王亞彬，黎志偉，李長江，戴雅琪，何芬芳，鄭國棟*，楊麗聰

1(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與分離重點實驗室，江西 南昌，330045)2(福州大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州，350108)

多酚類物質(zhì)是植物的次級代謝產(chǎn)物，包括黃酮、花色苷等，廣泛存在于水果、谷物和蔬菜中，具有多種生物活性。綠原酸和沒食子酸是常見的多酚化合物，具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、抗炎、保護神經(jīng)和保護肝臟等生物活性[1-3]。維生素C是一種水溶性維生素，廣泛存在于水果和蔬菜中，具有抗氧化，抗衰老，清除有害自由基等生物活性[4]。食品中的多酚化合物及維生素類物質(zhì)必需經(jīng)過胃腸消化才能被人體吸收，參與到新陳代謝，才能發(fā)揮它們抗氧化作用，并促進人體健康[5-6]。但是多酚化合物水溶性低，導(dǎo)致其在生物體內(nèi)的有效性較低，只有5%～10%的多酚可被小腸吸收。另一方面多酚及維生素C分子有多個羥基基團，容易被氧化。因此，增加這些活性物質(zhì)的穩(wěn)定性及促進其在生物體內(nèi)利用十分必要。

納米硒(selenium nanparticles,SeNPs)是近年來備受人們關(guān)注的納米材料之一。納米硒作為藥物用于腫瘤治療已經(jīng)得到越來越多的研究，其功能化和靶向修飾可增強抗腫瘤效果[7]。與無機硒相比，納米硒毒性更低，生物活性更高，更容易被機體吸收消化[8]。本課題組前期研究表明，利用納米硒負載綠原酸、沒食子酸[9]或維生素C[10]，可有效提高其體外生物活性。人體的消化環(huán)境和過程比較復(fù)雜，極易對不同表面修飾納米硒穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，不同表面修飾納米硒在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性仍是未知的，因此研究不同表面修飾納米硒在胃腸液中的穩(wěn)定性對于其在生物體內(nèi)的應(yīng)用十分必要。

本研究通過測定體外胃腸液消化前后不同表面修飾納米硒的粒徑、表面修飾劑的殘留量以及DPPH和ABTS陽離子自由基的清除能力，比較綠原酸納米硒(CGA@SeNPs)、沒食子酸納米硒(GA@SeNPs)和維生素C納米硒(VC@SeNPs)的穩(wěn)定性和抗氧化活性。本研究可為納米硒在生物體內(nèi)的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠原酸，畢得醫(yī)藥；硼氫化鈉，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；沒食子酸、維生素C，天津永大化學(xué)試劑廠；亞硒酸鈉，鄭州紅祥化工有限公司；聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)、DPPH、NaHCO3、ABTS陽離子自由基，北京索萊寶科技有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶，大連美侖生物技術(shù)有限公司；鹽酸，南昌鑫光精細化工廠；NaOH，上海國藥集團；KH2PO4、無水乙醇，西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Moecular devices多功能酶標(biāo)儀、UV-5200型UV-可見分光光度計、恒溫水浴鍋，上海元析儀器有限公司；AUY120型電子天平，島津公司；CL-3型磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 納米材料的制備

參考文獻[11]制備CGA@SeNPs。調(diào)節(jié)亞硒酸鈉溶液pH值至5～6。先將100 μL 0.1 mmol/L的亞硒酸鈉溶液與1.6 mL 50 mmol/L綠原酸溶液混合均勻，滴加200 μL 0.1 mmol/L硼氫化鈉溶液，400 r/min攪拌30 min，直到溶液顏色變?yōu)榇u紅色，離心，即獲得CGA@SeNPs。

參照文獻[9]改進GA@SeNPs的合成方法，將2 mL 0.1 mmol/L亞硒酸鈉溶液與2 mL 0.6 mmol/L沒食子酸溶液等體積混合后，用稀鹽酸將pH值調(diào)至3.0，加熱揮干后得橙紅色固相樣品，將此樣品加超純水溶解，定容至10 mL得GA@SeNPs。

