王雪寒,鄭燕軍,王小雙,劉 琰,蔡永萍

甲狀腺髓樣癌(medullary thyroid carcinoma, MTC)是一種起源于甲狀腺濾泡旁細胞(C細胞)的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤,占甲狀腺惡性腫瘤的1%～2%,而病死率在甲狀腺癌中超過14%[1-2]。MTC臨床表現(xiàn)隱匿,易發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,晚期患者手術(shù)及放、化療效果有限,預后較差[3],因此,早發(fā)現(xiàn)、早確診可有效降低患者病死率?，F(xiàn)階段,MTC的診斷主要根據(jù)組織學及免疫組化標記,如Syn、CgA、降鈣素(calcitonin, CT)和CEA[4],但這些指標的靈敏度和特異度不夠理想。近期研究表明,INSM1在多種神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中有較高的診斷價值,而在MTC中的報道較少。本文旨在通過免疫組化檢測INSM1在MTC和與其組織學具有重疊、易混淆的甲狀腺腫瘤中的表達情況,并與傳統(tǒng)MTC標志物進行比較,以明確INSM1在MTC病理診斷中的價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2019年1月～2022年6月安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院和安徽醫(yī)科大學附屬宿州醫(yī)院術(shù)后病理確診的甲狀腺腫瘤共計53例,包括28例MTC(實驗組)和25例形態(tài)上與MTC具有重疊的其他甲狀腺腫瘤(包括透明變梁狀腫瘤6例、低分化癌16例、梭形細胞乳頭狀癌2例和甲狀腺內(nèi)副神經(jīng)節(jié)瘤1例)(對照組)。28例MTC患者年齡42～69歲,中位年齡56歲,其中男性11例,女性17例;25例對照組患者年齡35～81歲,中位年齡59歲,其中男性9例,女性16例。所有標本均行HE染色,并由2位高年資病理醫(yī)師經(jīng)HE切片及免疫組化染色明確診斷。

1.2 主要試劑鼠抗人單克隆抗體INSM1(sc-271408)購自Santa Cruz公司;Syn、CgA、CT和CEA抗體購自北京中杉金橋公司;免疫組化染色EnVision兩步法試劑盒購自福州邁新公司。

1.3 免疫組化免疫組化染色采用EnVision兩步法,INSM1抗體稀釋濃度為1 ∶200,Syn、CgA、CT和CEA抗體為即用型抗體。操作步驟按照試劑盒說明書進行。用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷INSM1陽性定位于細胞核,Syn、CgA、CT和CEA陽性定位于細胞質(zhì)。采用半定量積分法對陽性細胞所占百分率和腫瘤細胞染色強度進行判斷。(1)染色細胞百分率:選擇著色熱點區(qū)域,在光鏡高倍(×400)下隨機選取10個視野,計算陽性細胞率(陽性瘤細胞數(shù)/總瘤細胞數(shù))×100%,無陽性細胞為0分,陽性細胞數(shù)占1%～5%為1分,6%～10%為2分,11%～50%為3分,≥51%為4分。(2)染色強度:無陽性著色為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。將兩項得分相乘作為最終評分:0～2分為陰性,3～12分為陽性。

1.5 統(tǒng)計學分析采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析,使用χ2檢驗及Fisher確切概率法進行統(tǒng)計分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MTC和對照甲狀腺癌中INSM1的表達在28例MTC中,絕大部分形態(tài)呈典型的梁狀、巢團狀或島狀排列(圖1A),瘤細胞圓形、卵圓形,細胞核大小較一致,胞質(zhì)淡染,常有淀粉樣物沉積,少數(shù)病例呈梭形細胞型、小細胞型、副神經(jīng)節(jié)瘤樣等亞型。INSM1陽性定位于細胞核,陽性率為96.4%(27/28),即靈敏度為96.4%,其中25例(92.6%,25/27)陽性細胞比例≥51%,染色強度呈中等至強陽性(圖1B),腫瘤內(nèi)其他細胞及物質(zhì)(包括殘存的濾泡膠質(zhì)、淀粉樣物及壞死組織等)為陰性,背景干凈,易于判讀。在25例對照組中,INSM1多呈陰性,如透明變梁狀腫瘤(圖1C、D)、甲狀腺低分化癌(圖1E、F)、梭形細胞乳頭狀癌(圖1G、H),僅在1例副神經(jīng)節(jié)瘤中陽性(圖1I、J),陽性率為4.0%(1/25),即特異度為96.0%。INSM1在實驗組(96.4%)中的陽性率顯著高于對照組(4.0%)(P<0.05)。

