曹琳，歐陽(yáng)及錦，韓梅，Julieth Majura，陳忠琴,2，曾少葵,2，張靜,2，鄭惠娜,2，曹文紅,2*

1(廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，國(guó)家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心(湛江)，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心，廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江，524088)2(大連工業(yè)大學(xué)，海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連，116034)

冷凍是海洋水產(chǎn)品的主要貯藏和加工方式，我國(guó)海洋水產(chǎn)品加工中約70%是冷凍加工。水產(chǎn)品在凍藏過程中易發(fā)生蛋白質(zhì)冷凍變性造成品質(zhì)劣變，加工利用價(jià)值顯著降低[1-2]。生產(chǎn)中主要通過添加抗凍劑來防止在凍藏過程中的蛋白質(zhì)冷凍變性以保持品質(zhì)，傳統(tǒng)商用抗凍劑主要由蔗糖、多聚磷酸鹽組成。這類抗凍劑通過改變蛋白質(zhì)中水存在的狀態(tài)和性質(zhì)間接作用于蛋白質(zhì)，減緩蛋白質(zhì)冷凍變性，但也存在一些缺陷，如糖類會(huì)帶來不期望的甜味，而磷酸鹽攝入過多會(huì)給人體帶來健康風(fēng)險(xiǎn)[3]。因此，海洋水產(chǎn)冷凍加工業(yè)亟待研發(fā)新型安全、高效的抗蛋白質(zhì)冷凍變性的抗凍劑。研究表明，從動(dòng)物皮膚、骨骼和食源性明膠提取的膠原蛋白肽具有一定的熱滯活性(thermal hysteresis activity, THA)，可以改變冰晶的生長(zhǎng)特性，降低冰點(diǎn)，抑制冰晶重結(jié)晶，從而達(dá)到抗凍的效果[4-8]，THA是評(píng)價(jià)膠原蛋白肽抗凍活性的重要指標(biāo)。具有冰結(jié)合特性的肽被稱為抗凍肽，因具有開發(fā)成綠色抗凍劑的潛力，近年來成為研究熱點(diǎn)[9]。雖然抗凍肽可以極大程度地滿足人們對(duì)食品抗凍劑的要求，但對(duì)其進(jìn)行開發(fā)探索仍存在一定的局限性[10]。天然抗凍肽主要提取自生物體內(nèi)，數(shù)目有限，并且與傳統(tǒng)抗凍劑相比，天然抗凍肽存在活性較低的問題。劉璐等[11]發(fā)現(xiàn)在牡蠣肉中添加5%的南極磷蝦酶解產(chǎn)物時(shí)，其表現(xiàn)的抗凍活性與添加量為0.5%的含磷抗凍劑組相當(dāng)。CHEN等[12]在草魚魚糜樣品中添加鰱魚魚鱗抗凍肽，發(fā)現(xiàn)添加量為4%時(shí)可達(dá)到與商業(yè)抗凍劑相似的效果。張莉等[13]發(fā)現(xiàn)在馬鈴薯冷凍面團(tuán)中添加4%、8%絲膠抗凍肽可以抑制冰晶重結(jié)晶，有效保持冷凍饅頭的質(zhì)構(gòu)特性，減緩冷凍過程中對(duì)酵母的損傷。冷凍食品中常添加的商業(yè)含磷抗凍劑的添加量通常為0.5%～1%，雖然大量研究表明從動(dòng)物、明膠中提取的膠原蛋白肽可以有效保證冷凍食品的品質(zhì)，但與傳統(tǒng)抗凍劑相比，其添加量較高，若要達(dá)到產(chǎn)業(yè)化程度，所需成本較大，這限制了抗凍肽在食品領(lǐng)域中的發(fā)展，所以開發(fā)出高活性、高穩(wěn)定性的抗凍肽具有重要的應(yīng)用前景。