依據(jù)軟模板法[12-13]制備VC@SeNPs并適當(dāng)調(diào)整。以PVP為模板劑，維生素C為還原劑。將2 mL 0.2 mol/L維生素C溶液加入小燒杯中，并用磁力攪拌器以300 r/min的轉(zhuǎn)速輕輕攪拌，然后將1 mL 0.1 mol/L亞硒酸鈉溶液和3 mL 5.0 g/L PVP溶液滴入維生素C溶液中，攪拌至顏色由無色變至磚紅色，將所得溶液取400 μL定容至10 mL得VC@SeNPs。

1.3.2 不同表面修飾納米硒在不同pH中的穩(wěn)定性

取pH值為2、4、6、8、10 PBS緩沖液1 mL和0.5 mL 250 μg不同表面修飾劑納米硒混合，搖勻，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中保溫2 h，觀察有無聚集或沉降。各取100 μL加入酶標(biāo)板，各梯度設(shè)置3組平行測定吸光度，讀出410和490 nm處的吸光度數(shù)值，A410/A490比值的變化用于表征粒徑變化[14]。

1.3.3 體外模擬胃腸道消化

1.3.3.1 體外模擬胃消化

消化過程中，藥物在胃中的停留時間與藥物種類有關(guān)，一般在胃部的停留時間為1～3 h，最多不超過4 h[15]。根據(jù)鄒青飛等[16]的研究方法，取100 μL CGA@SeNPs、GA@SeNPs和VC@SeNPs溶液置于50 mL的離心管中，加入25 mL人工胃液，水浴4 h。分別取2 mL消化1、2、3、4 h的樣品溶液。測定納米粒子的粒徑，抗氧化能力及表面修飾劑CGA、GA和維生素C含量變化。

1.3.3.2 體外模擬腸消化

基于模擬胃消化的實驗結(jié)果，在消化2 h后，不同表面修飾納米硒的粒徑基本保持不變，因此在胃消化2 h后，進入模擬腸消化階段。根據(jù)鄒青飛等[16]的研究方法，取10 mL經(jīng)胃消化2 h后的樣品溶液于50 mL離心管中，再加入5 mL人工腸液，調(diào)pH值至7.0左右，水浴消化4 h。取2 mL消化1、2、3、4 h的樣品溶液，測抗氧化能力及表面修飾劑CGA、GA和維生素C含量變化。

1.3.4 體外模擬胃腸道消化時不同表面修飾納米硒粒徑的測量

分別在胃、腸消化 1、2、3、4 h，取200 μL胃液或胃腸液于96孔酶標(biāo)板中，每個時間段取3個孔作為平行樣。根據(jù)雙波長法，A410/A490作為納米粒徑的衡量標(biāo)準(zhǔn)[17]。

1.3.5 體外抗氧化活性的測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH清除率的測定[18]，分別取1、2、3和4 h的胃液和腸液消化樣品，實驗分組如下：空白組，每孔加入 180 μL DPPH工作液和 20 μL無水乙醇；對照組，每孔加入 180 μL無水乙醇和 20 μL含納米粒子的胃液(胃腸液)消化液；實驗組，每孔加入 180 μL DPPH工作液和 20 μL含納米粒子的胃液(胃腸液)消化液。室溫避光孵育20 min，測定其吸光度值，試驗平行測定3次。按公式(1)計算清除率：

(1)

式中：E,清除率，%；AX,樣品吸光值；A1,對照組吸光值；A0,空白組吸光值。

1.3.5.2 ABTS陽離子自由基清除能力測定

ABTS陽離子自由基清除率的測定[18]，分別取1、2、3和4 h的胃液和腸液消化樣品，實驗分組如下：空白組，每孔加入180 μL ABTS陽離子自由基工作液和 20 μL無水乙醇；對照組，每孔加入180 μL無水乙醇和 20 μL含納米粒子的胃液(胃腸液)消化液；實驗組，每孔加入 180 μL ABTS陽離子自由基工作液和20 μL含納米粒子的胃液(胃腸液)消化液。室溫避光孵育20 min，測定其吸光度值，試驗平行測定3次。根據(jù)1.3.5.1中公式(1)計算清除率。

1.3.6 表面修飾劑含量的測定

綠原酸，維生素C和沒食子酸以二倍法稀釋成不同的濃度，用紫外分光光度計測其吸光度，作標(biāo)準(zhǔn)曲線[19]。在胃腸消化的1、2、3和4 h取樣，測其吸光度，修飾物的含量用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 18.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，通過單因素方差分析和多重比較方法對數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析，P<0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同表面修飾納米硒在不同pH中粒徑的變化

