單子龍, 祝明杰, 寧 偉, 吳炫燁

(1.上海大學(xué) 微電子學(xué)院，上海 200000； 2．上海微技術(shù)工業(yè)研究院，上海 200000)

0 引 言

近年來(lái)，隨著微流控芯片的發(fā)展，微流控液滴技術(shù)逐步走進(jìn)人們的視野，其為一種研究尺寸可以小至120 μm的微液滴的生成、操控及應(yīng)用的新技術(shù)[1,2]。互不相容的2種液體分別作為連續(xù)相和分散相，通過(guò)微流控法使分散相液體分散在連續(xù)相液體中形成液滴[3]。微液滴常作為微反應(yīng)單元，能夠完成生化反應(yīng)、試劑快速融合等功能，對(duì)微流控芯片的低消耗、自動(dòng)化和高通量等優(yōu)點(diǎn)起到了大大的增強(qiáng)作用。隨著微流控與MEMS技術(shù)的不斷發(fā)展，微流控液滴技術(shù)在生物工程、化學(xué)分析、疾病防護(hù)、細(xì)胞研究、藥物傳輸和材料合成等眾多領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[4～7]，并發(fā)揮著重要作用。

目前,有很多微液滴的制備方法，主要有膜乳化法[8,9]、逐層沉積法[10]、高速攪拌法[11]、界面聚合法[12]等，這些傳統(tǒng)的制備方法通常需要特定的乳液合成配方和多步驟處理，并且對(duì)復(fù)雜結(jié)構(gòu)的微液滴的各部分無(wú)法進(jìn)行精確調(diào)控。此外，由于傳統(tǒng)合成工藝的自身局限性，造成了剪切力的可變性高，形成的微液滴尺寸和形態(tài)有很大差異?，F(xiàn)在主流的液滴生成方法是微流控法。微流控芯片作為生成液滴的主要載體，具有體系封閉、生成液滴速度快，體積小等優(yōu)勢(shì)。

本文主要研究一種新的微流控法制備微液滴，采用微流控芯片與MEMS半導(dǎo)體技術(shù)結(jié)合的方法制備微液滴，符合當(dāng)今生物化學(xué)分析處于微型化和集成化的發(fā)展潮流。本文系統(tǒng)研究了噴孔位置、分散相黏度、分散相與MEMS半導(dǎo)體芯片的接觸角等因素對(duì)液滴生成的影響，形成了能夠生成尺寸穩(wěn)定，數(shù)量多，體積小至皮升(pL)級(jí)液滴的新型液滴生成方法，該方法能夠?yàn)閿?shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)提供一個(gè)新的平臺(tái)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

Rushmore MEMS半導(dǎo)體芯片(上海微技術(shù)工業(yè)研究院)；T100 Thermal Cycler PCR儀(美國(guó)伯樂(lè)Bio-Rad公司)；LS-dPCR數(shù)字PCR閱片儀(北京凌云光技術(shù)集團(tuán)有限責(zé)任公司)；LAS 60接觸角測(cè)量?jī)x(德國(guó)勞達(dá))。

液滴生成試劑和液滴生成油(美國(guó)Bio-Rad公司)；甘油(西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司)；聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)(上海泰坦科技股份有限公司)；明膠(西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司)；酒精(西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司)；海藻糖(西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司)；實(shí)驗(yàn)室使用水為去離子水(細(xì)胞培養(yǎng)級(jí))。

