吳 劍 龔 虹 黃振東 徐 媛 江艷萍 黃 冠 支林俊 黃國青

邵武市立醫(yī)院 1 檢驗(yàn)科 2 神經(jīng)內(nèi)科，福建省邵武市 354000

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引發(fā)的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疫情，使全世界深陷其中已兩年有余。我國實(shí)行嚴(yán)格的“清零”政策，各地雖時(shí)有零星疫情發(fā)生，但也很快被消滅，但境外人員入境的疫情防控較難管理。2021年11月15日，本實(shí)驗(yàn)室1例隔離點(diǎn)“雙采雙檢”新冠核酸檢測標(biāo)本的檢驗(yàn)結(jié)果與市疾控中心結(jié)果不一致，后經(jīng)標(biāo)本交叉復(fù)查以及重采標(biāo)本后復(fù)查，判定此患者鼻咽拭子新冠核酸檢驗(yàn)結(jié)果為“陽性”，現(xiàn)將情況報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 患者男性，2021年10月18日入境，就地集中隔離觀察，隔離期間核酸檢驗(yàn)結(jié)果均為陰性。11月1日解除隔離后“點(diǎn)對(duì)點(diǎn)”閉環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)到本市集中隔離點(diǎn)進(jìn)行醫(yī)學(xué)觀察，期間多次采樣，結(jié)果均為陰性。11月15日即將解除隔離時(shí)按照“雙采雙檢”要求[1]，同時(shí)采集鼻咽拭子兩管，分別送本市疾控中心與本實(shí)驗(yàn)室。(1)樣本A1：送市疾控中心的樣本。(2)樣本A2：送本實(shí)驗(yàn)室的樣本。(3)樣本B：重新采集的雙側(cè)鼻咽拭子合并成一管的樣本。

1.2 核酸提取 鼻咽拭子置于含胍鹽的病毒保存液(浙江康康醫(yī)療器械股份有限公司，批號(hào)：批210301)中，震蕩60s后取200μl樣本用核酸提取試劑(中元匯吉生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：5108101)在核酸提取儀(山東博科BK-HS32)上經(jīng)17min提取后獲得50μl的RNA溶液。

1.3 核酸擴(kuò)增

1.3.1 擴(kuò)增試劑1：某公司生產(chǎn)的新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒，批號(hào)：5109014，最低檢測限200copies/ml。本產(chǎn)品設(shè)有外源性內(nèi)標(biāo)，按試劑說明書配制反應(yīng)體系，反應(yīng)程序：37℃ 1min；50℃ 5min；95℃ 2min；95℃ 5s；60℃ 30s；(48個(gè)循環(huán))，在 60℃進(jìn)行熒光檢驗(yàn)，熒光檢驗(yàn)通道選擇 FAM/ROX/VIC，passive reference選擇 NONE。提取出的核酸放在蘇州雅睿實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào)MA-6000)上進(jìn)行擴(kuò)增。新冠病毒基因N和ORF1ab與內(nèi)標(biāo)陽性判斷值為<40。

1.3.2 擴(kuò)增試劑2：另一品牌公司生產(chǎn)的新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒，批號(hào)：2021099，最低檢測限500copies/ml。本試劑盒同時(shí)包括內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)檢測系統(tǒng)，本試劑盒同時(shí)包括內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)，按試劑說明書配制反應(yīng)體系，反應(yīng)程序：50℃ 2min；95℃ 2min；95℃ 5s；60℃ 35s；95℃ 5s；60℃ 35s；(44個(gè)循環(huán))，熒光檢驗(yàn)通道選擇 FAM/VIC/CY5，新冠病毒基因N、ORF1ab與內(nèi)標(biāo)陽性判斷值為<30。

1.3.3 核酸擴(kuò)增儀：蘇州雅睿實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,型號(hào)MA-6000。

以上采樣管、提取儀、提取試劑、擴(kuò)增儀、擴(kuò)增試劑組成的檢測體系均已通過性能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

