源IAA可以正向調(diào)控根原基的誘導(dǎo)和不定根的形成[19-21]，與本研究永福報春苣苔葉片插穗過程中IAA的含量在扦插后持續(xù)升高并在不定根開始發(fā)生階段達(dá)到峰值的結(jié)果相一致，說明IAA的含量增加和積累有利于其根原基的誘導(dǎo)和不定根的形成[22]，其后通過消耗IAA實現(xiàn)不定根的生長及伸長[23]，推測其可能通過促進(jìn)根原基的誘導(dǎo)而促進(jìn)永福報春苣苔葉片扦插生根。

細(xì)胞分裂素對扦插生根的影響沒有一致的結(jié)論。其中ZT對扦插生根的影響目前有2種研究結(jié)果，一方面，有研究發(fā)現(xiàn)以蒙古櫟嫩枝[24]作為插穗時，其內(nèi)源ZT發(fā)揮促進(jìn)不定根形成的作用；另一方面，在楨楠[25]扦插過程中玉米素ZT對不定根的生成表現(xiàn)為負(fù)調(diào)控作用。內(nèi)源TZR的相關(guān)研究較少，在云南大葉茶樹的扦插試驗[26]中發(fā)現(xiàn)，愈傷組織內(nèi)的高含量TZR有利于生根，而根部高含量TZR不利于生根。在永福報春苣苔扦插初期，插穗內(nèi)細(xì)胞分裂素(ZT和TZR)的含量均下降，推測扦插初期需要消耗一定的細(xì)胞分裂素來促進(jìn)細(xì)胞的分裂和分化；ZT在不定根誘導(dǎo)和發(fā)生過程中呈上升趨勢，在不定根大量發(fā)生階段達(dá)到峰值，之后在不定根伸長期降低，推測其可能通過促進(jìn)根原基的誘導(dǎo)和分化而促進(jìn)不定根的形成；TZR在不定根誘導(dǎo)時達(dá)到峰值后下降，其在愈傷組織內(nèi)的積累可能有利于根原基的誘導(dǎo)而促進(jìn)生根，隨著不定根的形成和伸長又逐漸被消耗。

4 結(jié)論

永福報春苣苔葉片插穗生根類型屬于愈傷組織生根型，其生根過程大致分為插穗離體、愈傷組織出現(xiàn)、不定根開始發(fā)生、不定根大量發(fā)生和根伸長且不定芽開始發(fā)生5個階段。所測定的9種激素在不同階段呈不同的變化趨勢，存在廣泛關(guān)聯(lián)，共同協(xié)同作用于生根過程。IAA、ZT和TZR是永福報春苣苔葉片插穗生根進(jìn)程中的關(guān)鍵植物激素，其可能通過促進(jìn)根原基的誘導(dǎo)和分化促進(jìn)扦插生根，此3種激素含量的變化可影響其余大部分激素的水平含量。研究首次通過高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，測定了永福報春苣苔葉片扦插過程中插穗內(nèi)源激素的動態(tài)變化，為進(jìn)一步通過外源激素調(diào)控和改進(jìn)永福報春苣苔扦插繁育技術(shù)提供理論參考。