任文浩,黃小征,周立新,白艷花

WHO(2017版)甲狀腺腫瘤分類中,甲狀腺原發(fā)鱗狀細胞癌被命名為僅顯示鱗狀分化的癌,不可伴有其他腺癌成分[1]。WHO(2022版)分類中,甲狀腺原發(fā)鱗狀細胞癌被劃分為甲狀腺未分化癌(鱗狀細胞癌亞型),可以并存分化型甲狀腺癌及低分化甲狀腺癌成分[2-4]。鱗狀細胞癌診斷標(biāo)準(zhǔn)的改變,導(dǎo)致后續(xù)臨床治療方案的選擇發(fā)生了巨大變化。文獻報道,15%～45%的甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)中可以出現(xiàn)鱗狀細胞成分[5-6],鱗狀細胞成分是否診斷為未分化癌(鱗狀細胞癌亞型)對后續(xù)腫瘤的治療和預(yù)后判斷至關(guān)重要。目前,針對PTC中鱗狀細胞成分是診斷為鱗狀分化還是未分化癌,尚無明確的診斷標(biāo)準(zhǔn)。本研究擬探索PTC中鱗狀細胞成分的組織學(xué)特點和免疫表型,建立鱗狀細胞成分的分類診斷標(biāo)準(zhǔn),將鱗狀細胞成分分類為鱗狀分化及未分化癌,研究兩分類對預(yù)后的影響,并分析BRAF V600E和PD-L1(22C3)在鱗狀細胞成分中的表達情況,為后續(xù)臨床治療提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2015～2023年北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除的PTC伴鱗狀分化或PTC伴未分化癌,鱗狀細胞癌亞型病例。納入標(biāo)準(zhǔn):PTC中含有鱗狀細胞成分,無論鱗狀細胞成分含量多少及異型程度。排除標(biāo)準(zhǔn)包括:有其他惡性腫瘤病史;腫瘤中存在除PTC及鱗狀細胞成分的其他腫瘤成分。所有病例均經(jīng)兩位高年資病理醫(yī)師復(fù)閱切片。合計納入23例,其中初次手術(shù)20例,復(fù)發(fā)病例二次或多次手術(shù)3例。女性15例,男性8例?；颊吣挲g19～75歲,中位年齡38歲。腫瘤最大徑0.6～8.0 cm,中位最大徑1.9 cm。隨訪時間6.0～98.5個月,中位隨訪時間28.8個月,3例復(fù)發(fā),2例因癌死亡。

1.2 免疫組化p40(GR006,基因科技公司)、CK5/6(OTI1F8,北京中杉金橋公司)、Ki-67(MIB1,北京中杉金橋公司)、BRAF V600E(VE1,羅氏公司)、p53(DO-7,基因科技公司)、PD-L1(22C3,DAKO公司)、PAX8(OTI6H8,北京中杉金橋公司)、CD10(56C6,DAKO公司)染色均在免疫組化自動染色儀上實施,具體操作步驟嚴格參照試劑盒說明書進行。Ki-67增殖指數(shù)通過計數(shù)腫瘤內(nèi)鱗狀細胞成分表達熱點區(qū)500個細胞中的表達情況進行評價,記為百分比;不足500個細胞的按實際情況全部計算;Ki-67不足1%的記為1%。BRAF V600E陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)為腫瘤細胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)彌漫性著色[7-8]。PD-L1(22C3)染色判讀采用綜合陽性評分(combined positive score, CPS),CPS≥1定義為陽性[9-10]。p53蛋白表達判讀分為高表達及非高表達,高表達的判讀參考Deeken-Draisey等[11]的標(biāo)準(zhǔn),定義為50%以上腫瘤細胞呈彌漫強陽性核著色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析分類資料的假設(shè)檢驗采用Fisher精確概率法或似然比法;計數(shù)資料的假設(shè)檢驗采用Mann-WhitneyU檢驗。對于生存分析,分別以疾病進展及因癌死亡為結(jié)局變量,采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線,并采用Log-rank檢驗。采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,全部假設(shè)檢驗顯著性水平α雙側(cè)=0.05。