糖基化反應(yīng)通過共價(jià)連接游離氨基和游離羧基，改善蛋白質(zhì)及膠原蛋白肽在溶液中的分布，改變其結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)穩(wěn)定性，從而達(dá)到提高蛋白質(zhì)、膠原蛋白肽生物活性的效果。HONG等[14]對(duì)魚皮膠原蛋白肽和D-氨基葡萄糖進(jìn)行糖基化反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)糖基化產(chǎn)物的抗氧化活性優(yōu)于魚皮膠原蛋白肽；WANG等[15]利用D-氨基葡萄糖制備玉米醇溶蛋白糖肽，發(fā)現(xiàn)其含有更多的酰胺鍵和疏水性氨基酸，可以有效改善急性酒精肝損傷；此外，有研究表明通過化學(xué)合成的抗凍糖蛋白與天然抗凍蛋白具有一樣的活性，可以降低溶液冰點(diǎn)，抑制冰晶生長(zhǎng)和重結(jié)晶效應(yīng)，提高THA[16]。CHEN等[16]利用葡聚糖對(duì)豬皮膠原蛋白肽進(jìn)行糖基化改性，改善了豬皮膠原蛋白肽的抗凍活性。雖然有研究證明糖基化反應(yīng)可以提高豬皮膠原蛋白肽的THA，但由于部分人群因宗教原因，不食用哺乳動(dòng)物來源的膠原蛋白肽，而魚源性膠原蛋白肽具有更高的可接受度，且魚皮是魚類加工的主要副產(chǎn)物，尚未被充分利用。本研究以羅非魚皮膠原蛋白肽為原料，利用糖基化反應(yīng)改良其THA，并對(duì)糖基化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行初步分析，以期為后續(xù)糖基化膠原蛋白肽的抗凍構(gòu)效機(jī)制研究及綠色抗凍劑的開發(fā)應(yīng)用提供前期數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚皮膠原蛋白肽(型號(hào)規(guī)格：CF-500-S-02)海南盛美諾生物技術(shù)有限公司；無水葡萄糖，廣東光華科技股份有限公司；鄰苯二甲醛(O-phthalaldehyde，OPA)、β-巰基乙醇，上海麥克林生化科技有限公司；牛血清白蛋白，北京索萊寶科技有限公司；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)，北京酷來博科技有限公司。乙腈，美國(guó) Supelco 公司；乙腈、甲酸為質(zhì)譜純，其他試劑皆為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

XEVO G2-XS QTOF型超高效液相飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Waters公司；TENSOR 27型傅里葉紅外光譜儀，德國(guó)BRUKER公司；FE28型pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Varioskan Flash全自動(dòng)酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技有限公司；XP205型分析天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；QL-905漩渦混勻器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DTT-A1000電子天平，福州華志科學(xué)儀器有限公司；SHJ-6AB磁力攪拌水浴鍋，常州金壇良友儀器有限公司；DSC-300C差示掃描量熱儀，南京大展檢測(cè)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 糖基化產(chǎn)物的制備

參照WANG等[17]的方法，稍作修改。將膠原蛋白肽溶解于純水中，配制成不同濃度的溶液，加入一定比例的葡萄糖，置于25 ℃磁力攪拌水浴鍋中攪拌20 min，攪拌均勻后取部分混合液進(jìn)行冷凍干燥，得到膠原蛋白肽-葡萄糖混合物。剩余混合液用0.1 mol/L的NaOH和HCl溶液調(diào)節(jié)pH值為8.0，將其置于磁力攪拌水浴鍋中，并設(shè)置相應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間及反應(yīng)溫度。待反應(yīng)結(jié)束后迅速冷卻至室溫，得到糖基化產(chǎn)物，冷凍干燥備用。配制同等濃度的葡萄糖溶液為葡萄糖樣品組，冷凍干燥備用。

1.3.2 膠原蛋白肽糖基化反應(yīng)單因素實(shí)驗(yàn)

參考本課題前期研究以及于冬蕾[18]的試驗(yàn)方案稍作修改，以接枝度(degree of graft, DG)為測(cè)定指標(biāo)，對(duì)膠原蛋白肽進(jìn)行單因素試驗(yàn)，設(shè)置糖基化反應(yīng)的溫度為40、50、60、70、80 ℃、反應(yīng)時(shí)間為30、60、90、120、150 min、膠原蛋白肽質(zhì)量濃度為50、60、70、80和90 g/L，糖肽質(zhì)量比為1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1，探究以上4個(gè)因素對(duì)DG的影響。

