馬媛媛，周暢，陳楓蕾，容瓊文

4-氨基吡啶對MPP+誘導(dǎo)帕金森病細(xì)胞具有神經(jīng)保護作用

馬媛媛1,2，周暢2,3，陳楓蕾2,3，容瓊文1,2

1.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，海南?？?570102；2.海南熱帶腦科學(xué)研究與轉(zhuǎn)化重點實驗室，海南?？?571199； 3.海南醫(yī)學(xué)院第一臨床學(xué)院，海南?？?571199

探究4-氨基吡啶（4-aminopyridine，4-AP）對1-甲基-4-苯基吡啶離子（1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+）誘導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞模型是否存在保護作用。利用不同濃度的MPP+孵育SH-SY5Y細(xì)胞，探究不同濃度MPP+對細(xì)胞活性的影響。單獨利用4-AP孵育細(xì)胞，探究4-AP是否影響細(xì)胞活性。利用4-AP預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞系24h后，隨后選取合適濃度的MPP+孵育細(xì)胞24h，CCK8測定細(xì)胞活性并進行統(tǒng)計學(xué)分析。隨著MPP+藥物濃度的升高，SH-SY5Y細(xì)胞活性下降。不同濃度的4-AP單獨孵育SH-SY5Y細(xì)胞系對細(xì)胞活性不產(chǎn)生影響。不同濃度的4-AP預(yù)處理細(xì)胞24h后，加入1mol/L的MPP+孵育24h，當(dāng)4-AP濃度在0.3～10mol/L時SH-SY5Y細(xì)胞的活性增加，在1mol/L時細(xì)胞活性增加最佳，為正常細(xì)胞的66%。一定濃度范圍內(nèi)的4-AP可減少MPP+對SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用，具有神經(jīng)保護作用。

細(xì)胞活性；4-氨基吡啶；帕金森??；神經(jīng)保護

帕金森病是一種慢性進行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，主要病理表現(xiàn)為中腦黑質(zhì)致密區(qū)多巴胺能神經(jīng)元丟失和路易小體形成，導(dǎo)致患者出現(xiàn)運動功能障礙和非運動功能障礙，可存在靜止性震顫、運動遲緩、便秘、睡眠障礙等臨床癥狀，帕金森病多發(fā)于60歲以上人群，且隨著年齡的增加帕金森病的發(fā)病率不斷升高[1]?，F(xiàn)有的治療手段僅能緩解癥狀，尚不能治愈帕金森病。帕金森病的發(fā)病機制至今尚未明確，其發(fā)病機制和治療方案一直是腦科學(xué)研究的重點。凍結(jié)步態(tài)是帕金森病患者臨床表現(xiàn)中常見且最具有致殘性的病理步態(tài)[2]。研究發(fā)現(xiàn)4-氨基吡啶（4-aminopyridine，4-AP）可改善帕金森病患者的凍結(jié)步態(tài)[3]。4-AP是一種非選擇性的電壓門控鉀通道（voltage-gated potassium channel，Kv通道）阻滯劑，目前被用于多發(fā)性硬化、脊髓小腦共濟失調(diào)等神經(jīng)系統(tǒng)疾病引起的運動癥狀的對癥治療[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)，4-AP除具有改善癥狀的作用外，還具有神經(jīng)保護作用[6-8]。本研究擬探討4-AP對1-甲基-4-苯基吡啶離子（1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+）誘導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞模型是否存在保護作用，探討Kv通道阻滯劑是否可能是治療帕金森病的潛在靶點，為Kv通道與帕金森病發(fā)病相關(guān)性提供線索。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞、主要耗材及儀器

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系（SH-SY5Y細(xì)胞系，購自武漢普諾賽生命科技有限公司）；MPP+（購自美國Sigma公司）、4-AP（購自美國Sigma公司）、CCK8試劑盒（購自中國abcam公司）、酶標(biāo)儀（購自美國Bio Tek）、細(xì)胞計數(shù)板（購自中國Axygen公司）、胎牛血清和DMEM/F12（購自中國Gibco公司）。

1.2 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代

液氮中取出細(xì)胞并進行細(xì)胞復(fù)蘇：快速放入37℃水浴鍋內(nèi)，晃動凍存管1min內(nèi)使凍存細(xì)胞的凍存液溶解，1000轉(zhuǎn)/min離心5min，酒精擦拭外壁后放入超凈臺。棄上清液，加入培養(yǎng)基制成懸浮液后，加入至T25瓶放置于37℃含5%CO2的恒溫孵育箱內(nèi)進行培養(yǎng)。24h后觀察細(xì)胞形態(tài)，1～2d更換培養(yǎng)基，根據(jù)細(xì)胞生長情況1周傳代2次，傳代到第10次開始進行實驗。