1.2 微流控芯片設(shè)計(jì)與制備

1.2.1 設(shè)計(jì)原理

本文采用的主要是熱發(fā)泡噴墨打印技術(shù)，其原理如圖1所示。裝置主要分為薄膜加熱電阻，噴嘴(吸取水相)，油相儲(chǔ)存區(qū)3部分(圖1(a))。加熱電阻能夠瞬間將水相噴出區(qū)域中的水相加熱至300 ℃以上，形成無(wú)數(shù)微小氣泡(圖1(b))；氣泡以極快的速度聚集成為大氣泡并擴(kuò)展，迫使噴嘴中的水相從噴嘴中噴出進(jìn)入油相形成油包水微液滴(圖1(c))；氣泡再繼續(xù)成長(zhǎng)幾秒后，便會(huì)消失，然后由于水相的表面張力所產(chǎn)生的吸力，會(huì)把新的水相拉引到水相噴出區(qū)準(zhǔn)備下次的循環(huán)噴射(圖1(d))。采用該原理可以得到體積更小，形成頻率更高，數(shù)量更多的微液滴。

圖1 熱發(fā)泡噴墨打印原理

1.2.2 微流控芯片設(shè)計(jì)

基于設(shè)計(jì)原理進(jìn)行微流控芯片的設(shè)計(jì)，結(jié)構(gòu)如圖2(a)所示，整體尺寸：長(zhǎng)度為27.05 mm，寬度為17 mm，厚度為4.5 mm；孔道直徑為1 mm。該芯片能夠儲(chǔ)存20 μL的試劑。溝槽結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)是為了涂敷膠水便于進(jìn)行封裝。

收集腔的整體尺寸：長(zhǎng)度為22 mm；寬度為10 mm；厚度為3.25 mm。有2個(gè)對(duì)稱分布直徑為1 mm的液孔。含有2個(gè)腔室，下腔室用于儲(chǔ)存油相和收集微液滴，下腔室不是簡(jiǎn)單的長(zhǎng)方形槽，是為了避免微液滴積聚在角落不能夠被吸出參與檢測(cè)，造成結(jié)果不準(zhǔn)確。上腔室是為了收集液孔中流出的溶液，減少微液滴的不必要損失(圖2(b))。

圖2 結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

液滴發(fā)生器功能的實(shí)現(xiàn)需要將半導(dǎo)體芯片上的加熱電阻連接到控制電路上，需要與26個(gè)接口進(jìn)行連接，設(shè)計(jì)出含有26個(gè)頂針孔的卡槽結(jié)構(gòu)(圖2(c))，液滴發(fā)生器固定在卡槽中，上面的接口要充分與頂針接觸，只靠其自身重力無(wú)法實(shí)現(xiàn)完全的有效連接，需要一卡夾壓緊液滴發(fā)生器(圖2(d))，在卡夾與液滴發(fā)生器接觸的地方貼上橡膠墊，使兩者的接觸為軟接觸，壓得更緊更牢?？▕A與卡槽機(jī)械配合，卡夾可以轉(zhuǎn)動(dòng)使用，方便液滴發(fā)生器的安裝和取出。整個(gè)微液滴形成裝置如圖2(e)所示，按照其組裝，連接電源即可完成液滴生成。

本文中的液滴發(fā)生器需要一定的封裝手段來(lái)完成其功能的實(shí)現(xiàn)。將微流控芯片、MEMS半導(dǎo)體芯片和收集腔封裝成一個(gè)密封性良好的整體。

1.3 微型液滴制備與檢測(cè)

微型液滴的形成是結(jié)合微流控與MEMS半導(dǎo)體技術(shù)，利用熱發(fā)泡噴墨打印原理形成微液滴。微液滴的制備流程如圖3(a)所示，MEMS半導(dǎo)體芯片有640個(gè)噴嘴用于形成微型液滴。微流控芯片和收集腔的材料選擇為透明PC，因?yàn)?該材料具有良好的耐溶劑性、耐老化性、尺寸穩(wěn)定性、電化學(xué)性，且強(qiáng)度高、蠕變性小。透光性好可以直接觀察液滴的流動(dòng)狀況。封裝好的液滴發(fā)生芯片放入控制器的卡槽中連接電路，通過(guò)軟件可控制液滴的形成，可生成體積為24 pL的微型液滴。

