甘燕玲，吳伊雪， 龐樹(shù)旺，陳麗丹

(1.鄭州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 鄭州 450000；2.南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510010；3.鄭州頤和醫(yī)院超聲科，河南 鄭州 450000)

金屬離子型無(wú)機(jī)抗菌生物材料被廣泛應(yīng)用于臨床治療，綜合考慮其安全性、實(shí)用性和抗菌效果等因素，目前應(yīng)用的抗菌金屬離子主要有銀離子(Ag+)、銅離子(Cu2+)和鋅離子(Zn2+)，其均具有耐熱性、持久性、連續(xù)性和安全性等優(yōu)點(diǎn)。金屬離子型無(wú)機(jī)抗菌生物材料可以通過(guò)調(diào)整無(wú)機(jī)生物材料的結(jié)構(gòu)和性能來(lái)調(diào)控金屬離子的釋放速度，使其具有緩釋、控釋的功能，能夠在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)保持有效的滅菌濃度，從而達(dá)到提高抗菌生物材料使用壽命的目的，這也是金屬離子型無(wú)機(jī)抗菌生物材料成為研究熱點(diǎn)的原因。但目前金屬離子抗菌作用的相關(guān)研究多在細(xì)菌中進(jìn)行，關(guān)于真菌的研究大多只針對(duì)白色念珠菌展開(kāi)。研究顯示，Ag+對(duì)白色念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌5種真菌均有較強(qiáng)的殺滅作用，將金屬銀加工成納米銀后，原子排列表現(xiàn)為介于固態(tài)和分子之間的介態(tài)，其比表面積大，顯示出明顯的表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和宏觀隧道效應(yīng)，這種活性極強(qiáng)的納米銀微粒具有超強(qiáng)的抗菌能力；Ag+可以吸附于細(xì)胞壁表面，破壞其部分生理功能，當(dāng)Ag+聚集到一定量時(shí)，可穿透細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞膜，抑制細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)酶活性，且可以破壞微生物DNA的分子結(jié)構(gòu)，使細(xì)菌無(wú)法繁殖，從而導(dǎo)致死亡[1]。Cu2+、Zn2+作為生物體中必需的微量元素也在地球上大量存在，與Ag+一樣具有良好抗菌性和生物相容性[2]。在過(guò)去的幾十年里，Ag+、Cu2+和Zn2+由于具有較強(qiáng)的廣譜抗菌活性和較低的耐藥性而廣受關(guān)注。但目前關(guān)于Ag+、Cu2+、Zn2+是否能有效殺滅或抑制真菌仍缺乏確切的證據(jù)。為了解Ag+、Cu2+和Zn2+對(duì)臨床常見(jiàn)念珠菌的抗菌作用，本研究采用平板菌落計(jì)數(shù)法觀察Ag+、Cu2+和Zn2+對(duì)白色念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌的抗菌效果，篩選出有效殺菌濃度，旨在為抗真菌材料的設(shè)計(jì)提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC-60193購(gòu)自美國(guó)Microbiologics公司，近平滑念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌均為南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室臨床標(biāo)本分離株。5種菌株均經(jīng)過(guò)法國(guó)梅里埃質(zhì)譜儀Vitek MS全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定。

1.2 主要試劑硝酸銀、氯化銅、氯化鋅3種試劑均購(gòu)自美國(guó)默克公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 金屬離子溶液的配制利用去離子水分別將硝酸銀、氯化銅和氯化鋅配制為0.1 mol·L-1的水溶液，經(jīng)0.22 μm的細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾后置于無(wú)菌容器中備用，其中硝酸銀溶液的配制避光操作，將盛放硝酸銀溶液的無(wú)菌容器用錫紙包裹避光存放。

1.3.2 念珠菌懸液的配備參照文獻(xiàn)[3]的方法，取保存的白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC-60193、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌，加入溶菌肉湯培養(yǎng)液，使用比濁儀調(diào)配菌液濁度為0.5麥?zhǔn)蠁挝?，然后使用無(wú)菌去離子水將菌液稀釋至106CFU·L-1備用。

