趙麗娜，李鈺煒，張娜,2，康紅彥，王妙姝，鄭瑋麗，田洪濤,4,5*

1(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定，071001)2(保定學(xué)院 生物化工與環(huán)境工程學(xué)院，河北 保定，071001)3(河北新希望天香乳業(yè)有限公司，河北 保定，071001)4(河北省益生功能性乳制品技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定，071001)5(國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，河北 保定，071001)

膽固醇是細(xì)胞的功能和完整性的必需物質(zhì)，但長期血清膽固醇水平升高可能導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化，因此被認(rèn)為是心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)，心血管疾病仍將是導(dǎo)致死亡的主要原因，到2030年將影響全球約2 360萬人，而且高膽固醇血癥者發(fā)生心臟病的概率是血脂正常者的3倍[1-3]。有關(guān)降脂的大規(guī)模隨機(jī)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，血清總膽固醇水平降低1%，即可使冠心病的發(fā)生幾率降低2%～3%[4]。肝臟中高膽固醇血癥導(dǎo)致甘油三酯的過度積累也被認(rèn)為是非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的重要原因[5]。目前使用他汀類藥物是治療高膽固醇血癥最廣泛的方法，然而，這類藥物中有些價(jià)格昂貴，還有些有副作用[2]，包括導(dǎo)致肌肉疼痛、肝損傷、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、血糖升高和流產(chǎn)等[6]。因此，有必要開發(fā)更安全、成本更低、效果更好的治療高膽固醇血癥的方法。

20世紀(jì)70年代，MANN首次報(bào)道了含有乳酸菌的發(fā)酵乳有降膽固醇作用后，研究人員探討了乳酸菌的降膽固醇作用，尤其是乳桿菌和雙歧桿菌，也證實(shí)了食用益生菌，可顯著降低低密度脂蛋白和總膽固醇水平[1,7-8]。ZAFAR等[3]的研究表明，鼠李糖乳桿菌FM9和發(fā)酵乳桿菌Y57在改善高膽固醇、高脂飲食模型的雄性大鼠血脂方面與他汀類藥物一樣有效。CardiovivaTM是目前市售的降膽固醇益生菌產(chǎn)品之一，該產(chǎn)品已被加拿大衛(wèi)生部批準(zhǔn)為心血管健康的膳食補(bǔ)充劑，在美國和歐洲也有報(bào)道顯示每日攝入該產(chǎn)品可使高膽固醇血癥成人低密度脂蛋白膽固醇水平降低11.6%[1]。因此，益生菌以其安全性高、價(jià)格低廉、容易獲取等優(yōu)點(diǎn)，作為藥物輔助治療劑，頗具市場開發(fā)潛力。

從安全角度考慮，具有悠久食用歷史的傳統(tǒng)發(fā)酵食品是獲得益生菌資源的良好來源，它們受制作工藝和環(huán)境條件的影響含有不同的微生物群落。拜城縣隸屬于我國新疆阿克蘇地區(qū)，當(dāng)?shù)蒯t(yī)療水平落后，地理環(huán)境惡劣，人們生活水平也較低，但卻被國際自然醫(yī)學(xué)會(huì)(International Society of Natural Medicine,INMS)在1984年認(rèn)定為世界級“長壽鄉(xiāng)”[9]。拜城縣的人們習(xí)慣食用家庭自制的賽里木酸奶，其品質(zhì)優(yōu)越、極具民族特色和地域特點(diǎn)，是新疆維吾爾族的非物質(zhì)文化遺產(chǎn)，甚至被譽(yù)為“長壽秘訣”[10]。苑貝貝[10]發(fā)現(xiàn)賽里木酸奶中的功能因子除了來源于奶源之外，最大可能的來源就是其中的微生物。但是目前尚無針對賽里木酸奶源降解膽固醇微生物的研究。