2 結(jié)果

2.1 鱗狀細胞成分的組織學(xué)特征PTC中的鱗狀細胞呈現(xiàn)為兩種分布形式:(1)散在的鱗狀細胞團(10例),大部分為同心圓狀鱗狀小體(圖1A),鱗狀細胞異型性不明顯,未見明確核分裂象。此種形態(tài)是鱗狀分化最常見的表現(xiàn)形式。(2)彌漫成片分布(13例)(圖1B、C),夾雜PTC或未夾雜PTC成分,不同病例細胞異型性輕-重度不等,部分可見細胞內(nèi)角化及角化珠。鱗狀細胞成分最大徑0.4～5 cm。此種表現(xiàn)形式的鱗狀細胞成分需進行鑒別診斷,以明確鱗狀細胞成分是否為未分化癌。本組中,最大徑0.4～1.3 cm的鱗狀細胞成分細胞異型性不明顯或輕度異型;最大徑1.8～5.0 cm的鱗狀細胞成分細胞中-重度異型,核分裂象易見。

2.2 免疫表型所有病例鱗狀細胞成分p40(圖1D)、CK5/6(圖1E)均呈陽性。PAX8(圖1F)在所有PTC中呈強陽性,在鱗狀細胞成分中呈局灶弱陽性至彌漫強陽性不等。Ki-67在散在鱗狀細胞團或最大徑<1.5 cm的鱗狀細胞成分中低表達,增殖指數(shù)1%～8%(圖1G),在最大徑>1.5 cm、細胞中-重度異型的鱗狀細胞成分中高表達,均≥30%(圖1H)。鱗狀細胞成分與其背景中的PTC成分BRAF V600E表達情況一致,均為陽性或陰性。檢測病例BRAF V600E陽性占47.8%,其中細胞中重度異型的鱗狀細胞成分均呈陽性。p53高表達見于3例細胞呈中-重度異型的鱗狀細胞成分(圖1I),其余鱗狀細胞成分及所有PTC成分均呈非高表達(圖1J)。CD10在鱗狀細胞成分中呈現(xiàn)強弱不等、陽性比例不等的胞質(zhì)及胞膜著色,在中-重度異型的鱗狀細胞成分中,有2/4例呈胞膜及胞質(zhì)彌漫強陽性著色,而在其余病例中有3/19例呈彌漫強陽性著色(圖1K)。PD-L1(22C3)CPS評分0～60不等,其中在中-重度異型的鱗狀細胞成分中均呈陽性(圖1L)。

2.3 鱗狀細胞成分的分類及診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)鱗狀細胞成分的分布狀態(tài)、細胞的異型性及Ki-67增殖指數(shù),可將鱗狀細胞成分劃分為兩類:鱗狀分化(19例)和未分化癌(4例)。前者表現(xiàn)為散在鱗狀細胞團或成片分布,細胞異型性不明顯,Ki-67增殖指數(shù)<10%;后者彌漫片狀分布,細胞中-重度異型,Ki-67增殖指數(shù)≥30%。鱗狀分化成片分布時,鱗狀細胞成分最大徑一般較小,≤1.5 cm,而未分化癌鱗狀細胞成分最大徑較大,均>1.5 cm。p53高表達對兩者的鑒別具有重要價值,高表達僅見于未分化癌。Ki-67增殖指數(shù)與鱗狀細胞的異型程度相一致,對于鱗狀細胞成分的分類至關(guān)重要(圖2A)。

圖2 A.鱗狀細胞成分分組與Ki-67增殖指數(shù)的關(guān)系,Mann-Whitney U檢驗,P<0.001;B.鱗狀細胞成分分組與PD-L1(22C3)的關(guān)系,Mann-Whitney U檢驗,P=0.016;*代表極端值,鱗狀分化病例中有1例CPS=60,由于背景中大量淋巴細胞著色所致

2.4 鱗狀細胞成分分類與臨床病理特征的關(guān)系鱗狀細胞成分分類具有顯著的臨床病理相關(guān)性,其中,未分化癌與患者年齡>55歲、腫瘤最大徑>2 cm、甲狀腺外侵犯、鱗狀細胞成分最大徑>1.5 cm、高細胞亞型及經(jīng)典型、高pT分期、p53高表達、BRAF V600E陽性均有相關(guān)性(表1)。BRAF V600E陽性見于所有未分化癌病例。兩分類中PD-L1(22C3)表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,未分化癌中PD-L1(22C3)均陽性且CPS評分更高(圖2B)。BRAF V600E及PD-L1(22C3)陽性提示對未分化癌進行后續(xù)靶向治療及免疫治療的可行性。