第一次采樣(雙采雙檢)，本實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本(A2)提取兩次，中元匯吉試劑擴(kuò)增兩次，N基因與ORF1ab基因未檢驗(yàn)到熒光擴(kuò)增信號(hào)，判定結(jié)果為“陰性”。但“雙采雙檢”送至市疾控中心的標(biāo)本(A1)檢驗(yàn)結(jié)果卻為“可疑陽性”。這一情況引起了雙方實(shí)驗(yàn)室的高度重視，緊急通知隔離點(diǎn)重新采集標(biāo)本(B)送本實(shí)驗(yàn)室，并將標(biāo)本A1轉(zhuǎn)運(yùn)至本實(shí)驗(yàn)室，A1與B同時(shí)用中元與達(dá)安兩種擴(kuò)增試劑復(fù)核，另將標(biāo)本A2用達(dá)安試劑復(fù)核。每份標(biāo)本提取兩次，擴(kuò)增兩次。復(fù)查A1的結(jié)果是：達(dá)安基因擴(kuò)增為“可疑陽性”；中元匯吉擴(kuò)增結(jié)果為“陽性”；標(biāo)本A2用達(dá)安擴(kuò)增，N基因與ORF1ab基因及內(nèi)標(biāo)均未檢測到熒光擴(kuò)增信號(hào)；標(biāo)本B，用以上兩種擴(kuò)增試劑并行檢測結(jié)果均為“陽性”。見表1。

表1 本例無癥狀感染者鼻咽拭子各標(biāo)本相關(guān)基因核酸檢驗(yàn)CT值

3 討論

SARS-CoV-2與宿主易感細(xì)胞表面的ACE2受體結(jié)合從而侵入機(jī)體[2]，其結(jié)合的方式與SARS-CoV相似，但親和力卻比SARS-CoV強(qiáng)10～20倍[3]，證明了SARS-CoV-2具有比SARS-CoV更強(qiáng)的傳染性與致病性。且SARS-CoV-2屬于RNA病毒，相比DNA病毒，其單鏈結(jié)構(gòu)更易發(fā)生變異[4]。我國將COVID-19歸為乙類傳染病，但采取甲類傳染病的預(yù)防、控制措施[5]。WHO推薦的識(shí)別SARS-CoV-2感染病例的方法是新型冠狀病毒核酸檢驗(yàn)[6]，此方法也是目前我國新冠疫情防控重要且有效的手段。

