凡龍?jiān)?彭 薇,王美玲,趙雅麗,肖 寒,王萬(wàn)祥,吳 強(qiáng),,王 弦,

甲狀腺癌是甲狀腺最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤,甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinomas, PTC)是原發(fā)性甲狀腺癌中最常見(jiàn)的類型[1]。雖然PTC預(yù)后良好,但仍有20%～30%的PTC患者出現(xiàn)復(fù)發(fā),約7%患者死亡[2]。有時(shí)甲狀腺乳頭狀增生(papillary thyroid hyperplasia, PTH)會(huì)表現(xiàn)出與PTC類似的組織學(xué)特征,包括發(fā)育良好的具有纖維血管軸心的乳頭狀結(jié)構(gòu)、核擁擠和核分裂象,給PTC的診斷和鑒別診斷帶來(lái)困難[3]。既往研究和臨床診斷實(shí)踐發(fā)現(xiàn),PTC診斷常用的免疫組化標(biāo)志物對(duì)PTC的診斷準(zhǔn)確性尚未達(dá)成統(tǒng)一的共識(shí)[4]。因此,有必要探索新的免疫組化標(biāo)志物或組合以提高PTC的診斷準(zhǔn)確率。

酸性富含半胱氨酸的分泌蛋白相關(guān)的模塊化鈣結(jié)合蛋白-2(secreted modular calcium binding protein-2, SMOC2)屬于SPARC家族,在人體多種實(shí)體腫瘤中的作用尚有分歧[5]。本研究在生物信息學(xué)的基礎(chǔ)上,采用免疫組化法檢測(cè)SMOC2在PTC組織中的表達(dá)情況,分析其與PTC臨床病理特征的關(guān)系及與CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E聯(lián)合輔助診斷的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料選取2021年10月～2022年7月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科具有完整臨床病理資料的75例PTC和45例PTH手術(shù)切除石蠟標(biāo)本。排除手術(shù)前接受過(guò)化療、放療或免疫抑制劑治療以及合并其他惡性腫瘤的患者。所有病例均經(jīng)10%中性福爾馬林固定,石蠟包埋,4 μm厚連續(xù)切片,分別行HE和免疫組化染色。75例PTC中女性50例,男性25例,年齡19～74歲,中位年齡40歲。39例有局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,36例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。AJCC第八版甲狀腺腫瘤TNM分期:Ⅰ期28例,Ⅱ期44例,Ⅲ期3例。

1.2 試劑SMOC2兔多克隆抗體(GTX85703)購(gòu)自GeneTex公司;CK19鼠單克隆抗體(UMAB2,即用型)、Galectin-3鼠單克隆抗體(UMAB157,即用型)、MC鼠單克隆抗體(HBME-1,即用型)、DAB顯色試劑盒(PV-6000D)均購(gòu)于北京中杉金橋公司;BRAF V600E(VE1)抗體、OptiView DAB二抗試劑盒及OptiView AMP擴(kuò)增試劑盒均購(gòu)于羅氏公司。

1.3 方法

1.3.1生物信息學(xué)分析 從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Expression Omnibus, GEO)中選取數(shù)據(jù)集GSE3678(包括7例PTC和7例良性甲狀腺組織)和GSE33630(包括49例PTC和46例良性甲狀腺組織),分析SMOC2 mRNA在PTC和良性甲狀腺組織中的表達(dá)量差異;從癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中提取505例甲狀腺癌組織和59例良性甲狀腺組織中SMOC2 mRNA的表達(dá)量,分析SMOC2 mRNA在兩者中表達(dá)量差異。

1.3.2免疫組化 SMOC2、CK19、Galectin-3、MC采用免疫組化EnVision兩步法染色,主要步驟:切片脫蠟水化,檸檬酸鈉溶液熱修復(fù),過(guò)氧化物酶阻斷劑室溫孵育10 min,滴加一抗4 ℃孵育過(guò)夜,二抗室溫孵育20 min,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,脫水、透明后光鏡下觀察。BRAF V600E通過(guò)BenchMark Ultra全自動(dòng)免疫組化儀器進(jìn)行染色,主要步驟:切片75 ℃預(yù)熱4 min脫蠟水化,Ultra CC1堿性修復(fù)液100 ℃修復(fù)72 min,過(guò)氧化物酶抑制劑OV PEROX IHBTR孵育4 min,BRAF V600E一抗37 ℃孵育32 min;OV HQ UNIV LINKR孵育8 min;OV HRP MULTIMER孵育8 min;OV AMP H2O2和OV AMPLIFIER共同孵育4 min;OV AMP MULTIMER孵育4 min;OV H2O2和OV DAB共同孵育8 min;OV COPPER 孵育4 min;蘇木精復(fù)染12 min,返藍(lán)液孵育4 min,脫水、透明后光鏡下觀察。

