何紅梅 劉容菊 陳 博 鄒志玲 陳雪梅

廣東省東莞市松山湖中心醫(yī)院生殖醫(yī)學中心 523326

慢性子宮內(nèi)膜炎(Chronic endometritis, CE)是子宮內(nèi)膜長期受病原體感染后炎癥調(diào)節(jié)紊亂導致的疾病，在人群中的發(fā)病率為10%～11%，但在不孕、復發(fā)性流產(chǎn)等患者的發(fā)病率偏高，據(jù)統(tǒng)計CE在不孕癥女性中發(fā)生率可高達56.8%[1]；在反復種植失敗以及復發(fā)性流產(chǎn)女性發(fā)生率分別為：7.7%～36.58%、10.8%～36.8%[2-5]。由于CE不僅可以引起患者腹痛、異常子宮出血等不適，還對患者的生殖功能有影響，所以CE的治療至關(guān)重要。目前關(guān)于CE治療的研究較多，但主要集中在臨床療效方面的研究，關(guān)于CE治療對子宮內(nèi)膜基因表達水平影響的研究較少，目前還沒有基于轉(zhuǎn)錄組測序的研究。本研究通過對CE患者采用抗生素治療前后的子宮內(nèi)膜進行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選差異基因，并對差異表達基因進行生物信息學分析，以此探討抗生素治療CE對子宮內(nèi)膜基因譜的影響，進一步在基因?qū)用娣治隹股刂委烠E的機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取我院生殖醫(yī)學中心2019年7月—2020年12月期間診斷為CE的不孕不育患者19例作為研究對象。納入標準：(1)年齡<40歲；(2)病理診斷有CE；(3)月經(jīng)周期25～35d，自身月經(jīng)周期變化3d內(nèi)。排除標準：(1)染色體核型異常；(2)自身免疫性疾病。本研究獲得我院醫(yī)學倫理委員會批準，且所有研究對象均知情同意。

1.2 標本收集 患者月經(jīng)干凈3～7d行宮腔鏡下子宮內(nèi)膜活檢或直接使用一次性子宮內(nèi)膜取樣器抽吸子宮內(nèi)膜，留取2份子宮內(nèi)膜標本，1份用10%福爾馬林溶液固定后送病理檢查，1份用DNA/RNA保存液保存于-80℃冰箱。如患者病理診斷CE，保存的標本送至廣州研科生物科技有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序。診斷CE的患者于月經(jīng)期開始口服鹽酸多西環(huán)素片100mg，2次/d及甲硝唑片400mg，2次/d，共服用14d，次月月經(jīng)干凈3～7d使用一次性子宮內(nèi)膜取樣器抽吸子宮內(nèi)膜，留取2份子宮內(nèi)膜標本，保存方法同前，如復查病理診斷無CE，則將子宮內(nèi)膜標本進行轉(zhuǎn)錄組測序，如病理診斷仍有CE，則不進行測序，繼續(xù)給予同前抗炎治療，直至復查子宮內(nèi)膜病理診斷無CE，再將無CE的標本進行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.3 CE診斷 采用蘇木精—伊紅(HE)染色及CD138免疫組化染色的方法判斷是否有CE。每高倍鏡視野下見至少1個CD138陽性的漿細胞即診斷為CE。

1.4 轉(zhuǎn)錄組RNA建庫、測序和分析

1.4.1 建庫、測序流程：每份標本總RNA抽提后依次進行質(zhì)檢、mRNA富集、雙鏈cDNA合成、末端修復、加A和接頭、片段選擇和PCR富集、文庫質(zhì)量檢測、Illumina HiSeqTM2500測序。

1.4.2 數(shù)據(jù)處理：測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識別分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列。原始序列需去除帶接頭的序列；去除N(N表示無法確定堿基信息)的比例大于10%的序列；去除低質(zhì)量序列(質(zhì)量值SQ≤5的堿基數(shù)占整個read長度50%以上的序列)得到待分析序列，后續(xù)的分析均基于此序列。

1.4.3 差異表達基因篩選：采用HTSeq軟件進行基因表達水平分析，采用DESeq進行差異基因篩選，篩選條件設(shè)為: padj < 0.05(padj值是校正后的P值，該值越小表示基因表達差異越顯著)且差異倍數(shù)|fold change|>2。