根據(jù)雙波長法[19]，當(dāng)吸光度比值A(chǔ)410/A490不變時納米粒子粒徑不變，處于穩(wěn)定狀態(tài)，且比值越大，納米硒的粒徑越小，形貌越穩(wěn)定。由圖1可以看出pH值為2～6時，A410/A490的比值沒有顯著性變化，說明3種不同表面修飾納米硒顆粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。然而在pH值為8～10時，CGA@SeNPs的A410/A490的比值變?yōu)?.5，說明CGA@SeNPs納米粒子不穩(wěn)定。CGA在pH值為8～10時會發(fā)生降解[20]，因此，CGA@SeNPs與CGA性質(zhì)一致，堿性條件下會發(fā)生降解。同理在pH值為8～10時，GA@SeNPs的A410/A490的比值變化了1.0，這與吳雪釵等[21]的研究結(jié)果一致，GA在pH值為2～6時穩(wěn)定，pH值為8～10時不穩(wěn)定，堿性條件下會發(fā)生降解，所以GA@SeNPs與GA的性質(zhì)一樣。VC@SeNPs的A410/A490的比值變化了0.8，納米顆粒發(fā)生了降解，這與王樂等[22]的研究結(jié)果一致，維生素C是一種強酸性物質(zhì)，在pH值為2～6時穩(wěn)定，在pH值為8～10時不穩(wěn)定，VC@SeNPs與維生素C的性質(zhì)一樣。因此3種不同表面修飾納米硒在酸性條件下穩(wěn)定，堿性條件下不穩(wěn)定。

圖1 不同表面修飾納米硒在不同pH中粒徑變化Fig.1 Particle size changes of different surface modified nano selenium at different pH

2.2 不同表面修飾納米硒在模擬胃消化中粒徑的變化

3種不同表面修飾納米硒經(jīng)胃消化后不同時間段粒徑的變化如圖2所示，A410/A490的比值有所波動，但變化不顯著，說明3種不同修飾納米硒經(jīng)胃消化后粒徑基本維持穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)未受到破壞，這與王樂等[22]的研究結(jié)果相一致。但1～2 h時，GA@SeNPs的A410/A490的比值波動較大，相比之下，CGA@SeNPs的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。

圖2 不同表面修飾納米硒在模擬胃消化中粒徑變化Fig.2 Particle size changes of different surface modified nano selenium in simulated gastric digestion

2.3 不同表面修飾納米硒在模擬腸消化中粒徑的變化

3種不同表面修飾納米硒在模擬腸消化的不同時間段的粒徑變化如圖3所示，CGA@SeNPs的A410/A490的比值在4 h內(nèi)幾乎沒有變化，說明納米粒子在腸液中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。GA@SeNPs和VC@SeNPs在3 h內(nèi)粒徑基本沒有變化，4 h時A410/A490的比值有所波動，但變化不顯著，說明3種不同修飾納米硒經(jīng)腸消化后粒徑基本維持穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)未受到破壞，這與王樂等[22]的研究結(jié)果相一致。在3～4 h時VC@SeNPs的A410/A490比值波動較大，其次是GA@SeNPs，CGA@SeNPs的穩(wěn)定性最好。

圖3 不同表面修飾納米硒在模擬腸消化中粒徑變化Fig.3 Particle size changes of different surface modified nano selenium in simulated intestinal digestion

2.4 不同表面修飾納米硒在模擬胃腸消化后抗氧化能力的測定

2.4.1 不同表面修飾劑納米硒未消化前對DPPH的清除力

CGA@SeNPs、GA@SeNPs和VC@SeNPs在未消化前不同時間段對DPPH的清除率如圖4所示，在2 h時，3種不同修飾納米硒的抗氧化能力具有顯著性差異(P<0.05)，可看出清除率最高的是GA@SeNPs，其次是VC@SeNPs，CGA@SeNPs最低。隨著消化時間的延長，GA@SeNPs和VC@SeNPs的清除率有所提高，3 h達到最高值，CGA@SeNPs基本保持不變。