1.4 結(jié)果判讀SMOC2以上皮細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或褐色顆粒為陽(yáng)性染色,CK19以上皮細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或褐色顆粒為陽(yáng)性染色,Galectin-3以上皮細(xì)胞胞質(zhì)和胞核中出現(xiàn)黃色或褐色顆粒為陽(yáng)性染色,MC以上皮細(xì)胞腔緣頂端細(xì)胞膜出現(xiàn)黃色或褐色顆粒為陽(yáng)性染色[6]。BRAF V600E以上皮細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或褐色顆粒為陽(yáng)性染色[7]。SMOC2評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):按染色強(qiáng)度評(píng)分:陰性為0分,弱陽(yáng)性為1分,中等強(qiáng)度陽(yáng)性為2分,強(qiáng)陽(yáng)性為3分。評(píng)分≥1分判為陽(yáng)性[8]。CK19、Galectin-3、MC著色細(xì)胞占比>10%定義為陽(yáng)性。BRAF V600E在細(xì)胞質(zhì)中著色即為陽(yáng)性,無(wú)著色為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用GraphPad Prism 6.0.1和SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)分析組間蛋白表達(dá)差異及與臨床病理特征的關(guān)系,采用傳統(tǒng)診斷試驗(yàn)公式計(jì)算敏感度、特異性和診斷準(zhǔn)確性,受試者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲線分析診斷預(yù)測(cè)價(jià)值,采用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)分析相關(guān)性,結(jié)果均以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析SMOC2在PTC和良性甲狀腺組織中的mRNA表達(dá)差異及診斷價(jià)值提取GEO數(shù)據(jù)庫(kù)GSE3678和GSE33630兩個(gè)數(shù)據(jù)集及TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中甲狀腺癌和良性甲狀腺組織SMOC2 mRNA的表達(dá)量,對(duì)兩者表達(dá)量進(jìn)行差異性分析及ROC曲線分析,結(jié)果顯示:SMOC2 mRNA在PTC中的表達(dá)量顯著低于良性甲狀腺組織(P<0.05,圖1A～C),ROC曲線下面積(area under the curve, AUC)為0.910(P<0.001,圖1D)。

圖1 A.GEO數(shù)據(jù)庫(kù)GSE3678數(shù)據(jù)集中甲狀腺乳頭狀癌和良性甲狀腺組織中SMOC2 mRNA的表達(dá);B.GSE33630數(shù)據(jù)集中甲狀腺乳頭狀癌和良性甲狀腺組織中SMOC2 mRNA的表達(dá);C.TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中甲狀腺癌和良性甲狀腺組織中SMOC2 mRNA的表達(dá);D.GEO數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)SMOC2對(duì)甲狀腺乳頭狀癌診斷價(jià)值的ROC曲線

2.2 PTC和PTH中SMOC2蛋白表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系在PTH中,SMOC2蛋白表達(dá)于乳頭狀增生的上皮細(xì)胞中,定位于靠近腔緣頂端的細(xì)胞質(zhì),具有極性,呈非連續(xù)的線狀顆粒性,陽(yáng)性率為91.1%(41/45);在PTC中,SMOC2在癌組織中呈陰性或弱陽(yáng)性彌漫分布,陽(yáng)性染色滿布于癌細(xì)胞胞質(zhì),陽(yáng)性率為10.7%(8/75),明顯低于PTH(P<0.001,圖2)。SMOC2表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),與患者性別、年齡、腫瘤最大徑、是否甲狀腺外浸潤(rùn)、TNM分期無(wú)相關(guān)性(P>0.05),且與BRAF V600E表達(dá)無(wú)相關(guān)性(rs=0.142,P>0.05,表1)。

表1 甲狀腺乳頭狀癌中SMOC2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 SMOC2、CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E對(duì)PTC的診斷價(jià)值及比較SMOC2對(duì)PTC診斷的敏感度為91.1%,特異性為89.3%,診斷準(zhǔn)確性為90.0%,陽(yáng)性似然比(positive likelihood ratio, PLR)為8.514,陰性似然比(negative likelihood ratio, NLR)為0.099。ROC曲線分析結(jié)果顯示AUC值為0.898(P<0.001,圖3)。在PTC組織中,CK19蛋白定位于細(xì)胞質(zhì),呈彌漫分布,診斷的敏感度為100.0%,特異性為84.4%;Galectin-3蛋白定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì),呈彌漫分布,診斷的敏感度為92.0%,特異性為80.0%;MC蛋白定位于腔緣頂端細(xì)胞膜,呈完整連續(xù)著色,診斷的敏感度為94.7%,特異性為64.4%;BRAF V600E蛋白定位于細(xì)胞質(zhì),呈彌漫分布,診斷的敏感度為94.7%,特異性為88.9%。在PTH組織中,CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E均呈陰性(表2,圖4)。單獨(dú)診斷時(shí),CK19的敏感度最高,但其特異性差;SMOC2診斷的敏感度雖然低于CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E,但特異性最高(89.3%)。

圖3 SMOC2對(duì)甲狀腺乳頭狀癌診斷價(jià)值的ROC曲線

圖4 PTC和PTH的HE染色及CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E免疫組化染色,EnVision兩步法:PTC.甲狀腺乳頭狀癌;PTH.甲狀腺乳頭狀增生