1.4.4 差異表達基因的功能富集分析：通過Gene Ontology(GO，http://www. geneontology.org/)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG，http://www.genome.jp/kegg/)數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行功能富集分析，padj<0.05表示顯著富集。

2 結(jié)果

2.1 基本資料及CE治愈結(jié)果 所有研究對象的年齡為26～39歲，平均年齡(31.95±4.40)歲，月經(jīng)周期25～35d，平均月經(jīng)周期(29.21±2.35)d，自身月經(jīng)周期變化0～3d，平均月經(jīng)周期變化(1.47±1.26)d，體重指數(shù)(BMI)16.23～27.89，平均BMI 22.21±3.36。19例患者中有17例經(jīng)過1個療程的抗炎治療后復查CE治愈，1個療程治愈率為89.47%，另外2例患者經(jīng)過2個療程治愈。

2.2 數(shù)據(jù)質(zhì)量評估結(jié)果 CE治療前和治療后樣本測序的總長度分別為115.8Gb和116.02Gb。所有樣本測序Phred值大于20的堿基比例均>94%，質(zhì)量值大于30的堿基比例均>87%，GC堿基對的含有量在各樣本中基本保持不變(見表1)。以上結(jié)果說明，本研究測序質(zhì)量較好，測序數(shù)據(jù)符合后續(xù)分析要求。

表1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估結(jié)果

2.3 差異表達基因篩選結(jié)果 與治療前相比，CE經(jīng)過抗生素治療后子宮內(nèi)膜有907個基因表達上調(diào)，1 248個基因表達下調(diào)。用火山圖可以推斷差異基因的整體分布情況(見圖1)。

圖1 差異表達基因的火山圖

2.4 差異基因功能富集分析 通過GO基因功能富集發(fā)現(xiàn)差異基因主要富集于炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、急性炎癥反應(yīng)、急性炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、細胞—基質(zhì)黏附、體液免疫反應(yīng)等生物學過程中，以及細胞外基質(zhì)部分、細胞外結(jié)構(gòu)部分等細胞成分中(見圖2)。KEGG分析顯示差異基因主要富集在IL-17 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、細胞黏附分子、細胞因子—細胞因子受體相互作用、細胞外基質(zhì)—受體相互作用等通路(見圖3)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，參與炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)的差異表達基因中有許多與女性生殖密切相關(guān)(見表2)。

表2 參與炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)的與生殖相關(guān)的差異表達基因分類

圖2 差異表達基因GO富集分析圖

圖3 差異表達基因KEGG分析圖

3 討論

CE 是一種可以引起子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)和功能破壞的持續(xù)性炎癥過程，由于局部內(nèi)膜炎性細胞浸潤和炎癥介質(zhì)滲出會改變子宮內(nèi)膜微環(huán)境，從而影響子宮內(nèi)膜的功能。Di Pietro 等[6]的研究顯示CE患者子宮內(nèi)膜的一些炎性相關(guān)基因發(fā)生了變化，因而子宮內(nèi)膜的容受性受到了影響，從而對女性的生殖功能產(chǎn)生巨大的影響，所以CE的治療至關(guān)重要。關(guān)于CE治療的研究頗多，但是既往的研究主要是從臨床結(jié)局方面分析CE治療對患者的影響，而本研究旨在通過轉(zhuǎn)錄組測序在基因水平方面分析CE的治療對子宮內(nèi)膜功能的影響。本研究結(jié)果顯示，與治療前相比，CE治療后有907個基因上調(diào)，1 248個基因下調(diào)；GO和KEGG富集分析顯示這些基因主要富集在炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)相關(guān)的功能和信號通路，這說明CE治療主要是通過改變參加炎癥反應(yīng)的一些相關(guān)基因來改善子宮內(nèi)膜的功能。