1.3.3 正交優(yōu)化膠原蛋白肽糖基化反應(yīng)工藝

在單因素的基礎(chǔ)上，選擇反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、膠原蛋白肽濃度和糖肽比進(jìn)行4因素3水平L9(34)正交試驗(yàn)，如表1所示，以DG為指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)對(duì)糖基化反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳工藝條件。

表1 葡萄糖糖基化反應(yīng)正交試驗(yàn)因素水平編碼表Table 1 Factors and levels for orthogonal test in glucose glycosylation

1.3.4 DG的測(cè)定

根據(jù)OPA法測(cè)量DG[19]。取80 mg OPA樣品于2 mL甲醇中，攪拌至完全溶解，加入0.1 mol/L 的硼砂和20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS各5 mL，最后加入200 μL β-巰基乙醇，混合均勻后加入純水定容至100 mL得到OPA試劑，現(xiàn)用現(xiàn)配。測(cè)定DG時(shí)，取4 mL OPA溶液，加入200 μL糖基化產(chǎn)物置于漩渦儀上混合均勻，以純水為對(duì)照組，在35 ℃水浴鍋中避光反應(yīng)2 min，待反應(yīng)結(jié)束后，于340 nm下測(cè)定糖基化產(chǎn)物吸光值，并以賴氨酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照公式(1)計(jì)算DG。

(1)

式中：c0，糖基化反應(yīng)前游離氨基含量，mol/L；c1，糖基化反應(yīng)后游離氨基含量，mol/L。

1.3.5 THA的測(cè)定

參考艾青等[20]的方法，稍作修改，采用差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry, DSC)進(jìn)行THA的評(píng)價(jià)。將待測(cè)樣品溶于純水中，配成10 mg/mL的溶液，用移液槍精準(zhǔn)移取10 μL樣品于坩堝中，以牛血清白蛋白為對(duì)照，測(cè)定樣品的THA。儀器穩(wěn)定后，以10 ℃/min的速率從25 ℃降至-25 ℃，再升溫至25 ℃，得到樣品的熔點(diǎn)(Tm)和融熔晗(ΔHm)。然后，以10 ℃/min的速率降溫至-25 ℃，以3 ℃/min的速率緩慢升溫至樣品呈固液混合狀態(tài)，稱為保留溫度(Th)，恒溫2 min，以同樣速率降溫至-25 ℃，記錄樣品的起始結(jié)晶溫度(T0)和結(jié)晶晗(ΔHf)，按照公式(2)和公式(3)計(jì)算 THA 和冰晶含量(Ф)。

THA/℃=Th-T0

(2)

(3)

式中：Th，保留溫度，℃；T0，起始結(jié)晶溫度，℃；ΔHm，融熔晗；ΔHf，結(jié)晶晗。

1.3.6 紅外光譜分析

參考WANG等[21]的方法，進(jìn)行傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)掃描。稱100 mg KBr研磨烘干，加入1 mg樣品混合均勻，研磨壓片。在4 000～400 cm-1進(jìn)行紅外光譜掃描，分辨率設(shè)置為4 cm-1。

1.3.7 質(zhì)譜分析

參考范三紅等[22]的方法并稍作修改。采用串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，設(shè)置流動(dòng)相A為超純水(含0.1%體積分?jǐn)?shù)甲酸)，B為乙腈(含0.1%甲酸)，色譜柱：Waters UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm)，柱溫30 ℃，流速0.2 mL/min，將樣品配成0.1 mg/mL的溶液，上樣10 μL。梯度洗脫條件：96%A→50%A；50%A→0%A；0%A→96%A。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，采用SPSS進(jìn)行方差分析，P<0.05代表具有顯著性差異，利用Origin 2021作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖基化反應(yīng)程度對(duì)THA的影響