可將該生成液滴的技術(shù)應(yīng)用于數(shù)字PCR，將微型液滴作為一個(gè)反應(yīng)單元，經(jīng)過(guò)PCR儀擴(kuò)增，將反應(yīng)單元中的目的基因指數(shù)級(jí)擴(kuò)增；將擴(kuò)增后的液滴打進(jìn)結(jié)果閱讀芯片中，它的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)能將微型液滴平鋪在其內(nèi)部流道中，結(jié)果閱讀芯片放入光學(xué)檢測(cè)儀器中，進(jìn)行微型液滴形貌與熒光信號(hào)的檢測(cè)(檢測(cè)過(guò)程如圖3(b))。

圖3 微液滴的制備流程和檢測(cè)過(guò)程

2 結(jié)果與討論

2.1 噴孔位置對(duì)微液滴形成的影響

本文所使用的MEMS半導(dǎo)體芯片有兩排噴孔，每排噴孔數(shù)有320個(gè)，并排相鄰的噴孔間隔很小(即加熱電阻相距很近)。進(jìn)行了噴孔總數(shù)為40個(gè)，間距為21.5，64.5，107.5 μm的實(shí)驗(yàn)，為了進(jìn)一步分析液滴的生成狀況，分別對(duì)3組不同間距得到的微液滴明場(chǎng)圖進(jìn)行圖像處理，得到的結(jié)果如圖4(a)，可以看出,幾乎可以識(shí)別出所有微液滴，這有利于微液滴的統(tǒng)計(jì)。然后對(duì)圖像處理的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。為了比較微液滴生成狀況的不同，進(jìn)而引入變異系數(shù)(coefficient of variance,CV)值(微液滴尺寸標(biāo)準(zhǔn)偏差與尺寸平均數(shù)的比)進(jìn)行比較。如圖4(b)為不同間距下的微液滴尺寸的CV值，該系統(tǒng)所得到的微液滴平均尺寸在30～34 μm，從圖4(b)中可以得到，噴孔間距為21.5 μm的CV值為11.7 %；間距為64.5 μm的CV值為10.00 %；間距為107.5 μm的CV值為10.80 %。

圖4 圖像處理與CV值折線

調(diào)整噴孔位置對(duì)均勻度有所優(yōu)化，但持續(xù)的增加間隔并不能使均勻度得到進(jìn)一步優(yōu)化。由于該形成液滴的原理采用的是熱發(fā)泡噴墨打印技術(shù)，使用間距為21.5 μm的噴孔噴射形成微液滴時(shí)，加熱電阻距離近，會(huì)對(duì)相鄰的噴孔產(chǎn)生影響，從而產(chǎn)生衛(wèi)星液滴，使CV值變大。當(dāng)使用間距更大的噴孔時(shí)，削弱了相鄰加熱電阻的影響，能夠減少衛(wèi)星液滴的產(chǎn)生，由于相鄰加熱電阻的影響并不是很強(qiáng)，再增加間距并不能再對(duì)液滴的形成有影響。

2.2 黏度對(duì)微液滴形成的影響

通過(guò)增加分散相中溶質(zhì)的百分含量來(lái)調(diào)控黏度的大小，進(jìn)行了4種不同試劑分散相的實(shí)驗(yàn)。如圖5(a)所示，分別是增加PEG600、PEG1000、PEG8000、甘油的百分含量所對(duì)應(yīng)的黏度折線圖，從圖中可知：隨著含量的增加，黏度會(huì)逐漸升高。對(duì)不同含量的PEG600進(jìn)行液滴生成，生成狀況如圖5(b)。0.4 % PEG600的黏度為1.28 Pa·s，平均直徑為33.12 μm，CV值為10.66 %；2 % PEG600的黏度為1.40 Pa·s，平均直徑為33.93 μm，CV值為12.27 %；10 % PEG600的黏度為2.29 Pa·s，平均直徑為35.17 μm，CV值為14.37 %。分析可得：當(dāng)黏度越大，形成的微液滴平均尺寸會(huì)越大，并且均勻度會(huì)變差。黏度大于2.5 Pa·s后，幾乎無(wú)法從噴孔中噴出液滴。黏度會(huì)對(duì)氣泡的產(chǎn)生起抑制作用，黏度越大，氣泡的最大體積和持續(xù)時(shí)間越短。當(dāng)黏度大于2.5 Pa·s時(shí)，加熱電阻不足以產(chǎn)生使其噴出的力，因此無(wú)法形成液滴。

