隋銘澤，萬(wàn)科成，陳玉雯，高 源，王向文

(1.海南省人民醫(yī)院兒科，海南 海口 570311；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院小兒血液科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010017)

髓外白血病(extramedullary leukemia,EML)并不少見，病情進(jìn)展的最終結(jié)果是多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)。EML患兒往往需要重癥監(jiān)護(hù)，美國(guó)加利福尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院的一項(xiàng)研究顯示，兒童惡性腫瘤約占兒科重癥監(jiān)護(hù)病房(pediatric intensive care unit,PICU)入院人數(shù)的4.2%，約占PICU死亡人數(shù)的11.4%，白血病占據(jù)其中相當(dāng)一部分比例，其PICU入住率與死亡率之間的差異可能與EML引起的MODS有關(guān)[1]。EML診療占用了大量的醫(yī)療資源，但治療效果并不理想，因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者致力于尋找EML的早期診斷標(biāo)志物并著手研發(fā)新的治療手段，這對(duì)于改善EML預(yù)后至關(guān)重要。本文就近年來(lái)EML的生物標(biāo)志物及治療進(jìn)展作一綜述。

1 EML的生物標(biāo)志物

以往對(duì)EML的評(píng)估主要依賴體格檢查、影像學(xué)檢查及有創(chuàng)操作等。然而，有相當(dāng)一部分EML患兒合并不同程度的意識(shí)障礙，甚至需要有創(chuàng)通氣，故無(wú)法離開PICU進(jìn)行外出檢查；另外白血病細(xì)胞過(guò)度增殖會(huì)抑制骨髓其他兩系造血，患兒進(jìn)行有創(chuàng)檢查有出血風(fēng)險(xiǎn)，體格檢查所能獲得的臨床證據(jù)又相當(dāng)有限。因此，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者致力于尋找安全、高效的生物標(biāo)志物來(lái)評(píng)估EML，并在蛋白標(biāo)志物、基因標(biāo)志物等領(lǐng)域獲得了一定進(jìn)展。

1.1 蛋白標(biāo)志物大多數(shù)EML的蛋白標(biāo)志物可以通過(guò)外周血檢驗(yàn)獲取陽(yáng)性結(jié)果，相比腦脊液檢查、病理活檢及影像介入等更加經(jīng)濟(jì)、方便，同時(shí)能減輕病人痛苦。另外，由于生物屏障及化學(xué)治療后微小殘留病變(minimal residual disease,MRD)的存在，相對(duì)于骨髓形態(tài)檢查，監(jiān)測(cè)外周血中蛋白標(biāo)志物水平顯然更具優(yōu)勢(shì)。

1.1.1 基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)-9MMP是鋅依賴性內(nèi)肽家族成員之一，主要參與細(xì)胞外基質(zhì)的重塑，MMP與EML的相關(guān)性研究最早可追溯到本世紀(jì)初。DIAS等[2]研究證實(shí)，MMP的2種亞型MMP-2和MMP-9有助于識(shí)別具有高侵襲性的白血病，其中MMP-9備受學(xué)者關(guān)注。MMP-9由BCR/ABL融合基因經(jīng)磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)/核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號(hào)通路介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1誘導(dǎo)產(chǎn)生，通過(guò)降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)實(shí)現(xiàn)白血病細(xì)胞的髓外浸潤(rùn)[3]。MMP-9通過(guò)上述機(jī)制引發(fā)了慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)骨髓造血干細(xì)胞由靜止向惡性增殖生態(tài)位轉(zhuǎn)化的生物學(xué)效應(yīng)；另外，MMP-9也可以通過(guò)α4β1整合素及趨化因子CXCL12在B淋巴細(xì)胞白血病的髓外浸潤(rùn)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。可見，無(wú)論在髓系白血病還是在淋巴細(xì)胞白血病，MMP-9均參與了髓外浸潤(rùn)過(guò)程，雖然諸多研究表明MMP-9在EML，特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病(central nervous system leukemia,CNSL)中具有早期診斷價(jià)值，但原發(fā)于髓外器官的惡性腫瘤組織中MMP-9升高的報(bào)道并不罕見[5-6]。盡管SCHNEIDER等[7]研究顯示，以2 450 ng·L-1MMP-9為截?cái)嘀祵?duì)EML診斷具有較高的靈敏度(靈敏度87.9%，曲線下面積 0.721)，但特異度卻不令人滿意(特異度66.7%)。綜合現(xiàn)有文獻(xiàn)，未來(lái)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)器官分泌物中MMP-9水平檢測(cè)可能為解決此類問(wèn)題提供思路及方向。

