錢 逸，許沁宇，錢 龍，艾 濤，向 偉，胡伯林，王 軍，王成輝

( 1.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306； 2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，新疆 烏魯木齊 830002 )

魚類腸道是重要的消化吸收器官，而腸道微生物是其重要的組成部分，其在腸道內(nèi)的定殖和穩(wěn)態(tài)對(duì)宿主具有重要意義，在食物消化、營養(yǎng)吸收、免疫抗病等方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用，對(duì)魚類生長(zhǎng)發(fā)育具有不可替代的作用[7-8]。魚類的生活環(huán)境、飼料來源、發(fā)育時(shí)期、生理狀態(tài)等因素均會(huì)對(duì)其腸道微生物組成產(chǎn)生影響，如不同環(huán)境下生長(zhǎng)或不同生長(zhǎng)時(shí)期的魚類腸道微生物組成有明顯差異[9-11]。陳孝煊等[12]研究發(fā)現(xiàn)，水體的鹽度和溫度均會(huì)影響魚類的腸道菌群結(jié)構(gòu)的形成。其次，在河流、湖泊等大型水體中，水流速度較快，有機(jī)質(zhì)含量相對(duì)較少，而在養(yǎng)殖水體中，水流較緩、投喂飼料單一且固定、養(yǎng)殖密度大等使有機(jī)質(zhì)含量相對(duì)野生環(huán)境較豐富。李秀玲等[13]分析不同脂肪源對(duì)魚類腸道菌群的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，飼料中脂肪源類型可以改變魚類腸道微生物的多樣性和豐富度。目前，腸道微生物的研究已在魚類的飼料開發(fā)、養(yǎng)殖管理等方面發(fā)揮著越來越重要的作用。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

1.2 DNA提取和16S rRNA測(cè)序

使用DNA提取試劑盒(TIANamp Genomic DNA Kit血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒)對(duì)20個(gè)腸道樣品進(jìn)行DNA抽提，利用NanoDrop 2000平臺(tái)測(cè)定DNA的濃度與純度。對(duì)檢測(cè)合格的DNA，利用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物對(duì)16S rRNA基因的V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。構(gòu)建配對(duì)末端測(cè)序文庫(PE300)并在Illumina MiSeq(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)上進(jìn)行測(cè)序。

1.3 測(cè)序數(shù)據(jù)處理與分析

原始測(cè)序序列使用Fastp v0.19.6軟件質(zhì)控和過濾低質(zhì)量的序列，利用Flash v1.2.11軟件對(duì)測(cè)序獲得的成對(duì)序列進(jìn)行拼接。拼接后的序列使用Uparse軟件，按照97%相似性對(duì)非重復(fù)的序列進(jìn)行運(yùn)算分類單元聚類。采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)運(yùn)算分類單元代表序列進(jìn)行注釋和分類學(xué)分析。使用Mothur 1.30.2軟件計(jì)算各組的Alpha多樣性指數(shù)。而組間的差異菌群使用Wilcox秩和檢驗(yàn)的方法，進(jìn)行顯著性差異檢驗(yàn)，以P<0.05為顯著差異。Beta多樣性分析利用QIILME軟件進(jìn)行計(jì)算，基于abund_jaccard距離，利用主坐標(biāo)分析進(jìn)行組間樣本腸道菌群結(jié)構(gòu)的展示，并結(jié)合相似性分析(ANOSIM)檢驗(yàn)評(píng)估菌群結(jié)構(gòu)差異的顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 樣本序列統(tǒng)計(jì)

圖1 野生丁和養(yǎng)殖丁各樣本腸道內(nèi)容物的稀釋曲線

圖2 野生丁和養(yǎng)殖丁腸道微生物運(yùn)算分類單元的分布維恩圖

2.2 腸道微生物多樣性分析

圖3 野生丁和養(yǎng)殖丁腸道微生物的Beta多樣性分析

表1 野生丁和養(yǎng)殖丁腸道微生物Alpha多樣性的統(tǒng)計(jì)分析

2.3 野生丁和養(yǎng)殖丁腸道微生物組成和差異

圖4 野生丁和養(yǎng)殖丁腸道菌群在門水平上的組成和豐度(a)及Wilcoxon秩和統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)(b)

圖5 野生丁和養(yǎng)殖丁腸道菌群在屬水平上的組成和豐度(a)及Wilcoxon秩和統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)(b)

圖6 種水平下，野生丁和養(yǎng)殖丁腸道菌群Wilcoxon秩和統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)

3 討 論

3.1 門水平下腸道菌群結(jié)構(gòu)

3.2 屬水平下腸道菌群結(jié)構(gòu)

4 結(jié) 論