本課題組前期對賽里木酸奶中的微生物進(jìn)行了分離和純化，并運(yùn)用分子生物學(xué)方法對分離純化的菌株進(jìn)行了初步鑒定，根據(jù)基礎(chǔ)特性(對人工胃液、人工腸液的耐受性，對常見病原菌的抑菌性，對Caco-2細(xì)胞的黏附性)對初步鑒定的菌株進(jìn)行了篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從賽里木酸奶中篩選出的大部分疑似植物乳桿菌具有較優(yōu)的基礎(chǔ)特性，是潛在的益生菌株。因此，本研究對從賽里木酸奶中篩選出的疑似植物乳桿菌進(jìn)行降解膽固醇能力的研究，并對高降解膽固醇菌株通過生理生化試驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行鑒定，最后對其安全性進(jìn)行初步研究，以期得到高降解膽固醇能力和具有一定安全性的潛在賽里木酸奶源益生菌菌株，為下一步對菌株進(jìn)行體內(nèi)降膽固醇功能研究和應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株來源

鼠李糖乳桿菌GG(LactobacillusrhamnosusGG, LGG)，購自中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，編號為ATCC 53103，作為對照菌株。

大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC 25922、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC 25923,保存自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程系實(shí)驗(yàn)室，作為抗生素敏感性試驗(yàn)和溶血試驗(yàn)的質(zhì)控菌株。

疑似植物乳桿菌R2-5、R2-7、R2-8、R4-2、R5-1、R6-1、R6-2、R6-3，分離自新疆傳統(tǒng)賽里木酸奶，為本研究的試驗(yàn)菌株。

1.1.2 主要培養(yǎng)基的配制

膽固醇 MRS 培養(yǎng)基：2 g/L膽鹽，2 g/L巰基乙酸鈉和100 μg/mL膽固醇的MRS 培養(yǎng)基。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

SHP-250生化培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LG GR-206SVQ冰箱，泰州樂金電子冷機(jī)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；DL-CJ-1N超凈工作臺，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；5417R高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf；酶標(biāo)儀，美國Thermo公司等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株降膽固醇能力測定

采用李堯[11]報(bào)道的硫酸鐵銨法稍作修改，測定菌株降解膽固醇的能力，具體操作如下：分別取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的膽固醇溶液加入到10 mL試管中，然后依次加入1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5 mL無水乙醇，再依次緩慢加入2 mL硫酸鐵銨試劑，混勻，待冷卻至室溫后，在560 nm波長下測吸光度。以膽固醇濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將活化至對數(shù)末期的菌株按體積比為1%的比例接種到膽固醇MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)至穩(wěn)定期，將培養(yǎng)液5 000 r/min離心10 min，取2 mL上清液于干凈試管中，加8 mL無水乙醇，搖勻，4 500 r/min離心10 min，取1 mL上清液于新的干凈試管中，加入2 mL 硫酸鐵銨顯色液，搖勻，冷卻后于 560 nm 處測定吸光度值，即為A樣品，未接種菌株的膽固醇 MRS培養(yǎng)基作對照，即為A對照。膽固醇降低率按公式(1)計(jì)算。

(1)

1.2.2 高降解膽固醇菌株的鑒定

1.2.2.1 生理生化鑒定

按照乳酸菌成套生化鑒定管(SHBG13)使用說明書進(jìn)行操作，對高降解膽固醇菌株進(jìn)一步進(jìn)行生理生化鑒定，結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 乳酸菌生化試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The judgment standard for biochemical test of lactic acid bacteria

1.2.2.2 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

下載與高降解膽固醇菌株的16S rDNA序列同源性最高菌株的序列，使用MEGA軟件，利用Neighbor-joining統(tǒng)計(jì)方法，采用Bootstrap method法建樹，反復(fù)次數(shù)為1 000，運(yùn)用p-distance方法計(jì)算進(jìn)化距離，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 高降解膽固醇菌株的安全性評價(jià)

1.2.3.1 抗生素敏感性檢測

以LGG為對照菌株，金黃色葡萄球菌ATCC 25923和大腸桿菌ATCC 25922為質(zhì)控菌株，采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法[12]檢測菌株對抗生素的敏感性。將活化好的LGG、R2-5、R2-7、R4-2、ATCC 25923和ATCC 25922用生理鹽水洗滌、重懸，調(diào)整濃度為(1～2)×108CFU/mL，取100 μL菌懸液，LGG、R2-5、R2-7和R4-2均勻涂布于倒入25 mL無菌MRS固體培養(yǎng)基已凝固的平板上，ATCC 25923和ATCC 25922均勻涂布于倒入25 mL無菌LB固體培養(yǎng)基已凝固的平板上，3～10 min后，用無菌鑷子夾藥敏片輕放于固體培養(yǎng)基上，擴(kuò)散5 min后，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h，然后測量抑菌圈直徑。參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical & Laboratory Standards Institute，CLSI)標(biāo)準(zhǔn)來判斷菌株的藥敏性。