1.1.2 賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase,LOX)LOX是銅依賴細(xì)胞外分泌蛋白，其編碼基因位于5號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)3帶，在缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)刺激下LOX在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)增加[8]。目前普遍認(rèn)為，LOX參與了上皮源性惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制[9-10]。近年來(lái)臨床研究顯示，LOX參與了兒童急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)髓外浸潤(rùn)的發(fā)病過(guò)程，然而LOX水平變化在EML最初診斷和髓外復(fù)發(fā)時(shí)往往被忽略[11]。德國(guó)德雷斯頓工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院一項(xiàng)納入了683例AML患者的多中心臨床研究顯示，LOX是預(yù)測(cè)AML預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物，Cox回歸模型分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了伴有EML的AML患者血清中具有更高水平的LOX[12]。雖然目前針對(duì)LOX與EML的研究不如MMP-9成熟，但OSUMI等[13]報(bào)道的1例白血病細(xì)胞腎臟浸潤(rùn)引起的紅細(xì)胞增多癥被證實(shí)與HIF-1有關(guān)，LOX是否參與了被浸潤(rùn)器官的異常分泌或是直接參與了該器官的細(xì)胞損傷有待深入研究。

1.1.3 其他蛋白標(biāo)志物髓過(guò)氧化物酶、血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)等也參與了EML的發(fā)生機(jī)制。2010年，STEINER等[14]研究顯示，VCAM-1可協(xié)助其他細(xì)胞因子將T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，從而參與CNSL的病理過(guò)程。然而SI等[15]卻得出了截然相反的結(jié)論，即VCAM-1與CNSL的發(fā)生無(wú)相關(guān)性。更值得一提的是，經(jīng)典的心肌損傷標(biāo)志物肌鈣蛋白、氨基末端腦鈉肽前體等水平在白血病心臟浸潤(rùn)患者血清中同樣升高[16]。顯然，蛋白標(biāo)志物用于早期診斷的特異度并不能令人滿意，更適合EML的篩查，根據(jù)并聯(lián)試驗(yàn)可以提升診斷試驗(yàn)特異度的統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，蛋白標(biāo)志物聯(lián)合其他檢驗(yàn)指標(biāo)的診斷體系或?qū)⒊蔀槲磥?lái)研究的選擇。

1.2 基因標(biāo)志物隨著臨床科研的飛速發(fā)展，基因診斷逐漸成為熱點(diǎn)，基因標(biāo)志物相比蛋白標(biāo)志物更具有特異性，越來(lái)越多的研究成果揭示了EML的分子生物學(xué)機(jī)制，其中包括長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)、環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)以及微RNA(microRNA,miRNA)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)的基因表達(dá)異常。

1.2.1 lncRNA人類基因組計(jì)劃研究表明，約2%的人類基因組編碼了蛋白質(zhì)，而超過(guò)75%的人類基因組編碼了非編碼RNA。lncRNA是指具有大于200個(gè)核苷酸序列的非編碼RNA，其現(xiàn)已被證實(shí)與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[17]。最初，lncRNA在急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphocyte leukemia，ALL)中的作用機(jī)制尚不清楚，因此無(wú)法通過(guò)微陣列分析ALL患者樣本。目前，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)日趨成熟，lncRNA在ALL中的表達(dá)與細(xì)胞遺傳學(xué)異常得以證實(shí)。近10 a來(lái)的微陣列研究確定了TEL/AML1、E2A/PBX、ETV6/RUNX1等與lncRNA相關(guān)的ALL基因，同時(shí)也深入探討了這些基因在EML發(fā)病中的作用機(jī)制[18-20]。例如，Rap1信號(hào)通路不僅在急性B淋巴細(xì)胞白血病(acute B-lymphoblastic leukemia,B-ALL)中高度富集，同時(shí)也參與了急性T淋巴細(xì)胞白血病(acute T-lymphocyte leukemia,T-ALL)的組織侵襲[21-22]。XIU等[23]研究表明，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-1信號(hào)通路可增強(qiáng)白血病細(xì)胞的遷移和存活，從而實(shí)現(xiàn)白血病細(xì)胞的髓外浸潤(rùn)及免疫逃逸。另外，PI3K/PKB/NF-κB與Rap1信號(hào)通路的作用機(jī)制相似，提示了某些蛋白標(biāo)志物與 lncRNA的協(xié)同作用[24]。近年來(lái)學(xué)者發(fā)現(xiàn)了大量ALL相關(guān)的新基因，但其中與EML相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道較少，作為新興標(biāo)志物，lncRNA家族數(shù)量龐大，測(cè)序工作紛繁復(fù)雜，健全lncRNA臨床數(shù)據(jù)庫(kù)仍任重而道遠(yuǎn)。

