趙思哲，李婉瑩，李永闖，于淼淼，賴(lài)曉芳,2,3，王攀攀,2,3，于 飛，閻斌倫,2,3，吳 君，何孝鋒，高 煥,2,3

( 1.江蘇海洋大學(xué) 海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005； 2.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005； 3.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)，江蘇 南京 210014； 4.連云港市海洋與漁業(yè)發(fā)展促進(jìn)中心，江蘇 連云港，222005； 5.連云港市啟明水產(chǎn)有限公司，江蘇 連云港，222005; 6.江蘇孝豐農(nóng)業(yè)科技集團(tuán)有限公司，江蘇 鹽城 224000 )

不利環(huán)境導(dǎo)致的脅迫現(xiàn)象對(duì)水生生物而言是經(jīng)常發(fā)生的，此時(shí)它們會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)自身的生命活動(dòng)及各種酶的活性來(lái)應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫[1-4]。在所有的環(huán)境脅迫中，饑餓是水生生物最容易受到的脅迫因子之一。一般而言，當(dāng)饑餓脅迫發(fā)生時(shí)，水生生物的消化能力會(huì)隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)而變化，主要表現(xiàn)在其消化組織中一些酶的活性會(huì)發(fā)生改變[5]，同時(shí)消化器官的組織結(jié)構(gòu)及功能也會(huì)受到損傷[6]。不僅如此，饑餓脅迫也會(huì)影響水生生物的免疫功能，導(dǎo)致代謝能力下降、抗氧化能力降低[7]等現(xiàn)象的發(fā)生。饑餓脅迫對(duì)甲殼類(lèi)動(dòng)物行為學(xué)影響方面的研究也有所報(bào)道，如在凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)中的研究表明，仔蝦在饑餓前期尋食行為顯著增強(qiáng)，隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)其活動(dòng)行為明顯降低[8-9]。但在饑餓脅迫下，甲殼類(lèi)動(dòng)物的生長(zhǎng)、免疫和能量代謝方面的變化特征研究還較少。

日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeusjaponicus)屬節(jié)肢動(dòng)物門(mén)甲殼綱十足目對(duì)蝦科囊對(duì)蝦屬[10]，因其營(yíng)養(yǎng)豐富、肉質(zhì)鮮美，且易活體運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，一直以來(lái)都是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖對(duì)象之一。目前，關(guān)于日本囊對(duì)蝦在饑餓條件下的生長(zhǎng)[11]、攝食[12]、代謝[13]及性腺發(fā)育[14]等方面的研究已經(jīng)有所報(bào)道，但對(duì)于饑餓脅迫下不同組織的免疫功能和能量代謝相關(guān)酶活性變化的特征還缺少系統(tǒng)的分析。筆者以日本囊對(duì)蝦為研究對(duì)象，探究饑餓脅迫對(duì)其不同組織(肝胰腺、胃和腸道)免疫相關(guān)酶及ATP酶活性的影響，為進(jìn)一步優(yōu)化日本囊對(duì)蝦的科學(xué)、健康的養(yǎng)殖模式提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用日本囊對(duì)蝦由江蘇省連云港贛榆佳信水產(chǎn)開(kāi)發(fā)有限公司提供，平均體質(zhì)量(0.8±0.06) g，平均體長(zhǎng)(4.7±0.2) cm。隨機(jī)挑選健康、活力好的個(gè)體于1000 L養(yǎng)殖桶中暫養(yǎng)，暫養(yǎng)期間溫度為25 ℃，鹽度為28，pH為8，持續(xù)充氧。暫養(yǎng)期間日換水1/3，投喂2次(8:00和19:00)商品顆粒飼料(粗蛋白≥49.01%、粗脂肪≥7.24%)，每日投喂量為蝦體質(zhì)量的5%。投喂后1 h底部吸污。

1.2 饑餓脅迫試驗(yàn)