2.2 INSM1與傳統(tǒng)MTC標志物在MTC中的靈敏度比較在28例MTC中,INSM1染色定位于細胞核,絕大部分病例陽性細胞比例≥51%,染色強度為中等至強陽性,背景其他細胞及物質(zhì)陰性,易于判讀(圖2A);Syn(圖2B)、CgA(圖2C)、CT(圖2D)和CEA(圖2E)定位于細胞質(zhì),染色模式從彌漫到局灶,強弱程度不盡相同,甚至呈弱斑片狀或小的點狀胞質(zhì)內(nèi)著色,同時部分病例胞質(zhì)著色可與背景淀粉樣物、腫瘤性壞死及殘存的濾泡膠質(zhì)混雜,視化及量化存在一定的主觀性,難以準確判讀。INSM1、Syn、CgA、CT和CEA診斷MTC的靈敏度分別為96.4%、89.3%、71.4%、78.6%和96.4%。同時在6例CT陰性MTC中,INSM1均呈陽性,靈敏度較高。INSM1在MTC中的靈敏度與CEA一致,優(yōu)于Syn和CT,與CgA相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,表1)。

圖2 甲狀腺髓樣癌中INSM1、Syn、CgA、CT和CEA的表達,EnVison兩步法:A.INSM1染色定位于細胞核,呈強陽性且背景干凈;B.Syn染色定位于細胞質(zhì),局部著色且強弱不等,部分區(qū)域不著色;C.CgA染色定位于細胞質(zhì),著色區(qū)域為點狀胞質(zhì)內(nèi)著色;D.CT染色定位于細胞質(zhì),局部著色,大部分區(qū)域不著色;E.CEA定位于細胞質(zhì),背景染色較重,腫瘤內(nèi)淀粉樣物及殘存濾泡膠質(zhì)均著色

表1 INSM1和傳統(tǒng)標志物在甲狀腺髓樣癌中的靈敏度比較

2.3 INSM1與傳統(tǒng)MTC標志物在對照組中的特異度比較在25例對照組中,INSM1僅在1例副神經(jīng)節(jié)瘤中呈強陽性,顯示了較高的特異度;而Syn、CgA、CT和CEA在多例低分化癌中表達,其中CEA陽性高達7例。INSM1、Syn、CgA、CT和CEA的特異度分別為96.0%、80.0%、84.0%、88.0%和72.0%。INSM1在對照組中的特異度優(yōu)于Syn、CgA和CT,與CEA相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,表2)。

表2 INSM1與傳統(tǒng)甲狀腺髓樣癌標志物在對照組中的特異度比較

3 討論

MTC是一種罕見的甲狀腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤,惡性程度高,易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移及局部擴散。臨床很多MTC患者初次就診時已經(jīng)進展至局部晚期,傳統(tǒng)的手術(shù)及放、化療效果十分有限,病死率較高,早期及時、準確的診斷和治療可有效延長患者生存期[3,5]。MTC組織學亞型繁多,包括乳頭狀型、梭形細胞型、小細胞型、透明細胞型、巨細胞型、嗜酸細胞型和副神經(jīng)節(jié)瘤樣等十余種,與多種甲狀腺腫瘤形態(tài)均有重疊,盡管MTC可伴有特異的淀粉樣物,但大部分病例很難發(fā)現(xiàn),僅通過組織學無法診斷。臨床工作中必須通過免疫組化輔助,常用的MTC標志物有CT、CEA、Syn和CgA等[4],現(xiàn)有標志物效果存在一定局限性,特異度和敏感度均不高,常需聯(lián)合使用,加重了病理工作負荷和患者經(jīng)濟負擔。此外,少數(shù)病例CEA、CT雙陰性[6-7],又增加了MTC的診斷難度。因此,我們需要探索MTC中更加敏感、特異的診斷標志物。

近年研究發(fā)現(xiàn),INSM1是一種具有C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子,最初是從胰島素瘤減數(shù)雜交cDNA文庫中分離出來的,人類和嚙齒動物的表達譜顯示,INSM1在胎兒大腦和發(fā)育中的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)中豐富,在成人組織中沉默、顯著減少或限制表達[8-9]。隨后的研究表明,INSM1在神經(jīng)內(nèi)分泌分化過程中作為重要的調(diào)節(jié)因子對神經(jīng)內(nèi)分泌器官的發(fā)育起重要作用,在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中表達非常特異,而在其他非神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中幾乎不表達[10]。近期研究發(fā)現(xiàn),INSM1在多種器官神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中高表達,包括肺、胰腺、胃腸道、頭頸部、子宮頸及泌尿生殖系統(tǒng)等[11-18]。另有研究報道,Rooper等[15]發(fā)現(xiàn)INSM1在頭頸部神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中具有高度的靈敏度(99%)和特異度(97.6%),優(yōu)于傳統(tǒng)的神經(jīng)內(nèi)分泌標志物,并因此用作神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤診斷標志物,但INSM1在MTC中的研究非常有限。