1.3 實驗分組

1.3.1 MPP+濃度篩選 為了篩選合適的MPP+制備帕金森病細(xì)胞模型，分別采用0.1、0.3、1mol/L的MPP+孵育SH-SY5Y細(xì)胞系24h后，根據(jù)測量的細(xì)胞活性比值，篩選出細(xì)胞活性下降約50%的MPP+濃度。

1.3.2 評估4-AP對SH-SY5Y細(xì)胞系的作用 以濃度的log對數(shù)值均分，設(shè)置不同的4-AP干預(yù)濃度梯度，即空白對照、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10mol/L，評估不同濃度的4-AP對細(xì)胞活性的影響作用。

1.3.3 MPP++4-AP共同干預(yù)對SH-SY5Y細(xì)胞系的作用 根據(jù)1.3.1實驗篩選出的MPP+濃度為1mol/L；根據(jù)1.3.2實驗結(jié)果4-AP對細(xì)胞活性無影響。綜合1.3.1和1.3.2實驗結(jié)果進行后續(xù)實驗。分為空白對照組、MPP+組、1mol/L MPP++0.01mol/L 4-AP組、1mol/L MPP++0.03mol/L 4-AP組、1mol/L MPP++ 0.1mol/L 4-AP組、1mol/L MPP++0.3mol/L 4-AP組、1mol/L MPP++1mol/L 4-AP組、1mol/L MPP++3mol/L 4-AP組、1mol/L MPP++10mol/L 4-AP組，探究4-AP對MPP+誘導(dǎo)帕金森病細(xì)胞模型的作用。

1.4 細(xì)胞活性檢測方法

CCK8細(xì)胞活性測定，嚴(yán)格按試劑盒操作方法及步驟說明進行：①提前準(zhǔn)備好96孔板，每孔加入100μl 5000個細(xì)胞。按照實驗需要進行培養(yǎng)，并分別給予不同濃度的藥物（MPP+、4-AP、MPP+和4-AP）干預(yù)24h。②干預(yù)24h后，每孔加入10μl CCK8溶液，設(shè)置空白對照組。③繼續(xù)孵育0.5～4 h。④450nm測定吸光度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同濃度MPP+誘導(dǎo)帕金森病細(xì)胞模型的細(xì)胞活性存在差異

與空白對照組相比，0.1、0.3、1mol/L三種不同濃度的MPP+干預(yù)SH-SY5Y細(xì)胞系24h后，三組細(xì)胞活性僅為正常細(xì)胞的83%、67%、49%，各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（=37.8，<0.05）。選取細(xì)胞活性下降至49%的1mol/L MPP+進行下一步實驗。

2.2 不同濃度4-AP孵育細(xì)胞24h不影響SH-SY5Y細(xì)胞系的細(xì)胞活性

利用不同濃度（0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10mol/L）4-AP孵育SH-SY5Y細(xì)胞系24h后，其細(xì)胞活性與正常對照組相比無差異（>0.05），提示4-AP不影響SH-SY5Y細(xì)胞系的細(xì)胞活性，對SH-SY5Y細(xì)胞系無毒副作用。

2.3 4-AP預(yù)處理可提高MPP+誘導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞模型的細(xì)胞活性

7種不同濃度（0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10mol/L）4-AP預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞系24h后，再利用1 mol/L的MPP+孵育細(xì)胞24h誘導(dǎo)帕金森病細(xì)胞模型。空白對照組、1mol/L MPP+組、1mol/L MPP++0.01mol/L 4-AP組、1mol/L MPP++0.03mol/L 4-AP組、1mol/L MPP++0.1mol/L 4-AP組、1mol/L MPP++0.3mol/L 4-AP組、1mol/L MPP++1mol/L 4-AP組、1mol/L MPP++3mol/L 4-AP組、1mol/L MPP++ 10mol/L 4-AP組的細(xì)胞活性分別為100%、51%、55%、57%、60%、63%、66%、64%、61%。單因素方差分析提示多組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（= 20.04，<0.001）。進一步的多重比較提示0.1、0.3、1、3、10mol/L 4-AP預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞系24h后其細(xì)胞活性比MPP+誘導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞模型的細(xì)胞活性顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（<0.05）。