圖5 黏度和CV值折線

2.3 芯片材料潤(rùn)濕性能對(duì)微液滴形成的影響

不同分散相與MEMS半導(dǎo)體芯片上干膜的接觸角不同，會(huì)對(duì)固液界面相互作用的自由能有所影響，測(cè)量部分可形成微液滴的分散相與干膜的接觸角(后面直接簡(jiǎn)稱溶液的接觸角)，通過(guò)觀察液滴形成的狀況，來(lái)判斷其對(duì)微液滴形成的影響。由于每次接觸角的測(cè)量會(huì)受各種條件的影響，采用幾乎不會(huì)變化的去離子水作為參照物，每次先進(jìn)行去離子水與干膜的接觸角的測(cè)量(圖6(a))。對(duì)實(shí)驗(yàn)中常用的幾種試劑的接觸角進(jìn)行了測(cè)量(圖6(b))，發(fā)現(xiàn)：水凝膠的接觸角與去離子水相差10.13°，形成微液滴的效果最好， PEG的接觸角與去離子水相差更小，海藻糖溶液的接觸角與去離子水相差更大，他們形成的液滴相對(duì)較差。為了進(jìn)一步分析4種試劑形成微液滴的狀況，進(jìn)行了液滴尺寸的統(tǒng)計(jì)計(jì)算(如圖6(c))，分別為美國(guó)Bio-Rad公司丙烯酰胺溶液、PEG溶液、海藻糖溶液、明膠(GM)溶液。從數(shù)據(jù)可以明顯看出,水凝膠溶液的CV值為5.57，液滴大小的均勻度遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于其他3種溶液(分別為11.77 %，10.66 %，11.39 %)。

圖6 4種試劑形成微液滴的狀況

為了進(jìn)一步探討接觸角對(duì)微液滴形成的影響，測(cè)量了不同試劑、不同含量與干膜的接觸角(圖7(a))。從圖7(b)中可以看出：與去離子水接觸角相差-5～12°范圍內(nèi)形成液滴最好；-15～-5°形成的液滴含有很多衛(wèi)星液滴；大于12°和小于-15°形成的液滴會(huì)出現(xiàn)很多大液滴包含小液滴的現(xiàn)象。

圖7 接觸角對(duì)微液滴形成的影響

3 結(jié) 論

綜上所述，開(kāi)發(fā)了一種新型的液滴生成方式，克服了現(xiàn)有液滴生成方式產(chǎn)生液滴不穩(wěn)定，且液滴量比較少等難題，能夠產(chǎn)生尺寸穩(wěn)定，數(shù)量多，體積小至皮升級(jí)的液滴，將該技術(shù)應(yīng)用于數(shù)字PCR能夠大大的提高其靈敏度。本文探討了影響微液滴的幾種因素，通過(guò)控制噴孔位置、分散相的黏度以及其與MEMS半導(dǎo)體上干膜的接觸角大小，可以獲得大量的CV值低于6 %的微液滴。這種液滴生成方式在數(shù)字PCR技術(shù)有巨大的應(yīng)用潛力，能夠在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的微型液滴，并且密封良好，能夠有效避免數(shù)字PCR試劑的污染，對(duì)于液滴數(shù)字PCR是個(gè)全新的，更好的平臺(tái)，而且能夠?yàn)樾⌒鸵惑w化數(shù)字PCR儀的研究提供可能。