膠原蛋白肽和葡萄糖的糖基化反應(yīng)程度對(duì)糖基化產(chǎn)物的生物活性起著至關(guān)重要的作用，DG值可以評(píng)估膠原蛋白肽糖基化反應(yīng)程度。固定糖基化反應(yīng)時(shí)間和糖肽比，改變其他反應(yīng)條件，測(cè)定不同反應(yīng)條件下得到的糖基化產(chǎn)物的DG和THA，探究糖基化反應(yīng)程度與THA之間的關(guān)系。如圖1所示，糖基化產(chǎn)物的DG與THA呈正相關(guān)，隨著糖基化產(chǎn)物DG的增大，其THA逐步增加，這證明膠原蛋白肽與葡萄糖糖基化反應(yīng)程度越大，其產(chǎn)物的THA越大。

圖1 糖基化反應(yīng)程度對(duì)THA的影響Fig.1 Effect of degree of glycosylation reaction on THA注：圖中括號(hào)內(nèi)數(shù)據(jù)分別為糖基化反應(yīng)溫度和膠原蛋白肽濃度

2.2 膠原蛋白肽糖基化反應(yīng)單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 反應(yīng)溫度對(duì)糖基化DG的影響

溫度是影響糖基化反應(yīng)的關(guān)鍵性因素，不同反應(yīng)溫度對(duì)DG的影響如圖2所示。隨著反應(yīng)溫度從40 ℃上升至70 ℃，DG逐步增大，DG分別為(27.73±0.72)%、(32.87±0.88)%、(36.37±0.07)%、(38.7±0.32)%。這是因?yàn)橛捎跍囟壬?，膠原蛋白肽的結(jié)構(gòu)開始變得松散，使得膠原蛋白肽內(nèi)的自由氨基暴露出來，同時(shí)溫度越高，肽分子和糖分子運(yùn)動(dòng)越快，增加了體系內(nèi)自由氨基和羧基的碰撞幾率。但70～80 ℃時(shí)，DG出現(xiàn)下降趨勢(shì)，推測(cè)糖基化反應(yīng)活性位點(diǎn)趨于在70 ℃飽和，溫度持續(xù)升高，反應(yīng)進(jìn)入到后期，糖被降解并且氨基化合物經(jīng)過一系列反應(yīng)生成晚期化合物，從而DG開始下降。這與ZHENG等[23]對(duì)卵清蛋白進(jìn)行葡聚糖糖基化反應(yīng)時(shí)的結(jié)果一致，不同反應(yīng)溫度下，DG隨著反應(yīng)溫度的增加而增大，當(dāng)糖基化反應(yīng)活性位點(diǎn)趨于飽和時(shí)，DG便不再增加。

圖2 不同反應(yīng)溫度下糖基化產(chǎn)物的DGFig.2 DG of glycosylated products of collagen peptides at different reaction temperatures

2.2.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)糖基化DG的影響

膠原蛋白肽在70 ℃下，分別在不同反應(yīng)時(shí)間30、60、90、120、150 min進(jìn)行糖基化反應(yīng)，結(jié)果如圖3所示，DG分別為(30.95±0.61)%、(34.43±0.61)%、(38.70±0.32)%、(35.66±0.57)%、(33.45±1.07)%。隨著反應(yīng)時(shí)間增加，糖基化反應(yīng)程度逐步增大，在90 min處達(dá)到峰值，隨后趨于平緩。XIAO等[24]利用大米蛋白水解物進(jìn)行葡萄糖糖基化反應(yīng)時(shí)，同樣發(fā)現(xiàn)DG在反應(yīng)90 min時(shí)達(dá)到最大，與本文結(jié)果一致。在反應(yīng)前期膠原蛋白肽經(jīng)過高溫水解造成肽鏈斷裂，暴露出更多的游離氨基，從而促進(jìn)了糖基化反應(yīng)進(jìn)程，而隨著反應(yīng)進(jìn)行到90 min之后，糖基化反應(yīng)結(jié)束，進(jìn)入到下一階段，導(dǎo)致氨基被消耗，從而DG開始下降[24-25]。

圖3 不同反應(yīng)時(shí)間下糖基化產(chǎn)物的DGFig.3 DG of the glycosylated products of collagen peptides at different reaction time