CCN4是參與炎癥反應(yīng)、胚胎發(fā)育、細胞凋亡等多種生物學過程。Tang Q等[7]的研究發(fā)現(xiàn)高水平的CCN4降低子宮內(nèi)膜孕激素受體的水平。由于孕激素受體在子宮內(nèi)膜蛻膜化、胚胎種植及妊娠維持有重要的作用[8]，孕激素受體表達下調(diào)對子宮內(nèi)膜的容受性有影響[9]，所以CCN4的高表達可以影響子宮內(nèi)膜的容受性。本研究結(jié)果顯示CE治療后CCN4表達下調(diào)，有利于子宮內(nèi)膜的功能恢復。

子宮內(nèi)膜中的趨化因子通過募集與妊娠有關(guān)的免疫細胞，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜種植窗的免疫微環(huán)境，從而對子宮內(nèi)膜容受性產(chǎn)生影響。本研究結(jié)果顯示，與治療前相比，CE治療后部分趨化因子有顯著的差異表達，其中CCL5、CCL24、CXCL17表達下調(diào)，而CX3CL1表達上調(diào)。CCL5可以趨化巨噬細胞的遷移和活化，而巨噬細胞可以分泌妊娠毒性物質(zhì)，所以CCL5表達下調(diào)可以減少子宮內(nèi)膜分泌妊娠毒性物質(zhì)，利于妊娠[10]。CCL24和CX3CL1在生殖方面也起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)CCL24和CX3CL1可以促進滋養(yǎng)細胞的增殖、遷移，從而促進胚胎的種植，但CCL24呈劑量依賴型抑制滋養(yǎng)細胞的侵襲，濃度越高對滋養(yǎng)細胞的抑制作用越強[10-11]。CXCL17是抑炎因子，目前還沒有CXCL17與子宮內(nèi)膜功能相關(guān)的研究，本研究發(fā)現(xiàn)CE治療后CXCL17表達下調(diào)，推測CXCL17的低表達可能更有利于維持子宮內(nèi)膜的正常功能，這需要進一步的研究證實。

白介素(Interleukin，IL)不僅參與機體的炎癥、免疫反應(yīng)，還可以影響胚胎的種植。Wang H等[12]的研究發(fā)現(xiàn)IL-1b可以提高子宮內(nèi)膜容受性。子宮內(nèi)膜中IL-15表達上調(diào)可以促進子宮自然殺傷細胞增殖并且增加其毒性，從而影響胚胎著床[13-14]。本研究結(jié)果顯示CE治療后IL-1b表達上調(diào)，IL-15表達下調(diào)，這提示CE治療有助于子宮內(nèi)膜功能的恢復。Ju J等[15]發(fā)現(xiàn)CE患者子宮內(nèi)膜的IL-1b表達高于正常人群，而本研究結(jié)果顯示CE治療后相比治療前IL-1b表達上調(diào)，與之不符，這可能是由于對比人群不同及研究方法不同造成的結(jié)果不一致。

補體(Complement，C)不僅僅參與病原體的清除，還在維持子宮內(nèi)膜正常的生殖功能方面發(fā)揮重要的作用。在妊娠過程補體活化劑和抑制劑調(diào)節(jié)補體，使母胎界面的補體維持動態(tài)平衡，從而維持正常的妊娠，補體過度激活可以通過炎癥損傷機制、促凝機制和細胞免疫機制導致復發(fā)性流產(chǎn)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，CE治療后C3、C4A、C6、C7、C9的表達主要呈下調(diào)狀態(tài)，這表明CE治療可以通過降低補體的表達保護子宮內(nèi)膜免受炎癥的損傷，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的免疫平衡，維持子宮內(nèi)膜正常的生殖功能。

免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)是參與體液免疫應(yīng)答反應(yīng)的免疫活性物質(zhì)，有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。CE患者高度水腫的基質(zhì)中高表達多種免疫球蛋白，這些免疫球蛋白可能對胚胎植入產(chǎn)生不良影響[17]。本研究結(jié)果顯示CE治療后多種免疫球蛋白基因表達下調(diào)，這可能是因為經(jīng)過抗生素治療后子宮內(nèi)膜的炎癥反應(yīng)消失，參與炎癥免疫反應(yīng)的免疫球蛋白的表達隨之下調(diào)，進而恢復子宮內(nèi)膜的功能。

本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序探討了抗生素治療CE對子宮內(nèi)膜基因譜的影響，其結(jié)果為進一步研究CE影響女性生育功能的機制和通路奠定了基礎(chǔ)。