1.2.3.2 質(zhì)粒檢測

質(zhì)粒的提取以含有質(zhì)粒的植物乳桿菌為陽性對照菌株，與不含質(zhì)粒的LGG為陰性對照菌株，參照文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行操作。

1.2.3.3 氨基酸脫羧酶活性的測定

參照文獻(xiàn)[14]的方法略有修改。將待測菌株在MRS液體培養(yǎng)基中活化好之后，接種于含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的前體氨基酸(組氨酸、酪氨酸、色氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、苯丙氨酸)和含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.005%吡哆醛-5-磷酸的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，傳代5次，以此誘導(dǎo)脫羧酶。然后將菌株接入含前氨基酸的脫羧酶培養(yǎng)基，不含前氨基酸的液體培養(yǎng)基作為對照，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，觀察培養(yǎng)基顏色變化。若顏色變成紫色，則為陽性結(jié)果，表示菌株形成氨基酸對應(yīng)的生物胺。

1.2.3.4 溶血活性檢測

以金黃色葡萄球菌ATCC 25923為質(zhì)控菌株，將LGG、R2-5、R2-7、R4-2和ATCC 25923分別在哥倫比亞血瓊脂平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察溶血反應(yīng)特征。根據(jù)《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[15]進(jìn)行溶血判斷。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和圖片繪制采用SPSS 17.0和 GraphPad Prism 8.0.1軟件完成。用ANOVA分析各處理組間差異顯著性，顯著性標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為P<0.05，極顯著標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株降解膽固醇能力的測定

以LGG為對照菌株，測定了8株疑似植物乳桿菌的降膽固醇的能力，膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，菌株降膽固醇能力結(jié)果如圖2所示。

圖1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of cholesterol

圖2 菌株對膽固醇的降解力Fig.2 Degradation of cholesterol by strains注：不同菌株相比，n=3，上標(biāo)小寫字母代表P<0.05水平的顯著性差異，上標(biāo)大寫字母代表P<0.01水平的顯著性差異

圖1可看出，在膽固醇質(zhì)量濃度為0～0.5 mg/mL時(shí)，膽固醇質(zhì)量濃度與OD值呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，線性方程為y=1.865x+0.019 38，相關(guān)系數(shù)R2=0.990 3。如圖2所示，R2-5、R2-7和R4-2降解膽固醇的能力極顯著高于對照菌株LGG(P<0.01)，R6-1降解膽固醇的能力顯著高于對照菌株LGG(P<0.05),R6-2降解膽固醇的能力與LGG無顯著差異(P>0.05), R2-8、R5-1和R6-3降解膽固醇的能力極顯著低于對照菌株LGG(P<0.01)。

2.2 高降解膽固醇菌株的鑒定

2.2.1 生理生化鑒定

對篩選出的高降解膽固醇能力的疑似植物乳桿菌通過生理生化試驗(yàn)對菌株進(jìn)一步鑒定，結(jié)果見表2。R2-5、R2-7和R4-2均能利用七葉苷、麥芽糖、纖維二糖、水楊苷、甘露醇、山梨醇、棉子糖、蔗糖、乳糖、菊糖和1%馬尿酸鈉，對照《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》，進(jìn)一步鑒定菌株R2-5、R2-7和R4-2為植物乳桿菌。

表2 乳酸菌生化鑒定管結(jié)果Table 2 The identification results of biochemical identification tube of lactic acid bacteria

2.2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用MEGA軟件，對篩選出來的高降解膽固醇菌株和相關(guān)菌株的16S rDNA序列進(jìn)行了比對和系統(tǒng)發(fā)育分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示。菌株R2-5、R2-7和R4-2均與Lactobacillusplantarum聚集成一枝，結(jié)合2.2.1的生理生化鑒定結(jié)果，確定菌株R2-5、R2-7和R4-2均為植物乳桿菌。