2.2.3 膠原蛋白肽濃度對(duì)糖基化DG的影響

如圖4所示，隨著膠原蛋白肽濃度不斷升高，DG先增大后減小，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到80 g/L時(shí)，DG達(dá)到峰值(46.61±0.63)%，且膠原蛋白肽為80與90 g/L時(shí)，兩者DG相差不大。這可能是因?yàn)橄嗤磻?yīng)溫度和時(shí)間的條件下，肽濃度增高，體系內(nèi)游離氨基也會(huì)增加，導(dǎo)致與游離羧基進(jìn)行縮合反應(yīng)的機(jī)會(huì)增加，所以DG增大。但由于葡萄糖含量是固定的，即羧基含量固定，膠原蛋白肽達(dá)到80 g/L時(shí)，糖基化反應(yīng)已經(jīng)趨于飽和，超過80 g/L后，DG不再增加，逐步趨于平衡。

圖4 不同膠原蛋白肽濃度下糖基化產(chǎn)物的DGFig.4 DG of the glycosylated products of collagen peptides at different concentrations of collagen peptides

2.2.4 糖肽比對(duì)糖基化DG的影響

如圖5所示，隨著葡萄糖和膠原蛋白肽比例增加，DG先上升，后下降。糖肽比為3∶1時(shí)，DG達(dá)到最大值(51.16±0.79)%。這與ZHAO等[26]的報(bào)道一致，隨著豌豆分離蛋白和低聚木糖的比值增加，糖基化產(chǎn)物的DG值先增加后降低，比值為3∶1時(shí)，DG達(dá)到最大。當(dāng)體系中糖比例較低時(shí)，隨著糖含量增加，糖基化反應(yīng)進(jìn)程被推動(dòng)，DG變高。糖比例較高時(shí)，體系內(nèi)溶液黏度增大，反而阻礙了游離氨基和羧基的碰撞幾率，導(dǎo)致生成的糖基化產(chǎn)物減少。

圖5 不同糖肽比的糖基化產(chǎn)物的DGFig.5 DG of the glycosylated products of collagen peptides at different glucose-collagen peptides ratios

2.3 糖基化反應(yīng)正交試驗(yàn)優(yōu)化

為進(jìn)一步探究糖基化反應(yīng)最佳條件，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以DG為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以L9(34)正交表優(yōu)化糖基化反應(yīng)工藝條件，結(jié)果如表2所示，溫度、時(shí)間、濃度和糖肽比4個(gè)因素不同程度上影響著糖基化反應(yīng)進(jìn)程。根據(jù)極差(R)結(jié)果，各因素對(duì)糖基化反應(yīng)的影響大小為：A>B>C>D，即反應(yīng)溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)影響最大。正交優(yōu)化得到最佳糖基化工藝參數(shù)為：A2B2C3D3，即反應(yīng)溫度70 ℃、反應(yīng)時(shí)間90 min、質(zhì)量濃度90 g/L、糖肽比4∶1。進(jìn)行驗(yàn)證該條件DG為(52.06±1.50)%，優(yōu)于正交表中的各試驗(yàn)號(hào)。

表2 膠原蛋白肽糖基化反應(yīng)正交設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal design and results of the glycosylation reaction of collagen peptides

2.4 糖基化反應(yīng)對(duì)膠原蛋白肽THA的影響

具有抗凍活性的膠原蛋白肽可以特異性地降低溶液冰點(diǎn)，但不改變其熔點(diǎn)，這會(huì)導(dǎo)致溶液的冰點(diǎn)和熔點(diǎn)之間產(chǎn)生差值，此差值被稱為THA[27-28]。本研究采用DSC法探究糖基化反應(yīng)前后膠原蛋白肽的THA，以牛血清白蛋白作為參照，圖6展示了牛血清白蛋白、葡萄糖、膠原蛋白肽、膠原蛋白肽-葡萄糖混合物和糖基化產(chǎn)物的DSC熱流曲線圖，基于DSC曲線計(jì)算Th下的THA和Ф，結(jié)果如表3所示。