3 討論

MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞是體外作為多巴胺能神經(jīng)元研究帕金森病的主流帕金森病細(xì)胞模型，因為SH-SY5Y細(xì)胞具有中腦多巴胺能神經(jīng)元的特點，如表達(dá)酪氨酸羥化酶、自發(fā)放電和具有多巴胺轉(zhuǎn)運體等特點[9]。在體內(nèi)1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）代謝成活性產(chǎn)物MPP+，通過多巴胺轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)運至中腦黑質(zhì)致密區(qū)的多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)，MPP+可特異性損害多巴胺能神經(jīng)元，引起多巴胺能神經(jīng)元線粒體功能障礙，導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元壞死從而誘發(fā)帕金森?。徊煌芯恐蠱PP+誘導(dǎo)的帕金森病模型細(xì)胞選用的濃度和孵育時間存在差異，常用濃度有0.05、0.1、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.8、1、2、3mol/L等，孵育時長從12～72h不等，研究表明不同濃度和不同時長的MPP+孵育細(xì)胞對細(xì)胞活性的影響存在差異，可根據(jù)實驗?zāi)康倪x取不同的模型制備方案[10-14]。本研究觀察0.1、0.3、1mol/L的MPP+孵育SH-SY5Y細(xì)胞系24h后SH-SY5Y細(xì)胞活性的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MPP+孵育的濃度越高細(xì)胞活性下降越明顯，提示MPP+濃度越高對細(xì)胞的毒性作用越強，根據(jù)細(xì)胞活性測定結(jié)果，1mol/L的MPP+孵育SH-SY5Y細(xì)胞系24h后，SH-SY5Y細(xì)胞活性下降至49%，故后續(xù)實驗選取1mol/L的MPP+孵育SH-SY5Y細(xì)胞系24h誘導(dǎo)帕金森病細(xì)胞模型。

研究發(fā)現(xiàn)在中腦黑質(zhì)中的多巴胺能神經(jīng)元表達(dá)各種Kv通道，如Kv4.3、Kv2.1和Kv1.2通道，其中Kv2.1通道與多巴胺轉(zhuǎn)運體結(jié)合，并介導(dǎo)發(fā)生凋亡的多巴胺能神經(jīng)元中的K+流出，參與多巴胺能神經(jīng)元的凋亡[15]。而K+外流是細(xì)胞凋亡所必須經(jīng)歷的過程[16]。提示Kv通道與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，可能參與帕金森病的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)Kv通道阻滯劑可減少多巴胺轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)6-羥基多巴氧化劑誘導(dǎo)的Kv通道依賴性的細(xì)胞死亡途徑[17]。Kv通道亦參與調(diào)節(jié)中腦多巴胺能神經(jīng)元的凋亡，減輕6-羥基多巴胺對多巴胺能神經(jīng)元的毒性作用，對中腦多巴胺能神經(jīng)元發(fā)揮保護作用[18]。研究發(fā)現(xiàn)抑制Kv4通道可增強黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的自發(fā)放電頻率，誘導(dǎo)從強直放電到突發(fā)放電的過渡，并促進紋狀體中多巴胺的釋放，且在帕金森病患者中發(fā)現(xiàn)Kv4通道相應(yīng)的mRNA表達(dá)增多；Kv7通道可調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性，增加多巴胺的釋放，并減輕運動癥狀[19]。以上研究均表明Kv通道參與多巴胺能神經(jīng)元的凋亡過程，調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性和多巴胺的釋放，與帕金森病存在相關(guān)性。

為驗證Kv通道是否參與帕金森病的發(fā)生發(fā)展，筆者利用一種非選擇性的Kv通道阻滯劑4-AP來干預(yù)SH-SY5Y細(xì)胞系，驗證其對帕金森病模型細(xì)胞的作用。研究表明4-AP可改善神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的運動功能障礙，減少肌肉萎縮，增加肌肉纖維直徑和收縮力[20-21]。在自身免疫性腦脊髓炎模型小鼠中，預(yù)防性和治療性應(yīng)用4-AP治療可改善小鼠足印和旋轉(zhuǎn)棒運動的活動性[22]。4-AP除具有改善運動癥狀的作用外，還具有神經(jīng)保護特征[6]。除外多系統(tǒng)萎縮，4-AP也可改善脊髓小腦共濟失調(diào)引起的步態(tài)異常[23]。一定濃度的4-AP可改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病的癥狀。除了治療作用，4-AP對人和動物亦存在毒性，在鳥類和哺乳動物的高劑量實驗中，4-AP的毒性反應(yīng)在給藥后15min出現(xiàn)，包括癲癇發(fā)作、震顫、共濟失調(diào)、呼吸困難、瞳孔放大、流涎和虛脫，甚至死亡。在人類中同樣存在4-AP過量的毒性反應(yīng)，包括虛弱、惡心、大量出汗、口渴、呼吸困難和嘔吐，失去知覺并表現(xiàn)出強直-陣攣性癲癇發(fā)作、高血壓、代謝性酸中毒和血清谷草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶濃度升高[24]。為了能更好地研究4-AP對帕金森病細(xì)胞活性的影響，筆者利用不同濃度的4-AP孵育SH-SY5Y細(xì)胞24h，觀察藥物單獨孵育對細(xì)胞活性的影響，結(jié)果提示在10mol/L濃度內(nèi)的4-AP孵育細(xì)胞24h是安全的，可用于下一步的實驗研究。