圖3 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences

2.3 植物乳桿菌R2-5、R2-7和R4-2的安全性評價(jià)

2.3.1 抗生素敏感性

以LGG為對照菌株，對植物乳桿菌R2-5、R2-7和R4-2進(jìn)行了常用10類12種抗生素的敏感性測定，結(jié)果如表3所示。植物乳桿菌R2-5、R2-7和R4-2均對氯霉素、氨芐西林、紅霉素、四環(huán)素敏感，對克林霉素中度敏感，對萬古霉素、卡那霉素、鏈霉素、環(huán)丙沙星具有抗性；植物乳桿菌R2-5和R2-7對慶大霉素具有抗性，對利福平中度敏感，而R4-2對慶大霉素和利福平均敏感；植物乳桿菌R2-5和R4-2均對青霉素G具有抗性，而植物乳桿菌R2-7對青霉素G敏感。與LGG相比，植物乳桿菌對鏈霉素、利福平和克林霉素表現(xiàn)出更大的抗性。

表3 菌株對常見抗生素的敏感性Table 3 Sensitivity of strains to common antibiotics

2.3.2 質(zhì)粒檢測

以含有質(zhì)粒的植物乳桿菌和LGG為對照菌株，對植物乳桿菌R2-5、R2-7和R4-2進(jìn)行質(zhì)粒提取，結(jié)果如圖4所示。植物乳桿菌R2-5、R2-7和R4-2均不含有質(zhì)粒，意味著植物乳桿菌雖然對些抗生素具有抗性，但不含有質(zhì)粒，因此在這方面是安全的。

M-super DNA marker;1-含有質(zhì)粒的植物乳桿菌菌株；3-LGG;4-R2-5；5-R2-7；7-R4-2圖4 菌株質(zhì)粒提取電泳圖Fig.4 Electrophoresis graph of plasmid extraction from strains

2.3.3 氨基酸脫羧酶活性

以LGG為對照菌株，對植物乳桿菌R2-5、R2-7和R4-2進(jìn)行了氨基酸脫羧酶活性的測定，結(jié)果如表4所示。植物乳桿菌R2-5、R2-7、R4-2和LGG均不產(chǎn)生組胺、酪胺、色胺、尸胺、腐胺和苯乙胺，說明植物乳桿菌R2-5、R2-7和R4-2不具備氨基酸脫羧酶活性，即不產(chǎn)生生物胺類有害代謝產(chǎn)物。

表4 菌株產(chǎn)生物胺能力檢測Table 4 Amine production capacity of strains

2.3.4 溶血試驗(yàn)

以金黃色葡萄球菌ATCC 25923為質(zhì)控菌株， LGG為對照菌株，采用哥倫比亞血瓊脂平板法對植物乳桿菌R2-5、R2-7和R4-2進(jìn)行了溶血活性檢測，結(jié)果如圖5所示。金黃色葡萄球菌ATCC 25923菌落周圍紅細(xì)胞完全破裂，形成透明溶血環(huán)，即呈現(xiàn)β-型溶血，具有溶血活性。在劃線植物乳桿菌R2-5、R2-7、R4-2和LGG的血平板上，紅細(xì)胞完好無損，菌落周圍未形成透明溶血環(huán)，即為Y-型溶血，不具備溶血活性。

a-ATCC 25923;b-LGG;c-R2-5;d-R2-7;e-R4-2圖5 菌株溶血活性檢測Fig.5 Hemolytic activity of strains