1.3.3 Ag+、Cu2+、Zn2+抗念珠菌效果檢測(cè)取配制好的0.1 mol·L-1的硝酸銀、氯化銅和氯化鋅溶液，分別倍比稀釋為6個(gè)濃度(10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7mol·L-1)；分別取各濃度的金屬離子溶液100 μL與配制好的5種念珠菌懸液100 μL 進(jìn)行11(體積比)混合，置于96孔板中，設(shè)置6個(gè)樣本組；37 ℃培養(yǎng)48 h，吹吸混勻共培養(yǎng)液，用無(wú)菌去離子水依次稀釋100、1 000倍，隨后各吸取100 μL均勻涂抹于沙保弱真菌培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h。同時(shí)設(shè)置0 mol·L-1的空白組，即取 100 μL 滅菌去離子水置于 96 空白孔板中，加入念珠菌懸液100 μL混合，培養(yǎng)48 h后稀釋100、1 000倍，隨后各吸取100 μL均勻涂抹于沙保弱真菌培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h。每種金屬離子溶液的各個(gè)梯度濃度設(shè)置3次平行重復(fù)試驗(yàn)，記錄平板菌落數(shù)，取均值，計(jì)算殺菌率。殺菌率=(空白組菌落數(shù)-金屬離子組菌落數(shù))/空白組菌落數(shù)×100%。按照抗菌性能試驗(yàn)方法和抗菌效果標(biāo)準(zhǔn)QB/T2591規(guī)定，殺菌率≥99%為有強(qiáng)抗菌作用，殺菌率≥90%為有抗菌作用[4]。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度Ag+對(duì)5種念珠菌的抗菌效果結(jié)果見(jiàn)表1。Ag+濃度≥10-5mol·L-1時(shí)，作用于白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC-60193、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌后均無(wú)菌落生長(zhǎng)，5種念珠菌的殺菌率均為(100.00±0.00)%。Ag+濃度為10-6mol·L-1時(shí)，克柔念珠菌、光滑念珠菌無(wú)菌落生長(zhǎng)，殺菌率為(100.00±0.00)%。Ag+濃度為10-7mol·L-1時(shí)，作用于白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC-60193、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌后均有不同程度的菌落生長(zhǎng)，殺菌率均<90%。

表1 不同濃度Ag+對(duì)5種念珠菌的抗菌效果

2.2 不同濃度Cu2+對(duì)5種念珠菌的抗菌效果結(jié)果見(jiàn)表2。Cu2+濃度≥10-4mol·L-1時(shí)，作用于白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC-60193、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌后均無(wú)菌落生長(zhǎng)，5種念珠菌的殺菌率均為(100.00±0.00)%。Cu2+濃度為10-5mol·L-1時(shí)，熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌無(wú)菌落生長(zhǎng)，殺菌率均為(100.00±0.00)%。Cu2+濃度為10-6mol·L-1時(shí)，僅近平滑念珠菌的殺菌率>90%。Cu2+濃度為10-7mol·L-1時(shí)，作用于白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC-60193、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌后均有不同程度的菌落生長(zhǎng)，殺菌率均<90%。

表2 不同濃度Cu2+對(duì)5種念珠菌的抗菌效果

2.3 不同濃度Zn2+對(duì)5種念珠菌的抗菌效果結(jié)果見(jiàn)表3。Zn2+濃度≥10-3mol·L-1時(shí)，作用于白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC-60193、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌后均無(wú)菌落生長(zhǎng)，5種念珠菌殺菌率均為(100.00±0.00)%。Zn2+濃度為10-4mol·L-1時(shí)，白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC-60193、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌無(wú)菌落生長(zhǎng)，殺菌率均為(100.00±0.00)%，且光滑念珠菌殺菌率為(99.25±0.74)%。Zn2+濃度≤10-5mol·L-1時(shí)，作用于白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC-60193、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌后均有不同程度的菌落生長(zhǎng)，殺菌率均<90%。

表3 不同濃度Zn2+對(duì)5種念珠菌的抗菌效果

3 討論

利用金屬離子殺滅有害微生物的歷史十分悠久，1882年法國(guó)人Millardet成功研發(fā)出含有Cu2+殺菌作用的波爾多液，解決了困擾波爾多城多年的葡萄“霉葉病”；自20世紀(jì)90年代起，一大批新型的抗菌材料相繼問(wèn)世[5]。研究發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)抗菌劑相比，金屬離子型抗菌生物材料因具有穩(wěn)定性好、無(wú)毒性作用、抗菌活性強(qiáng)、廣譜抗菌、不產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)點(diǎn)，是近年來(lái)抗菌材料研究的熱點(diǎn)[6]。