圖4 未消化前不同表面修飾納米硒的不同時間段對DPPH的清除率Fig.4 Clearance of DPPH by different surface modified nano selenium in different periods before digestion

2.4.2 不同表面修飾納米硒模擬胃消化后對DPPH自由基的清除力

CGA@SeNPs、GA@SeNPs和VC@SeNPs在模擬胃消化不同時間段對DPPH清除率的影響如圖5所示。

圖5 不同表面修飾納米硒在胃消化的不同時間段對DPPH的清除率Fig.5 Clearance of DPPH by different surface modified nano selenium in different periods of gastric digestion

3種不同表面修飾納米硒對DPPH自由基清除率具有顯著性差異(P<0.05)，可看出清除率最高的是GA@SeNPs，其次是CGA@SeNPs，VC@SeNPs最低，但相較于未消化前3種不同表面修飾納米硒的清除率有所降低，這進一步證實在模擬胃消化過程中CGA、GA和維生素C都略有降解，這與李貽等[23]的研究結(jié)果相一致。與未消化樣品相比，VC@SeNPs對DPPH自由基清除率的下降幅度最大，在3 h時下降了36.06%，其次是GA@SeNPs，下降了11.08%，CGA@SeNPs下降了1.69%，因此CGA@SeNPs經(jīng)胃消化后具有較強的抗氧化活性。

2.4.3 不同表面修飾納米硒模擬腸消化后對DPPH自由基的清除力

CGA@SeNPs、GA@SeNPs和VC@SeNPs在模擬腸消化時對DPPH的清除率如圖6所示，3種不同表面修飾納米硒對DPPH清除率具有顯著性差異(P<0.05)，1和3 h時清除率最高的是VC@SeNPs，其次是CGA@SeNPs，GA@SeNPs最低，4 h時GA@SeNPs的清除率比CGA@SeNPs高，與模擬胃消化不同，GA@SeNPs在模擬腸消化的1和3 h時清除率最低，說明GA@SeNPs的結(jié)構(gòu)較胃消化過程的穩(wěn)定性差。然而VC@SeNPs的清除率最高，說明相對于GA@SeNPs和CGA@SeNPs，VC@SeNPs在模擬腸消化中結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。與未消化的樣品相比，清除率下降幅度最大的是GA@SeNPs，在腸消化1 h時，下降了30.71%，其次是CGA@SeNPs，下降了2%，然而VC@SeNPs升高了8.57%，因此VC@SeNPs在腸消化后具有較強的抗氧活性。

圖6 不同表面修飾納米硒在腸消化的不同時間段對DPPH的清除率Fig.6 Clearance of DPPH by different surface modified nano selenium in different periods of intestinal digestion

2.4.4 不同表面修飾納米硒未消化前對ABTS陽離子自由基的清除力

CGA@SeNPs、GA@SeNPs和VC@SeNPs在未消化時對ABTS陽離子自由基的清除率如圖7所示。1和3 h時，不同表面修飾納米硒對ABTS陽離子自由基的清除率具有顯著性差異(P<0.05)，清除率最高的是GA@SeNPs,其次是CGA@SeNPs，VC@SeNPs最低。2和4 h時，GA@SeNPs清除率最高，CGA@SeNPs和VC@SeNPs的清除率接近。

圖7 未消化前不同表面修飾納米硒的不同時間段對ABTS陽離子自由基的清除率Fig.7 Clearance of ABTS cationic radical by different surface modified nano selenium in different time periods before digestion

2.4.5 不同表面修飾納米硒模擬胃消化后對ABTS陽離子自由基的清除力

CGA@SeNPs、GA@SeNPs和VC@SeNPs在模擬胃消化時對ABTS陽離子自由基的清除率如圖8所示，相對于DPPH自由基，這3種不同表面修飾納米硒對ABTS陽離子自由基的清除率力較高。1～3 h內(nèi)CGA@SeNPs、GA@SeNPs和VC@SeNPs對ABTS陽離子自由基的清除率具有顯著性差異(P<0.05)，清除率最高的是GA@SeNPs，其次是CGA@SeNPs，VC@SeNPs最低。CGA@SeNPs和GA@SeNPs在胃消化過程中對自由基的清除力基本保持不變，無顯著性變化，說明在胃消化過程中納米粒子的結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定，但VC@SeNPs對ABTS陽離子自由基清除率在3和4 h顯著上升，可能是實驗誤差造成的。相較于未消化的樣品，CGA@SeNPs和GA@SeNPs都有所提高，GA@SeNPs在1 h時提高了23.55%，CGA@SeNPs提高了9.15%，但VC@SeNPs降低了11.84%。綜上所述，GA@SeNPs在模擬胃消化中對ABTS陽離子自由基抗氧化活性最高，其次是CGA@SeNPs。