暫養(yǎng)3 d后選取體格健全、活力好的日本囊對(duì)蝦，平均投放到9個(gè)60 L(50 cm×40 cm×30 cm)養(yǎng)殖箱中，每個(gè)養(yǎng)殖箱中放20尾。環(huán)境條件與暫養(yǎng)條件一致。為防止個(gè)體間殘食，筆者設(shè)計(jì)了1種多層多格的格柵式養(yǎng)殖裝置，每格放置1尾個(gè)體，在每層養(yǎng)殖格柵上鋪設(shè)隔板。分別在饑餓0、3、6、9、12 d時(shí)取樣，其中0 d設(shè)置為對(duì)照組，其余時(shí)間點(diǎn)為試驗(yàn)組。每次隨機(jī)取9尾蝦，每個(gè)養(yǎng)殖箱取1尾，用吸水紙吸干體表水分，測(cè)量蝦的體長(zhǎng)、體質(zhì)量。取樣時(shí)用手術(shù)刀切開(kāi)頭胸甲的外殼，挑取胃和肝胰臟組織，從尾寬處切取約0.2 g肌肉組織，每3尾蝦的各個(gè)組織做成1個(gè)混樣進(jìn)行樣品制備。將不同組織分別置于1.5 mL的離心管中，稱(chēng)量質(zhì)量后先用液氮進(jìn)行預(yù)冷后轉(zhuǎn)置-80 ℃冰箱保存。

1.3 樣品制備

向準(zhǔn)確稱(chēng)量質(zhì)量后的組織樣品中按1 g∶9 mL的比例添加提前預(yù)冷的0.9%生理鹽水，之后在冰浴中研磨5 min，將得到的研磨液4 ℃、2500 r/min離心(離心半徑5.8 cm)10 min后吸取上清液，置于冰箱中-80 ℃保存待用。

1.4 酶活性測(cè)定

各組織的酶活性測(cè)定采用南京建成生物工程研究所試劑盒，測(cè)定項(xiàng)目包括胃、肝胰腺、肌肉3種組織中的總蛋白含量及堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、鈉鉀ATP酶(Na+-K+-ATPase)、鈣鎂ATP酶(Ca2+-Mg2+-ATPase)活性，具體檢測(cè)方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)處理

日本囊對(duì)蝦的生長(zhǎng)評(píng)定指標(biāo)選擇肥滿(mǎn)度。計(jì)算公式如下：

式中，CF是肥滿(mǎn)度，mt是各取樣時(shí)間點(diǎn)時(shí)日本囊對(duì)蝦的平均體質(zhì)量(g)，Lt是各取樣時(shí)間點(diǎn)日本囊對(duì)蝦的平均體長(zhǎng)(cm)。

利用Excel和SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，若各處理組數(shù)據(jù)具有顯著性差異，再采用鄧肯多重比較檢驗(yàn)均值對(duì)各組數(shù)據(jù)的差異性，顯著水平標(biāo)準(zhǔn)為0.05，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 饑餓脅迫對(duì)日本囊對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響

饑餓脅迫對(duì)日本囊對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響見(jiàn)圖1。在饑餓條件下，日本囊對(duì)蝦體質(zhì)量隨脅迫時(shí)間呈下降趨勢(shì)，除第3天外其他試驗(yàn)組數(shù)據(jù)與對(duì)照組相比均差異顯著(P<0.05)，且從第6天開(kāi)始下降趨勢(shì)更為明顯。日本囊對(duì)蝦肥滿(mǎn)度的變化趨勢(shì)同體質(zhì)量一致，這表明饑餓脅迫顯著降低了日本囊對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能(P<0.05)。