因?yàn)榧?xì)菌和真菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)有很大差異，所以金屬離子針對(duì)細(xì)菌和真菌的抗菌機(jī)制也有所不同；金屬離子對(duì)細(xì)菌的抗菌機(jī)制有2種:(1)金屬離子帶正電，到達(dá)細(xì)菌細(xì)胞膜時(shí)，因細(xì)胞膜帶有負(fù)電荷，金屬離子能依靠庫(kù)倫引力牢固吸附細(xì)胞膜，并進(jìn)一步穿透細(xì)胞壁，導(dǎo)致細(xì)胞壁的破裂，引起細(xì)胞質(zhì)的外流，阻礙細(xì)菌的繁殖，最終導(dǎo)致細(xì)菌的死亡；(2)金屬離子能作為催化活性中心激發(fā)水或者空氣中的氧產(chǎn)生羥基自由基(-OH)及活性氧離子(O2-)，從而產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，破壞細(xì)菌的繁殖能力，致使細(xì)菌死亡；而金屬離子對(duì)抗真菌的機(jī)制是破壞細(xì)胞的通透性，使細(xì)胞內(nèi)的成分逸出，影響細(xì)胞的正常代謝，導(dǎo)致大多數(shù)的酶失活從而起到抗菌作用[7-8]。

念珠菌是真菌中最常見(jiàn)的條件致病菌，可引起皮膚黏膜淺層或全身系統(tǒng)性感染，是引起侵襲性真菌病最常見(jiàn)的病原菌。有文獻(xiàn)報(bào)道，人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后真菌感染雖少見(jiàn)，但診治復(fù)雜困難，一旦發(fā)生，后果極其嚴(yán)重，是真正的災(zāi)難性并發(fā)癥，引發(fā)感染的念珠菌以白色念珠菌最為多見(jiàn)，其次是近平滑念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌；而白念珠菌可較其他種類真菌產(chǎn)生更大、更復(fù)雜的生物膜，阻擋抗真菌藥物的滲入，造成耐藥[9]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，念珠菌常易定植于老年人上呼吸道，在氣管插管表面形成生物被膜，引起嚴(yán)重的反復(fù)感染[10]。但目前很多抗菌材料的抗菌實(shí)驗(yàn)僅采用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為檢測(cè)試驗(yàn)微生物，對(duì)真菌的抗菌性能研究很少。因此，本研究采用不同濃度的Ag+、Cu2+、Zn2+來(lái)干預(yù)白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC-60193、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌的生長(zhǎng)，觀察Ag+、Cu2+、Zn2+對(duì)白色念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌的抗菌效果，并篩選出有效殺菌濃度，以期為金屬離子型抗真菌材料的研究提供參考。

本研究結(jié)果顯示，當(dāng)Ag+濃度≥10-5mol·L-1時(shí)，對(duì)白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC-60193、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌5種念珠菌的殺菌率均達(dá)到了100%，具有強(qiáng)抗菌作用，這一結(jié)果與LI等[11]和SEFERJI等[12]的研究結(jié)果相符；即使在較低的10-6mol·L-1濃度時(shí)，Ag+對(duì)克柔念珠菌和光滑念珠菌的殺菌率也達(dá)到100%，仍有強(qiáng)抗菌作用；當(dāng)Ag+濃度為10-7mol·L-1時(shí)，對(duì)這5種念珠菌仍有一定的殺菌率，但殺菌率均<90%，此時(shí)無(wú)抗菌作用。而Cu2+濃度≥10-4mol·L-1時(shí)，對(duì)白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC-60193、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌5種念珠菌的殺菌率達(dá)到了100%，具有強(qiáng)抗菌作用；但Cu2+濃度為10-5mol·L-1時(shí)僅對(duì)熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌的殺菌率達(dá)到100%，具有強(qiáng)抗菌作用；當(dāng)Cu2+濃度為10-6mol·L-1時(shí)，僅對(duì)近平滑念珠菌具有(95.57±2.07)%的殺菌率，具有抗菌作用，對(duì)其他4種念珠菌的殺菌率均小于90%；當(dāng)Cu2+濃度為10-7mol·L-1時(shí)，對(duì)這5種念珠菌的殺菌率均<90%，不具有抗菌作用。當(dāng)Zn2+濃度≥10-3mol·L-1時(shí)，對(duì)白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC-60193、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌5種念珠菌的殺菌率達(dá)到了100%，具有強(qiáng)抗菌作用；Zn2+濃度為10-4mol·L-1時(shí)，對(duì)白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC-60193、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌的殺菌率達(dá)到了100%，且對(duì)光滑念珠菌的殺菌率≥99%，均具有強(qiáng)抗菌作用；而當(dāng)Zn2+濃度≤10-5mol·L-1時(shí)，對(duì)白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC-60193、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌的殺菌率均<90%，不具有抗菌作用。 以上結(jié)果提示，Ag+、Cu2+、Zn2+對(duì)不同的念珠菌均具有一定程度的抗菌作用，但隨著離子濃度的降低，其殺菌率不同程度下降，其中Ag+具有更強(qiáng)、更廣譜的抗菌性能。