3 結(jié)論與討論

血清膽固醇水平升高是被認(rèn)為是心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素。然而目前使用藥物是治療高膽固醇血癥最廣泛的方法，但是這些藥物中有些價(jià)格昂貴，有些有副作用。目前，益生菌已被提議作為降低血清膽固醇水平的替代方法[7]。然而，任何被認(rèn)定是益生菌的菌株都應(yīng)具備一定的基礎(chǔ)特性，如對宿主消化系統(tǒng)惡劣環(huán)境條件的耐受性，競爭性排除腸道病原菌或抑菌潛力，黏附于腸道內(nèi)壁并且在腸道定殖，進(jìn)而發(fā)揮有益作用[16]。因此，本研究以目前最被認(rèn)可的益生菌LGG為陽性對照菌株，研究了從新疆傳統(tǒng)賽里木酸奶中分離篩選出來的具有較優(yōu)基礎(chǔ)特性菌株的降解膽固醇能力，結(jié)果顯示R2-5、R2-7和R4-2對膽固醇的降解力分別為48.19%、48.92%和48.50%，均極顯著高于對照菌株LGG對膽固醇的降解率42.40%(P<0.01)。韋云路等[17]發(fā)現(xiàn)動(dòng)物雙歧桿菌LPL-RH、長雙歧桿菌TTF及植物乳桿菌LPL-1的體外膽固醇脫除率分別為23.8%、24.5%、20.9%；陳珂可等[18]從20株分離自健康人體腸道的Bifidobacteriumlactis中篩選出1株各方面均具有良好抗逆性的BifidobacteriumlactisBLa80，其膽固醇降解能力為34.56%；李堯[11]從傳統(tǒng)自然發(fā)酵食品中分離的 30 株乳酸菌篩選出4株具有較強(qiáng)降膽固醇能力的乳酸菌，融合魏斯氏菌WS1、植物乳桿菌LP2、LP3和 LP6，它們分別降膽固醇效率分別為34.06%，34.85%，30.61%和 37.15%；楊曉艷[19]從傳統(tǒng)發(fā)酵制品酸芋荷、酸豆角中篩選出具有降解膽固醇作用的優(yōu)良菌株植物乳桿菌A03 d1，膽固醇降解為35.8%；張曉磊[20]從泡菜中分離出的10株菌中篩選到1株高效降膽固醇能力的植物乳桿菌，其降膽固醇能力達(dá)到 46.27%。比較而言，植物乳桿菌R2-5、R2-7和R4-2具有較高的降解膽固醇能力。

植物乳桿菌是具有歐洲食品安全局(EFSA)的安全資格認(rèn)定(QPS)菌株，且為美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)的公認(rèn)安全(GRAS)菌株，此外它是具有文獻(xiàn)記載的食品使用史的微生物，迄今為止，大多數(shù)研究支持植物乳桿菌的安全性[21]。賽里木酸奶是新疆阿克蘇地區(qū)人們長期食用的食物，因此從中篩選出來的微生物也具有一定的安全性，然而，研究人員發(fā)現(xiàn)一些乳酸菌菌株是可能感染人類的機(jī)會(huì)致病菌，所以在將這些菌株用作益生菌之前，確定其安全性至關(guān)重要[22]。因此，本研究對植物乳桿菌R2-5、R2-7和R4-2的安全性進(jìn)行了初步評價(jià)。結(jié)果顯示：植物乳桿菌R6-3對部分抗生素具有抗性，但是通過質(zhì)粒檢測，植物乳桿菌R2-5、R2-7和R4-2中均不存在質(zhì)粒，即該菌不存在耐藥因子轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。通過對植物乳桿菌R2-5、R2-7和R4-2氨基脫羧酶活性的檢測，得出該菌不產(chǎn)生有害代謝產(chǎn)物生物胺，并且無溶血活性。因此?？沙醪脚卸ㄖ参锶闂U菌R2-5、R2-7和R4-2屬于安全性菌株。

總之，本研究對從賽里木酸奶中分離出來的具有潛在益生特性的疑似植物乳桿菌進(jìn)行了降解膽固醇能力的研究，得到3株高降解膽固醇能力的菌株，通過生理生化試驗(yàn)進(jìn)一步鑒定，確定3株菌均為植物乳桿菌。通過安全性研究(抗生素敏感性、質(zhì)粒提取、氨基酸脫羧酶活性、溶血活性)，得出這3株植物乳桿菌具備一定安全性。體外試驗(yàn)只能對菌株進(jìn)行初步評價(jià)，是否真的具有降解膽固醇功能和具有安全性，須通過體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。因此，本研究為下一步對菌株進(jìn)行體內(nèi)降解膽固醇功能的研究和應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支撐，對賽里木酸奶的推廣具有重大意義，為賽里木酸奶的工業(yè)化生產(chǎn)提供了菌種資源，為我國開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的原創(chuàng)性益生菌提供了新資源。