本實驗結(jié)果顯示,INSM1在MTC中定位于細胞核,其中25例(92.6%,25/27)陽性細胞比例均≥51%,染色強度呈中等至強陽性,而傳統(tǒng)的MTC標志物(Syn、CgA、CT和CEA)染色定位于細胞質(zhì),模式從彌漫到局灶,強弱程度不盡相同,甚至呈現(xiàn)弱斑片狀或小的點狀胞質(zhì)內(nèi)著色,有時難以觀察,同時部分病例胞質(zhì)的著色可與背景中淀粉樣物、腫瘤性壞死及殘存的濾泡膠質(zhì)混雜,導致免疫反應評估不準確。相比胞質(zhì)染色模式,核染色更清晰、穩(wěn)定,同時背景干凈,INSM1的染色模式比傳統(tǒng)的MTC標志物更易于視化、量化和判讀。WHO(2022版)甲狀腺腫瘤新分類首次對MTC進行分級,依據(jù)病理性核分裂象、腫瘤壞死和Ki-67增殖指數(shù)分為高、低級別,將<5個有絲分裂/2 mm2且無壞死和Ki-67<5%歸入低級別MTC,將至少具有以下3個特征之一:≥5個有絲分裂/2 mm2、壞死或Ki-67≥5%歸入高級別MTC[19]。按照最新分級標準,本組28例MTC中,5例為高級別,23例為低級別,INSM1僅在1例低級別病例中呈陰性,其余病例均陽性,由此推測INSM1在MTC中的表達與腫瘤分級無確切相關(guān)性,這可能與本組樣本數(shù)偏少有關(guān)。

本實驗結(jié)果顯示,在28例MTC中,與傳統(tǒng)MTC標志物相比,INSM1僅在1例MTC中呈陰性(<5%腫瘤細胞核弱陽性)(該例MTC中CEA陽性,Syn、CT局灶陽性,臨床血清CT和CEA均異常升高,術(shù)后降至正常,證實為髓樣癌),特異度優(yōu)于Syn和CT,與CgA相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),且在6例CT陰性MTC中INSM1均呈陽性,表現(xiàn)出較高的靈敏度。INSM1在25例對照組中,絕大部分腫瘤INSM1陰性,僅在1例副神經(jīng)節(jié)瘤中呈陽性,而Syn、CgA、CT及CEA在多例低分化癌中陽性,其中CEA高達7例,表明與傳統(tǒng)MTC標志物相比,INSM1具有較高的特異度。Seok等[4]也發(fā)現(xiàn),INSM1在MTC中的靈敏度和特異度均較高,顯著優(yōu)于CgA,這與本實驗結(jié)果一致。

值得注意的是,INSM1在MTC及副神經(jīng)節(jié)瘤中均陽性,易出現(xiàn)診斷陷阱,但副神經(jīng)節(jié)瘤內(nèi)瘤細胞周圍支持細胞特異性表達S-100和SOX-10,可與MTC鑒別。其他需要鑒別的腫瘤:(1)透明變梁狀腫瘤:與MTC均可呈小梁狀或“器官樣”生長伴間質(zhì)透明樣變性,但透明變梁狀腫瘤與正常組織間境界清楚,細胞呈短梭形或多角形,并垂直于小梁長軸排列,細胞核圓形、卵圓形,可見核內(nèi)包涵體及核仁。免疫組化標記TG、TTF-1和Galectin-3陽性,Ki-67呈特征性的膜陽性,玻璃樣透明變區(qū)PAS特殊染色呈陽性[20]。(2)甲狀腺低分化癌:又稱島狀癌,瘤細胞呈島狀、梁狀及實性排列,可伴壞死,常含其他甲狀腺癌(乳頭狀癌或濾泡癌等)成分,間質(zhì)無淀粉樣物[21]。免疫組化標記TTF-1、TG及PAX8等陽性,CT陰性。(3)梭形細胞乳頭狀癌:細胞呈梭形,形態(tài)溫和,形態(tài)與MTC梭形細胞亞型極其相似,但其內(nèi)可夾雜少量乳頭狀癌成分,無淀粉樣物沉積,免疫組化表達CK、TTF-1等,不表達CT、CEA及神經(jīng)內(nèi)分泌標志物。

綜上,INSM1在MTC診斷中的靈敏度和特異度較高,且為核陽性,易于判讀,優(yōu)于傳統(tǒng)標志物,是一種優(yōu)秀的新型神經(jīng)內(nèi)分泌標志物,值得推廣、應用。