表1 甲狀腺乳頭狀癌中不同鱗狀細胞成分與臨床病理特征的關(guān)系

2.5 鱗狀細胞成分分類對預(yù)后的影響無論是疾病無進展生存還是總生存,未分化癌病例預(yù)后均顯著差于鱗狀分化病例(圖3)。19例鱗狀分化病例中僅1例出現(xiàn)了疾病進展,為二次手術(shù)病例,均未出現(xiàn)因癌死亡。由此可見,鱗狀分化對預(yù)后的影響不明顯。未分化癌病例中,2例因癌死亡,為二次或多次手術(shù)病例,術(shù)后分別隨訪7、15個月。另2例未分化癌患者分別隨訪6、15.5個月,均未出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)。

圖3 A.Kaplan-Meier生存曲線分析鱗狀分化和未分化癌與疾病無進展生存的關(guān)系;B. Kaplan-Meier生存曲線分析鱗狀分化和未分化癌與患者總生存的關(guān)系

3 討論

PTC中鱗狀細胞成分的診斷既往尚無明確的診斷標(biāo)準(zhǔn)。本研究匯總了單中心8年間的病例,對鱗狀細胞成分的組織學(xué)特征進行了詳盡分析,發(fā)現(xiàn)鱗狀細胞成分可分為散在鱗狀小體及彌漫成片兩種分布方式,結(jié)合細胞異型性及Ki-67增殖指數(shù)可劃分為鱗狀分化及未分化癌兩大類,前者包括所有的鱗狀小體及部分成片分布的病例,細胞異型性不明顯或輕度,而后者全部彌漫成片分布,細胞中-重度異型且鱗狀細胞成分最大徑均>1.5 cm。本組病例中,未分化癌的Ki-67增殖指數(shù)均≥30%,此與WHO中未分化癌(非鱗狀細胞癌亞型)的Ki-67增殖指數(shù)一致;鱗狀分化的Ki-67增殖指數(shù)均<10%。對于是否存在Ki-67增殖指數(shù)為10%～30%、鱗狀分化與未分化癌鑒別困難的病例,因本組病例數(shù)有限,目前無法判斷是否存在此類病例,需收集更多病例進一步積累經(jīng)驗及完善分類。有研究報道CD10在甲狀腺未分化癌中呈強陽性,而在PTC及鱗狀分化成分中呈陰性或弱陽性[12-13]。本組病例中,雖然未分化癌成分顯示了更高比例的CD10強陽性著色,但鱗狀分化成分中也有一定比例的強陽性著色,所以CD10染色并不能很好的鑒別鱗狀分化和未分化癌。本組中疾病無進展生存和總生存分析均顯示PTC中鱗狀分化并未影響患者生存,而4例未分化癌,鱗狀細胞癌亞型中有2例因癌死亡,預(yù)后與既往分類的未分化癌預(yù)后相當(dāng),在一定程度上證實了將鱗狀細胞癌納入未分化癌分類的合理性。

PTC中的鱗狀細胞成分與PTC成分的BRAF V600E狀態(tài)一致,且均呈PAX8陽性,提示兩者組織學(xué)來源一致,均為濾泡上皮來源。在未分化癌成分中出現(xiàn)了PTC中不存在的p53蛋白高表達,提示未分化癌是由PTC出現(xiàn)累加TP53基因突變,進一步高級別轉(zhuǎn)化而來。WHO(2022版)將甲狀腺鱗狀細胞癌納入未分化癌的分類中,導(dǎo)致這類腫瘤后續(xù)臨床治療方案和管理的更新。BRAF V600E高突變和PD-L1(22C3)陽性給這部分患者帶來了包括針對BRAF V600E的靶向治療及免疫治療的可供選擇治療方案及可預(yù)期的生存期的延長。本組2例存活的未分化癌患者分別在術(shù)前或術(shù)后采用了BRAF V600E靶向治療。既往1例術(shù)前采用靶向治療聯(lián)合免疫治療的未分化癌病例術(shù)后病理評估為完全緩解[14],術(shù)后至今隨訪2年,未見復(fù)發(fā),提示靶向治療聯(lián)合免疫治療未分化癌的有效性。

綜上,本研究總結(jié)了PTC中鱗狀細胞成分的組織學(xué)特點及免疫表型,將鱗狀細胞成分劃分為鱗狀分化和未分化癌兩大類,并提出了診斷標(biāo)準(zhǔn)。未分化癌中,鱗狀細胞成分均彌漫成片分布,細胞中-重度異型,Ki-67增殖指數(shù)≥30%。鱗狀分化和未分化癌具有鮮明的預(yù)后差異。未分化癌中BRAF V600E及PD-L1(22C3)陽性為這部分患者帶來了相應(yīng)的靶向治療及免疫治療的曙光。