表3 糖基化產(chǎn)物及對(duì)照樣品的THA和ФTable 3 THA and Ф of the glycosylated product and the control samples

a-糖基化產(chǎn)物；b-葡萄糖-膠原蛋白肽混合物；c-膠原蛋白肽；d-葡萄糖；e-牛血清白蛋白圖6 糖基化產(chǎn)物及對(duì)照樣品的DSC熱流曲線Fig.6 DSC curves of freezing and melting process for glycosylated product and control samples

將凍結(jié)的樣品溶液升溫至Th，即保持在固液共存狀態(tài)下，然后立即降溫至-25 ℃以達(dá)到完全結(jié)晶狀態(tài)。在相同的Th(0.1 ℃)下，由于牛血清白蛋白沒有抗凍活性，當(dāng)溫度再次下降時(shí)，放熱峰立即出現(xiàn)，幾乎沒有THA(0.3 ℃)，而葡萄糖、膠原蛋白肽、膠原蛋白肽-葡萄糖混合物和糖基化產(chǎn)物的放熱峰出現(xiàn)延遲，THA分別為1.2、1.1、2.3、0.4 ℃，THA在0.2～0.5 ℃為“中度活躍”抗凍蛋白，0.6～6 ℃為“極度活躍”抗凍蛋白[29-30]，膠原蛋白肽、膠原蛋白肽-葡萄糖混合物以及糖基化產(chǎn)物都屬于“極度活躍”抗凍肽。經(jīng)過糖基化反應(yīng)后，膠原蛋白肽的THA升高了1.1 ℃，較反應(yīng)前提高了47.8%，Ф降低了29.94%。樣品的THA越高，其Ф越低，該結(jié)果與CAO等[31]研究的結(jié)果相似，即THA與Ф之間存在線性負(fù)相關(guān)關(guān)系。推測(cè)因?yàn)樘腔磻?yīng)會(huì)增加溶液黏度，從而降低樣品的Ф，增大THA[16]。除此之外，糖基化反應(yīng)可以引進(jìn)大量羥基，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，抗凍肽主要通過氫鍵相互作用與冰晶中的水結(jié)合，以達(dá)到抑制冰晶形成的作用[32]，大量羥基存在會(huì)增加其以氫鍵形式與冰晶結(jié)合的能力，從而導(dǎo)致糖基化產(chǎn)物的THA增強(qiáng)。

2.5 紅外光譜分析

a-葡萄糖；b-膠原蛋白肽；c-膠原蛋白肽-葡萄糖混合物；d-糖基化產(chǎn)物圖7 糖基化產(chǎn)物及對(duì)照樣品的傅里葉紅外光譜Fig.7 Fourier infrared spectroscopy of the glycosylated product and control samples

通過傅里葉自反褶積和高斯函數(shù)計(jì)算膠原蛋白肽和糖基化產(chǎn)物位于酰胺Ⅰ帶的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成，結(jié)果如圖8所示，膠原蛋白肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由β-轉(zhuǎn)角和β-折疊組成，分別占40.00%和60.00%，膠原蛋白肽-葡萄糖混合物與膠原蛋白肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)差異性不大，β-轉(zhuǎn)角占59.15%，β-折疊占40.85%。而經(jīng)過葡萄糖糖基化反應(yīng)后，β-轉(zhuǎn)角降低至4.82%，β-折疊增加至95.18%。這一結(jié)果表明，葡萄糖和膠原蛋白肽之間的相互作用會(huì)影響膠原蛋白肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)[38]。推測(cè)β-折疊增加可以推進(jìn)糖基化產(chǎn)物與冰晶結(jié)合，從而增強(qiáng)抗凍肽的THA。

圖8 膠原蛋白肽、膠原蛋白肽-葡萄糖混合物與糖基化產(chǎn)物酰胺Ⅰ帶的紅外光譜分析(a)及二級(jí)結(jié)構(gòu)組成(b)Fig.8 Infrared spectroscopy analysis of collagen peptides, collagen peptides-glucose mixture and the glycosylated product (a) and secondary structure composition (b)