本研究結(jié)果表明使用4-AP預(yù)處理細(xì)胞24h后，再利用MPP+制備帕金森病細(xì)胞模型可減少MPP+毒性，提高其誘導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞模型的細(xì)胞活性。本研究初步探索4-AP對帕金森病細(xì)胞模型的作用，證明4-AP在帕金森病細(xì)胞模型中發(fā)揮一定的保護作用，且這種保護作用存在濃度依賴性。當(dāng)使用4-AP預(yù)處理濃度范圍在0.3～10mol/L時，SH-SY5Y細(xì)胞系的細(xì)胞活性比MPP+組的細(xì)胞活性明顯升高；當(dāng)4-AP預(yù)處理濃度為0.3mol/L時其細(xì)胞活性升高存在差異；當(dāng)4-AP干預(yù)濃度為1mol/L時，其細(xì)胞活性為正常細(xì)胞的66%，活性升高最為明顯；當(dāng)4-AP濃度為3、10mol/L時其細(xì)胞活性為正常細(xì)胞的64%、61%，比MPP+組的細(xì)胞活性明顯增高，但比1mol/L的4-AP預(yù)處理組的細(xì)胞活性稍低。提示對于MPP+誘導(dǎo)的帕金森病模型細(xì)胞4-AP的最佳干預(yù)濃度為1mol/L，同時4-AP預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞系存在濃度相關(guān)性，當(dāng)超過1mol/L時，其細(xì)胞活性增加的比值下降，這提示4-AP過量可能存在某種潛在的毒副作用。當(dāng)4-AP濃度超過10mol/L時是否能繼續(xù)發(fā)揮神經(jīng)保護作用，減少MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞活性的降低，本研究中并未涉及，需要后續(xù)的實驗來繼續(xù)補充研究。同時本文并未解釋4-AP預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞系是通過何種機制來減少MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞活性的降低，這也是后續(xù)研究的重點，希望通過本研究為未來治療帕金森病提供新的治療靶點。

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Neuroprotective effect of 4-aminopyridine in 1-methyl 4-phenylpyridinium induced Parkinson’s disease cells model

MA Yuanyuan, ZHOU Chang, CHEN Fenglei, RONG Qiongwen

1.Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Hainan Medical University, Haikou 570102, Hainan, China; 2.Key Laboratory of Brain Science Research & Transformation in Tropical Environment of Hainan Province, Haikou 571199, Hainan, China; 3.The First Clinical Medical College, Hainan Medical University, Haikou, 571199, Hainan, China

To explore the protective effect of 4-aminopyridine (4-AP) on 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+) induced Parkinson’s disease cell mode.SH-SY5Y cells were incubated with different concentrations of MPP+to explore the effect of different concentrations of MPP+on cell viability. SH-SY5Y cells were incubated with different concentrations of 4-AP to explore the effect of different concentrations of drugs on cells. SH-SY5Y cells were pretreated with 4-AP for 24h, then incubated with MPP+at an appropriate concentration for 24h, and cell viability was measured by CCK8 assay.With the increase of MPP+concentration, the activity of SH-SY5Y cells decreased. Different concentrations of 4-AP alone incubating SH-SY5Y cell line had no effect on cell viability. After the cells were pretreated with different concentrations of 4-AP for 24 h, and then incubated with 1 mol/L MPP+for 24 h, the activity of SH-SY5Y cells increased when the concentration of 4-AP was 0.3-10mol/L, and the best increase was 66% of the control cells when the concentration of 4-AP was 1mol/L.In a certain concentration range, 4-AP can reduce the toxic effect of MPP+on SH-SY5Y cells and has neuroprotective effect.

Cellular activity; 4-Aminopyridine; Parkinson’s disease; Neuroprotection

R742.5

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.01.008

海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院青年培育基金項目（HYYFYPY202107）；海南省高等學(xué)?？茖W(xué)研究項目（Hnky2020-39）；海南省臨床醫(yī)學(xué)中心建設(shè)項目資助

容瓊文，電子信箱：13907580113@163.com

（2022–07–13）

（2022–12–07）