圖1 饑餓脅迫對(duì)日本囊對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響

2.2 饑餓脅迫對(duì)日本囊對(duì)蝦各組織免疫相關(guān)酶活性的影響

饑餓脅迫對(duì)日本囊對(duì)蝦免疫相關(guān)酶活性的影響見(jiàn)圖2。在胃組織中，隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)，過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，且在第3天酶活性達(dá)到最高值。過(guò)氧化氫酶活性除第6天外，其他各組與對(duì)照組之間差異顯著(P<0.05)；除第3、6天外，各組間超氧化物歧化酶活性差異顯著(P<0.05)。酸性磷酸酶、堿性磷酸酶活性均隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且各試驗(yàn)組酶活性均與對(duì)照組之間差異顯著(P<0.05)。在肝胰腺組織中，過(guò)氧化氫酶活性先升后降，且在第3天達(dá)到最高值并與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)；酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶活性均隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)下降，在第12天降至最低，其中堿性磷酸酶活性下降幅度最大；各試驗(yàn)組酶活性與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。在肌肉組織中，各免疫相關(guān)酶活性的變化情況與肝胰腺組織相類(lèi)似，除過(guò)氧化氫酶外，各種酶活性均隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，其中堿性磷酸酶的變化幅度最??；過(guò)氧化氫酶活性在第3天達(dá)到最高值，隨后顯著下降(P<0.05)。

圖2 饑餓脅迫對(duì)日本囊對(duì)蝦免疫相關(guān)酶活性的影響

2.3 饑餓脅迫對(duì)日本囊對(duì)蝦ATP酶活性的影響

饑餓脅迫對(duì)日本囊對(duì)蝦ATP酶活性的影響見(jiàn)圖3。在所有組織中，鈉鉀ATP酶和鈣鎂ATP酶活性均隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。

圖3 饑餓脅迫對(duì)日本囊對(duì)蝦ATP酶活性的影響

在胃組織中，鈉鉀ATP酶活性在第6天達(dá)到最高值；鈣鎂ATP酶活性在第3天達(dá)到最高并與其他各組差異顯著(P<0.05)。在肝胰腺組織中，鈉鉀ATP酶活性相較于其他組織變化幅度最大；鈣鎂ATP酶活性在第3天達(dá)到最高后開(kāi)始顯著下降(P<0.05)，并在第12天達(dá)到最低值，與對(duì)照組間差異不顯著(P>0.05)。在肌肉組織中，試驗(yàn)組鈉鉀ATP酶、鈣鎂ATP酶活性與對(duì)照組間均差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

3.1 饑餓脅迫對(duì)日本囊對(duì)蝦生長(zhǎng)性能影響

饑餓會(huì)嚴(yán)重影響水生動(dòng)物的生長(zhǎng)性能。在魚(yú)類(lèi)中，饑餓脅迫會(huì)使魚(yú)體肥滿(mǎn)度、肝體指數(shù)及性腺指數(shù)顯著降低(P<0.05)[15]，還會(huì)對(duì)生殖系統(tǒng)造成損傷[16-17]。在蝦類(lèi)中的研究結(jié)果也與之相類(lèi)似。莫桑比克草蝦(Penaeusmonodonmozambique)在饑餓脅迫下體質(zhì)量顯著降低，同時(shí)肌肉中粗脂肪和粗蛋白的含量也顯著降低[18]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，饑餓對(duì)日本囊對(duì)蝦生長(zhǎng)發(fā)育具有顯著的影響，其體質(zhì)量和肥滿(mǎn)度隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而顯著下降(P<0.05)，這是由于日本囊對(duì)蝦在饑餓前期利用體內(nèi)儲(chǔ)存的蛋白質(zhì)和脂肪聯(lián)合供能，而在后期則全部由蛋白質(zhì)提供能量[13]，消耗體內(nèi)儲(chǔ)存的能量來(lái)維持生理活動(dòng)導(dǎo)致了生長(zhǎng)性能的降低。該結(jié)論與對(duì)凡納濱對(duì)蝦的研究結(jié)果[19]類(lèi)似。