另外，具體到不同的念珠菌，Ag+、Cu2+、Zn2+這3種金屬離子的殺菌能力也不同。對(duì)于白色念珠菌，Ag+、Cu2+、Zn2+具有抗菌作用的最低濃度分別為10-5、10-4、10-4mol·L-1，Ag+的殺菌能力強(qiáng)于Cu2+和Zn2+；對(duì)于熱帶念珠菌，Ag+、Cu2+、Zn2+具有抗菌作用的最低濃度分別為10-5、10-5、10-4mol·L-1，Ag+和Cu2+的殺菌能力相當(dāng)，二者均強(qiáng)于Zn2+；對(duì)于近平滑念珠菌，Ag+、Cu2+、Zn2+具有抗菌作用的最低濃度分別為10-5、10-6、10-4mol·L-1，三者的殺菌能力Cu2+>Ag+>Zn2+；對(duì)于克柔念珠菌，Ag+、Cu2+、Zn2+具有抗菌作用的最低濃度分別為10-6、10-4、10-4mol·L-1，Ag+的殺菌能力強(qiáng)于Cu2+和Zn2+；對(duì)于光滑念珠菌，Ag+、Cu2+、Zn2+具有抗菌作用的最低濃度分別為10-6、10-5、10-4mol·L-1，三者的殺菌能力Ag+>Cu2+>Zn2+。即對(duì)于白色念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌，Ag+的抗菌作用最強(qiáng)(有效抗菌濃度最低)，Cu2+的抗菌作用次之；而對(duì)于熱帶念珠菌，Ag+和Cu2+的抗菌作用相當(dāng)，且均強(qiáng)于Zn2+；但對(duì)于近平滑念珠菌，則Cu2+的抗菌作用最強(qiáng)(有效抗菌濃度最低)，其次為Ag+。有研究發(fā)現(xiàn)，銅可抑制生物膜的形成，而近平滑念珠菌是引起導(dǎo)管相關(guān)性感染最主要的念珠菌，如果將銅離子應(yīng)用于導(dǎo)管材料，可以降低由近平滑念珠菌引起的相關(guān)感染，對(duì)相應(yīng)的臨床治療材料的選擇有一定的指導(dǎo)意義[13-14]。

綜上所述，Ag+、Cu2+、Zn2+對(duì)白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC-60193、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌5種常見(jiàn)念珠菌的生長(zhǎng)均具有一定的抑制作用，但殺菌率隨著離子濃度的下降而下降，且同一金屬離子對(duì)不同念珠菌的最佳抗菌濃度不相同；Ag+、Cu2+、Zn2+同時(shí)對(duì)5種常見(jiàn)念珠菌均具有抗菌作用的最低濃度分別為10-5、10-4、10-4mol·L-1，其中Ag+具有更強(qiáng)、更廣譜的抗菌性能。本研究為金屬離子Ag+、Cu2+、Zn2+在抗真菌性能方面的應(yīng)用研究以及金屬離子型抗菌生物材料的設(shè)計(jì)和改進(jìn)提供了參考。