1.2.2 circRNA最初circRNA被認(rèn)為是錯(cuò)誤剪接的結(jié)果[25]，而高通量測(cè)序的臨床應(yīng)用逐漸推翻了該猜想，近年來(lái)研究顯示，circRNA可充當(dāng)miRNA海綿參與調(diào)節(jié)親本基因的表達(dá)，circRNA失調(diào)控的可能導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展[26]。LV等[27]首次應(yīng)用circRNA微陣列和全基因組表達(dá)及生物信息學(xué)工具研究AML患者髓外浸潤(rùn)的circRNA/miRNA/基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)663個(gè)基因上調(diào)和838個(gè)基因下調(diào)，并最終確定LRRK1、PLXNB2、OLFML2A、LYPD5、APOL3、ZNF511及ASB2共7個(gè)與EML預(yù)后相關(guān)的基因標(biāo)志物。LIN等[28]深入分析了PLXNB2 基因表達(dá)過(guò)程中circRNA與EML的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，circPLXNB2表達(dá)與PLXNB2 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)，因此，circPLXNB2可作為AML新的預(yù)后預(yù)測(cè)因子和治療靶點(diǎn)。目前，circRNA與EML的相關(guān)研究多集中于AML，雖然兒童ALL患者中circRNA有關(guān)的基因標(biāo)志物已有報(bào)道，同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)了circRNA參與ALL發(fā)病的信號(hào)傳導(dǎo)通路，但 circRNA 在ALL髓外病變方面的研究成果尚未見文獻(xiàn)報(bào)道[29-30]。

1.2.3 miRNAmiRNA是具有20～25個(gè)堿基序列的非編碼RNA，在細(xì)胞分化、增殖、遷移和凋亡等過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。miRNA可作為癌基因或腫瘤抑制因子參與白血病的病理生理過(guò)程。一項(xiàng)納入了186例ALL患兒的回顧性分析顯示，無(wú)論中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累情況如何，體內(nèi)組織炎癥應(yīng)激性miRNA(miR-181a)家族表達(dá)水平在腦脊液中顯著高于骨髓及外周血，這種差異在CNSL患兒中愈發(fā)明顯，后續(xù)的隊(duì)列研究進(jìn)一步確認(rèn)了miRNA對(duì)CNSL的診斷價(jià)值[31]。該研究雖未進(jìn)一步發(fā)掘miRNA的分子機(jī)制，但很大程度上提示了miRNA有著高度的組織特異性。同樣，miRNA在AML髓外浸潤(rùn)中也發(fā)揮重要作用，JIANG等[32]研究顯示，miR-144可經(jīng)磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/c-Myc蛋白/MMP-2途徑介導(dǎo)AML的白血病細(xì)胞髓外浸潤(rùn)。值得一提的是，miRNA與lncRNA同為非編碼RNA，二者的關(guān)系類似circRNA之于miRNA的海綿作用，許多l(xiāng)ncRNA具有多個(gè)miRNA應(yīng)答元件[27，33]。另外，利用干擾小RNA敲除目的基因后EML發(fā)生率明顯降低[34]。因此，lncRNA、circRNA及miRNA在EML的發(fā)病中更像是作為一個(gè)整體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。