圖8 不同表面修飾納米硒在胃消化的不同時間段對ABTS陽離子自由基的清除率Fig.8 Clearance of ABTS cationic radical by different surface modified nano selenium in different periods of gastric digestion

2.4.6 不同表面修飾納米硒模擬腸消化后對ABTS陽離子自由基的清除力

CGA@SeNPs、GA@SeNPs和VC@SeNPs在模擬腸消化時對ABTS陽離子自由基的清除率如圖9所示，3 h時CGA@SeNPs、GA@SeNPs和VC@SeNPs對ABTS+清除率具有顯著性差異(P<0.05)，清除率最高的是GA@SeNPs，其次是VC@SeNPs，CGA@SeNPs最低。3種不同表面修飾納米硒在模擬腸消化過程對ABTS陽離子自由基的清除率比模擬胃消化過程要高，這與孟天夢等[24]的研究結(jié)果相一致，這是由于腸消化后負載在CGA@SeNPs、GA@SeNPs和VC@SeNPs上CGA、GA和維生素C發(fā)生了輕微的解離使得腸液中修飾劑含量增多，從而清除率上升。與未消化的樣品相比，GA@SeNPs的清除率在1 h時提高了29.48%，其次是CGA@SeNPs在2 h時提高了32%，與GA@SeNPs相近，但VC@SeNPs在4 h時則降低了30.50%。因此，CGA@SeNPs經(jīng)腸消化后抗氧化活性較好。

圖9 不同表面修飾納米硒在腸消化的不同時間段對ABTS陽離子自由基的清除率Fig.9 Clearance of ABTS cationic radical by different surface modified nano selenium in different periods of intestinal digestion

2.5 不同表面修飾納米硒在模擬胃腸消化后含量的變化

2.5.1 不同表面修飾納米硒經(jīng)胃消化后含量的變化

CGA@SeNPs、GA@SeNPs和VC@SeNPs經(jīng)胃消化后CGA、GA和維生素C含量的變化如圖10所示。CGA@SeNPs和VC@SeNPs經(jīng)胃消化后CGA和維生素C含量無明顯變化，表明CGA和維生素C在胃液中穩(wěn)定存在。然而GA@SeNPs中GA的含量有所降低，表明隨著胃消化時間的延長GA發(fā)生了一定程度的降解。其中CGA@SeNPs在1～4 h時幾乎無變化，因此，CGA@SeNPs經(jīng)胃消化后可穩(wěn)定存在。

圖10 模擬胃消化過程不同時間段表面修飾劑的濃度Fig.10 Concentration of surface modifier in different periods during simulated gastric digestion

2.5.2 不同表面修飾納米硒在腸消化后含量的變化

CGA@SeNPs、GA@SeNPs和VC@SeNPs經(jīng)腸消化后CGA、GA和維生素C含量變化如圖11所示。由圖可知在模擬腸消化的1～4 h內(nèi)3種表面修飾納米硒中CGA、GA和維生素C含量無顯著性變化，但在3～4 h時GA@SeNPs和VC@SeNPs都有所下降，VC@SeNPs下降最明顯，因此，CGA@SeNPs經(jīng)腸消化后可穩(wěn)定存在。

圖11 模擬腸消化過程不同時間段表面修飾劑的濃度Fig.11 Concentration of surface modifier in different periods of simulated intestinal digestion process

3 結(jié)論

本文利用體外胃腸道消化模型，比較3種不同表面修飾納米硒的穩(wěn)定性和抗氧化活性變化，得出CGA@SeNPs經(jīng)胃腸消化后，CGA@SeNPs結(jié)構(gòu)和含量最穩(wěn)定，與未消化的樣品相比，CGA@SeNPs在胃腸消化中抗氧化活性最好。本研究可進一步為納米硒在生物體內(nèi)的研究提供理論依據(jù)。