2.6 質(zhì)譜分析

質(zhì)譜是測(cè)定蛋白質(zhì)和膠原蛋白肽相對(duì)分子質(zhì)量的核心手段，通過分子質(zhì)量轉(zhuǎn)移分析膠原蛋白肽結(jié)構(gòu)變化[39]。圖9-a是羅非魚皮膠原蛋白肽和糖基化產(chǎn)物的基峰離子(base peak ion, BPI)色譜圖，色譜峰在9 min 內(nèi)全部流出，經(jīng)過糖基化反應(yīng)后，0～3 min內(nèi)膠原蛋白肽離子峰明顯減弱，5.5～8 min時(shí)，離子峰數(shù)量增加，且其相對(duì)豐度增強(qiáng)。對(duì)膠原蛋白肽以及糖基化產(chǎn)物進(jìn)行MS圖譜分析(圖9-b和圖9-c)，其結(jié)果與BPI色譜圖相對(duì)應(yīng)，經(jīng)過糖基化反應(yīng)后的膠原蛋白肽和糖基化產(chǎn)物的質(zhì)荷比(m/z)以及峰強(qiáng)度發(fā)生變化，膠原蛋白肽的m/z值由300～700轉(zhuǎn)移到400～800附近。這可能是由于葡萄糖與羅非魚皮膠原蛋白肽發(fā)生了接枝反應(yīng)，其質(zhì)荷比發(fā)生遷移。

理論上，肽被1個(gè)葡萄糖修飾時(shí)，m/z會(huì)增加162，如果肽被2個(gè)或者3個(gè)葡萄糖修飾時(shí)，其m/z也成倍數(shù)增加[40]。葡萄糖與膠原蛋白肽進(jìn)行糖基化反應(yīng)時(shí)并非簡(jiǎn)單分子質(zhì)量加成，此過程中葡萄糖分子可能會(huì)攜帶或失去部分離子。膠原蛋白肽與葡萄糖結(jié)合的機(jī)制尚不明確，以圖9-c糖基化產(chǎn)物中響應(yīng)值較高的2個(gè)峰為例，推測(cè)m/z為318.30的膠原蛋白肽與1個(gè)葡萄糖結(jié)合并脫去2個(gè)O2-，生成m/z為448.27的糖基化產(chǎn)物。m/z為274.28的膠原蛋白肽與3個(gè)葡萄糖分子和2個(gè)H+結(jié)合，生成m/z為762.42的糖基化產(chǎn)物。

圖9 膠原蛋白肽及其糖基化產(chǎn)物的基峰離子色譜圖(a)、0～3 min MS(b)和5.5～9 min MS(c)圖譜Fig.9 Base peak ion chromatography of collagen peptides and its glycosylation product (a), MS spectrum of 0-3 min (b) and MS spectrum of 5.5-9 min (c)

3 結(jié)論

改良抗凍肽的抗凍活性可提高其實(shí)用性，利用糖基化將抗凍肽與外源單糖進(jìn)行接枝組裝，可達(dá)到增加活性位點(diǎn)、優(yōu)化結(jié)構(gòu)、改良活性的目的。本文利用葡萄糖對(duì)羅非魚膠原蛋白肽進(jìn)行糖基化抗凍活性(THA)改良，優(yōu)化工藝參數(shù)下其糖基化DG達(dá)(52.06±1.50)%；糖基化后的膠原蛋白肽THA和Ф均發(fā)生顯著性變化，屬于“極度活躍”抗凍肽；膠原蛋白肽與葡萄糖分子結(jié)合，使其m/z變大；糖基化反應(yīng)后，膠原蛋白肽中大部分β-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)變成β-折疊，改變了膠原蛋白肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)，引入大量羥基，導(dǎo)致其與冰晶中水分子的結(jié)合能力加強(qiáng)，從而致使THA增加。本研究結(jié)果為糖基化改良羅非魚皮膠原蛋白肽THA及基于魚皮膠原蛋白肽開發(fā)綠色抗凍劑提供了重要的前期數(shù)據(jù)，對(duì)其它水產(chǎn)膠原蛋白源抗凍劑的開發(fā)亦具有重要參考意義。