新冠核酸檢測試劑盒內(nèi)通常包含內(nèi)標(biāo)基因用以避免因標(biāo)本不合格、核酸提取失敗或擴(kuò)增失敗等原因而造成“假陰性”問題[2]。內(nèi)標(biāo)基因與標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行提取與擴(kuò)增，如果實(shí)驗(yàn)完成后內(nèi)標(biāo)基因未擴(kuò)增出曲線，則實(shí)驗(yàn)失敗，需重做并分析查找原因。內(nèi)標(biāo)基因通常分為外源性與內(nèi)源性兩類：外源性內(nèi)標(biāo)是在試劑配制時(shí)加入待測標(biāo)本中的假病毒核酸片段，能有效監(jiān)測核酸提取與擴(kuò)增的全過程，但無法監(jiān)測標(biāo)本采樣是否合格；內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)是人體各組織細(xì)胞自帶的基因片斷，故內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)可監(jiān)測到標(biāo)本是否合格，但因內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)和靶核酸提取效率不盡相同，所以內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)不一定能監(jiān)測到提取過程存在的問題。綜上，此二類內(nèi)標(biāo)各有優(yōu)劣。本例無癥狀感染者第一次“雙采雙檢”時(shí)，送到本實(shí)驗(yàn)室的鼻咽拭子標(biāo)本A2用含有外源性內(nèi)標(biāo)的擴(kuò)增試劑1檢驗(yàn)，結(jié)果為“陰性”，但用含能監(jiān)控采樣質(zhì)量的內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)的擴(kuò)增試劑2復(fù)查時(shí)，內(nèi)標(biāo)基因未起熒光擴(kuò)增曲線，推斷此份標(biāo)本采樣不合格。如未對(duì)此例患者的A2標(biāo)本進(jìn)行不同品牌的含不同類型內(nèi)標(biāo)試劑復(fù)核，則極大可能造成漏檢，說明對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)人群及“可疑”結(jié)果的樣本，需用不同品牌的試劑交叉復(fù)查，才能最大限度保證不漏檢。有研究表明鼻咽拭子較口咽拭子陽性率高[7]，但鼻咽拭子的采集難度較大，且因不適感更強(qiáng)或者心理抗拒而導(dǎo)致被采者依從性更低。在一份經(jīng)驗(yàn)交流中提到[8]鼻咽拭子采集前需與被采者做好充分的溝通，以減輕被采樣者的恐懼感，提高依從性，且在采樣時(shí)要注意“觸、停、轉(zhuǎn)”等的操作技巧，以保證標(biāo)本質(zhì)量。在充分認(rèn)識(shí)到標(biāo)本質(zhì)量的重要性后，重新采集的鼻咽拭子B，經(jīng)三家實(shí)驗(yàn)室(本實(shí)驗(yàn)室、市疾控中心與地區(qū)疾控中心)共同復(fù)核，均為“陽性”結(jié)果，證明了標(biāo)本質(zhì)量是新冠核酸檢驗(yàn)質(zhì)量保證的重要影響因素之一。

另外，在復(fù)檢A1標(biāo)本時(shí)，檢測限更低的擴(kuò)增試劑1(200copies/ml)能夠把靶核酸的ORF1ab基因與N基因完全擴(kuò)增出來，而擴(kuò)增試劑2(最低檢測限500copies/ml)僅能得出“可疑”的結(jié)果?；谀壳皣鴥?nèi)外均無SARS-CoV-2核酸定量的標(biāo)準(zhǔn)品，國內(nèi)獲批的SARS-CoV-2核酸檢驗(yàn)試劑均為定性試劑，則在判斷試劑檢測靈敏度時(shí)，最低檢測限是一項(xiàng)尤為重要的指標(biāo)[9]。有文件[10]建議在新冠核酸檢驗(yàn)時(shí)選用高靈敏的、最低檢測限≤500copies/ml的擴(kuò)增試劑。特別是對(duì)于新冠無癥狀感染者或弱陽性患者，高靈敏的檢驗(yàn)試劑能避免漏檢，并更迅速地發(fā)現(xiàn)陽性患者而采取有效的隔離與治療措施。有文件[1]指出當(dāng)標(biāo)本初次檢測結(jié)果為陽性時(shí)，應(yīng)使用另外更加靈敏的試劑對(duì)原始標(biāo)本進(jìn)行復(fù)核后再發(fā)報(bào)告，以盡量避免檢驗(yàn)質(zhì)量問題的發(fā)生。

新冠核酸檢驗(yàn)結(jié)果陽性是 COVID-19 確診的金標(biāo)準(zhǔn)，因此，每一份新冠核酸檢驗(yàn)報(bào)告的質(zhì)量不容輕視。本市自新冠疫情發(fā)生以來無1例本土病例，且此例患者在隔離期間多次核酸檢測均為“陰性”結(jié)果，如果此次未“雙采雙檢”，則很有可能發(fā)生“漏檢”的嚴(yán)重事故。為保證新冠核酸檢驗(yàn)質(zhì)量，除了做好室間質(zhì)量評(píng)價(jià)與室內(nèi)質(zhì)控外，還應(yīng)該注意檢驗(yàn)全流程的質(zhì)量管理，特別是合規(guī)的采樣以及對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)人群、“可疑”結(jié)果的標(biāo)本需進(jìn)行不同品牌試劑的交叉復(fù)核。