2.4 SMOC2聯(lián)合CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E在PTC和PTH鑒別診斷中的價(jià)值在鑒別PTC和PTH時(shí),SMOC2、CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E的診斷價(jià)值以敏感度和特異性的形式表現(xiàn)。SMOC2、CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E相互組合進(jìn)行PTC聯(lián)合輔助診斷(圖5),SMOC2、CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E五者聯(lián)合輔助診斷的AUC值為1.000(P<0.001),在一定程度優(yōu)于其他標(biāo)志物組合,當(dāng)Cut-off值為0.500時(shí),診斷的敏感度和特異性均高達(dá)100.0%。

圖5 SMOC2、CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E聯(lián)合輔助診斷的ROC曲線

3 討論

SMOC2作為一種分泌型基質(zhì)細(xì)胞蛋白,在許多組織中廣泛表達(dá),參與多種細(xì)胞功能,包括細(xì)胞黏附和遷移[9]、血管生成[10]、纖維增生[11]和細(xì)胞增殖[12]等,在多種實(shí)體腫瘤中起促癌或抑癌基因的作用。既往研究顯示,其生物學(xué)功能主要多與促癌特性有關(guān),但在結(jié)直腸癌、胰腺癌、膽囊癌和晚期乳腺癌中起抑癌基因的作用[13],而在PTC中SMOC2蛋白表達(dá)情況及作用機(jī)制尚不明確。

本研究采用生物信息技術(shù)學(xué)在數(shù)據(jù)庫(kù)中提取SMOC2 mRNA的表達(dá)量,分析其在PTC和良性甲狀腺組織中的差異量表達(dá),并在生信分析基礎(chǔ)上對(duì)PTC和PTH石蠟切片進(jìn)行SMOC2免疫組化檢測(cè)。生物信息技術(shù)學(xué)結(jié)果顯示SMOC2在PTC中的表達(dá)較良性甲狀腺組織顯著降低;免疫組化結(jié)果顯示SMOC2在PTC組織中呈陰性或弱陽(yáng)性彌漫著色,在PTH組織增生的乳頭狀結(jié)構(gòu)中可見(jiàn)明顯的陽(yáng)性染色,呈線狀顆粒性表達(dá),其分布具有極性?？梢?jiàn),SMOC2在PTC組織中的陽(yáng)性率降低和在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的極性消失可在一定程度上提示其惡性特征,對(duì)PTC診斷和鑒別診斷具有重要的輔助作用。

Jang等[14]的研究顯示,SMOC2在正常結(jié)腸黏膜基底隱窩中呈陽(yáng)性,在結(jié)腸癌組織中呈陰性或弱陽(yáng)性彌漫表達(dá),定位于細(xì)胞質(zhì),陽(yáng)性率明顯下降,在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例中SMOC2表達(dá)進(jìn)一步下降,且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。本組SMOC2在PTC中的表達(dá)情況在一定程度上與SMOC2在結(jié)腸癌中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系一致,但其是否在PTC中發(fā)揮抑癌基因的作用有待進(jìn)一步研究。

分析SMOC2與PTC臨床病理特征關(guān)系發(fā)現(xiàn),SOMC2表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān),與患者性別、年齡、腫瘤最大徑、是否甲狀腺外浸潤(rùn)、TNM分期無(wú)相關(guān)性。既往研究[8]顯示,在38%的PTC中觀察到SMOC2完全缺失與BRAF突變?nèi)笔嚓P(guān),本組PTC中SMOC2表達(dá)與BRAF V600E突變相關(guān)性分析并未發(fā)現(xiàn)兩者間的相關(guān)性,有待擴(kuò)大樣本進(jìn)一步觀察。本組67例SMOC2表達(dá)丟失病例中,38例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,29例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,提示SMOC2丟失可能與PTC發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。

根據(jù)Xin等[15]提出的標(biāo)準(zhǔn),分子標(biāo)志物的PLR>10或NLR<0.1可視為獨(dú)立診斷指標(biāo),SMOC2的NLR<0.1,由此提示SMOC2可作為單獨(dú)診斷PTC的標(biāo)志物,但其缺乏較高敏感度和特異性,需與其他標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E免疫組化結(jié)果與Asghari等[16]和Parker等[17]的研究結(jié)果一致。以上標(biāo)志物相互組合,以SMOC2、CK19、Galectin-3、MC和BRAF V600E五者聯(lián)合輔助診斷PTC時(shí),其AUC值最高,輔助診斷效能優(yōu)于其余標(biāo)志物組合,成為新的高敏感度和特異性的組合。

綜上所述,SMOC2陽(yáng)性率下降和在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的極性消失可作為PTC診斷和鑒別診斷的重要標(biāo)志物,與CK19、Galectin-3、MC、BRAF V600E五者聯(lián)合檢測(cè)優(yōu)于其他標(biāo)志物組合,可在一定程度上提高對(duì)PTC診斷的敏感度和特異性。