3.2 饑餓脅迫對(duì)日本囊對(duì)蝦免疫相關(guān)酶活性的影響

過(guò)氧化氫酶是一種末端氧化酶，在自然界中廣泛分布在動(dòng)植物及微生物體內(nèi)，在生物防御系統(tǒng)里擔(dān)任著重要的角色。過(guò)氧化氫酶可以清除生物體內(nèi)過(guò)量的過(guò)氧化氫，并將其分解為水和氧氣，防止細(xì)胞發(fā)生病變。在動(dòng)物體內(nèi)，過(guò)氧化氫酶還可以降低細(xì)胞中的應(yīng)激反應(yīng)，在宿主受到外界的刺激或脅迫時(shí)起到抵御和保護(hù)的作用[20]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)，日本囊對(duì)蝦的胃、肝胰腺、肌肉組織中過(guò)氧化氫酶活性呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，這與口蝦蛄(Oratosquillaoratoria)在饑餓脅迫下的表現(xiàn)[21]一致。在饑餓條件下，由于受到外界環(huán)境脅迫，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，此時(shí)過(guò)氧化氫酶在被誘導(dǎo)的情況下上調(diào)活性以維持機(jī)體的穩(wěn)定，因此在饑餓第3天酶活性達(dá)到最高值，肝胰腺作為機(jī)體免疫的重要組織器官，其酶活性上調(diào)最為顯著；隨著脅迫時(shí)間的推移，此時(shí)機(jī)體已難以承受外界環(huán)境的脅迫，日本囊對(duì)蝦各組織的抗氧化系統(tǒng)已經(jīng)造成一定的損傷，還原自由基的能力下降，代謝紊亂，導(dǎo)致機(jī)體免疫能力下降，酶的活性也呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)。這與中華鰲絨蟹(Eriocheirsinensis)在饑餓狀態(tài)下的表現(xiàn)一致[22]。

堿性磷酸酶是一種常見(jiàn)的非特異性磷酸酯酶，其主要任務(wù)是通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體的新陳代謝，參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝活動(dòng)，同時(shí)參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，維持生命活動(dòng)需要[23-24]。當(dāng)機(jī)體處于脅迫狀態(tài)下，堿性磷酸酶活性會(huì)隨之發(fā)生一定的變化以幫助機(jī)體適應(yīng)環(huán)境[25]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在饑餓脅迫下，日本囊對(duì)蝦胃、肝胰腺、肌肉組織中的堿性磷酸酶活性隨著時(shí)間延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，這表示隨著饑餓時(shí)間的增加，日本囊對(duì)蝦的免疫能力下降，體內(nèi)堿性磷酸酶活性受到抑制，尤其是在肝胰腺組織中，酶活性下降趨勢(shì)與其他兩個(gè)組織相比極為顯著。相同的結(jié)果在口蝦蛄、仿刺參(Apostichopusjaponicus)中也有報(bào)道[26]。酸性磷酸酶同堿性磷酸酶，可以在生物活動(dòng)中調(diào)節(jié)磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝，是一種重要的水解酶。本試驗(yàn)中，饑餓脅迫對(duì)日本囊對(duì)蝦胃、肝胰腺、肌肉組織中的酸性磷酸酶活性的影響非常顯著，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)均呈下降的趨勢(shì)，與堿性磷酸酶的變化趨勢(shì)一致。在饑餓狀態(tài)下，機(jī)體會(huì)消耗自身能量導(dǎo)致免疫功能下降，這也是酸性磷酸酶活性會(huì)隨饑餓時(shí)間延長(zhǎng)而下降的原因[27]。

超氧化物歧化酶是一種穩(wěn)定性很高的酸性蛋白，在細(xì)胞和組織中承擔(dān)著清除超氧化陰離子自由基的角色，對(duì)降低機(jī)體氧化損傷有至關(guān)重要的作用[28]。當(dāng)機(jī)體處于脅迫狀態(tài)時(shí)，體內(nèi)的免疫細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生自由基物質(zhì)來(lái)清除外來(lái)入侵物；但當(dāng)免疫反應(yīng)過(guò)度時(shí)，這種非特異性免疫反應(yīng)會(huì)無(wú)法分辨“敵我”，對(duì)蛋白質(zhì)、核酸、脂肪等生命基本分子進(jìn)行攻擊，造成機(jī)體損傷[29-30]。在同一對(duì)象的不同組織中超氧化物歧化酶的含量也會(huì)不一致，在一般情況下肝臟部位的含量最高，這也與本試驗(yàn)結(jié)果一致。本試驗(yàn)結(jié)果表明，日本囊對(duì)蝦胃組織中的超氧化物歧化酶活性隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)，并在饑餓第3天達(dá)到最高值，這有可能是因?yàn)椋簷C(jī)體受到饑餓脅迫時(shí)免疫系統(tǒng)自動(dòng)開(kāi)啟來(lái)應(yīng)對(duì)脅迫，酶活性增強(qiáng)；隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，機(jī)體免疫能力已無(wú)法和外界脅迫相平衡，機(jī)體的能量也被消耗殆盡，酶活性下降。而在肝胰腺、肌肉組織中的超氧化物歧化酶活性隨著饑餓脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)為下降的趨勢(shì)，這有可能是由組織特異性所致。

3.3 饑餓脅迫對(duì)日本囊對(duì)蝦鈉鉀ATP酶和鈣鎂ATP酶活性影響

鈉鉀ATP酶與鈣鎂ATP酶都是存在于細(xì)胞膜內(nèi)的蛋白，其作用是物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換及信息傳遞等，它們是反映機(jī)體生長(zhǎng)狀況、滲透調(diào)節(jié)和生理代謝的重要指標(biāo)。鈉鉀ATP酶能催化三磷酸腺苷的水解從而提供能量，使位于細(xì)胞膜兩側(cè)的鈉離子、鉀離子進(jìn)行對(duì)向運(yùn)輸，對(duì)于機(jī)體調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓和離子平衡的生理活動(dòng)有重要的調(diào)節(jié)作用[31-32]；鈣鎂ATP酶能夠影響肌肉的收縮、神經(jīng)細(xì)胞動(dòng)作電位的傳導(dǎo)、細(xì)胞的分泌和繁殖。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，日本囊對(duì)蝦各組織中鈉鉀ATP酶和鈣鎂ATP酶活性均呈先升后降的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)椋涸陴囸I脅迫下，機(jī)體調(diào)動(dòng)儲(chǔ)存在體內(nèi)的糖原、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等物質(zhì)來(lái)為自身供能以維持生命，此時(shí)線(xiàn)粒體供能需求增加，酶的活性經(jīng)誘導(dǎo)后發(fā)生上調(diào)；在饑餓脅迫后期，一方面儲(chǔ)存的供能物質(zhì)被消耗殆盡，另一方面機(jī)體免疫系統(tǒng)遭受到破壞，產(chǎn)生的自由基極易使ATP酶中富含的賴(lài)氨酸、蛋氨酸、色氨酸等發(fā)生修飾反應(yīng)，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，降低酶活性；同時(shí)饑餓脅迫后期脂質(zhì)過(guò)氧化使細(xì)胞膜發(fā)生損傷，破壞膜的完整性和流動(dòng)性，酶活性也隨之下降。

4 結(jié) 論

綜上所述，饑餓脅迫會(huì)對(duì)日本囊對(duì)蝦的生長(zhǎng)、免疫及能量代謝能力產(chǎn)生顯著影響，并且在胃、肝胰腺、肌肉組織中不同的酶活性會(huì)因組織特異性呈相同或不同的變化趨勢(shì)。筆者對(duì)日本囊對(duì)蝦饑餓逆境的調(diào)節(jié)機(jī)制的研究結(jié)果，可為今后在養(yǎng)殖過(guò)程中制定更科學(xué)、更適量地投喂模式與策略提供一些先行的理論基礎(chǔ)，以期提高日本囊對(duì)蝦的養(yǎng)殖存活率和養(yǎng)殖產(chǎn)量，并為進(jìn)一步優(yōu)化日本囊對(duì)蝦的養(yǎng)殖模式提供參考。