2 EML的治療方案

EML一直是白血病治療的難題，一方面，血液流經(jīng)全身各個(gè)臟器增加了EML風(fēng)險(xiǎn)；另一方面，化學(xué)治療藥物難以透過(guò)血腦屏障、血睪屏障等而發(fā)揮作用。最初人們嘗試通過(guò)顱腦放射治療、手術(shù)切除等治療CNSL及白血病性睪丸腫瘤，然而，對(duì)于青少年、兒童等特殊群體，放射治療的不良反應(yīng)及生殖器官切除嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和社會(huì)心理適應(yīng)能力。近年來(lái)，在多中心臨床研究及薈萃分析等循證醫(yī)學(xué)證據(jù)的支持下，抗腫瘤藥物鞘內(nèi)注射已被納入診療指南，同時(shí)，隨著越來(lái)越多的生物標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，各種類型EML的分子靶向治療正逐漸成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。

2.1 放射治療綠色瘤是AML的EML類型之一，眼眶受累最為常見，其發(fā)病隱匿，部分AML患者可以此為首發(fā)表現(xiàn)[35]。綠色瘤侵犯眼眶多伴有不同程度的組織粘連，且眼及周圍器官血流豐富，相對(duì)于外科手術(shù)，放射治療更為合適。2018年國(guó)際淋巴瘤放射腫瘤學(xué)組髓外白血病放射治療指南(綠色瘤)推薦總劑量24 Gy，分為12次連續(xù)照射，該方案適用于大多數(shù)患者，但該指南依舊認(rèn)為放射劑量的選擇應(yīng)取決于臨床情況，對(duì)于不能耐受的患者，可降低總劑量至6～20 Gy[36]。睪丸浸潤(rùn)常見于ALL，血睪屏障充當(dāng)了白血病細(xì)胞的“庇護(hù)所”，對(duì)于兒童及有生育需求的年輕患者可選擇放射治療，BAKST等[37]推薦的放射劑量為26 Gy(4～42 Gy)，約71%的患者可達(dá)到完全緩解，總生存期為24個(gè)月，且高劑量組與低劑量組的療效無(wú)顯著差異。兒童白血病性睪丸腫瘤的治療國(guó)內(nèi)指南首推放射治療，雙側(cè)睪丸放射治療劑量為20～26 Gy，嬰幼兒以12～15 Gy為宜[38]。雖然放射治療對(duì)于某些EML類型效果顯著，但電離輻射引起的損傷不可避免，甚至有繼發(fā)其他惡性腫瘤的可能[39]。

2.2 化學(xué)治療血腦屏障的存在使得靜脈輸注的化學(xué)治療藥物無(wú)法進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮細(xì)胞毒作用，因此，血液與腫瘤醫(yī)師處理CNSL的思路也有所轉(zhuǎn)變，其中CNSL的阿糖胞苷(cytosine arabinoside,Ara-C)+甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)+地塞米松(dexamethasone,DXM)三聯(lián)鞘內(nèi)注射治療方案取得了國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者的一致認(rèn)可。國(guó)內(nèi)相關(guān)規(guī)范主張初診早期即進(jìn)行CNSL防治，按不同年齡譜推薦鞘內(nèi)注射劑量，<12個(gè)月患兒給予Ara-C 12 mg+MTX 6 mg+DXM 2 mg，12～24個(gè)月患兒給予Ara-C 24 mg+MTX 8 mg+DXM 2.5 mg，>24～36個(gè)月患兒給予Ara-C 30 mg+MTX 10 mg + DXM 3 mg，>36個(gè)月患兒給予Ara-C 36 mg+MTX 12 mg+DXM 4 mg；對(duì)于腦脊液存在腰椎穿刺無(wú)損(紅細(xì)胞白細(xì)胞≤1001)且白細(xì)胞≤5×106L-1并見到明確的白血病細(xì)胞、腰椎穿刺有損(紅細(xì)胞白細(xì)胞>1001)且可見白血病細(xì)胞、腰椎穿刺有損的血性腦脊液且初診白細(xì)胞>50×109L-1之一，即腦脊液分級(jí)為2級(jí)以上者在誘導(dǎo)早期增加1～2次鞘內(nèi)給藥，共計(jì)17～26次[38]。除大劑量MTX治療外，化學(xué)治療藥物鞘內(nèi)注射對(duì)于白血病性睪丸腫瘤的治療同樣有效[40]。然而不可忽視的是，經(jīng)腰椎穿刺術(shù)鞘內(nèi)注射為有創(chuàng)操作，操作過(guò)程中會(huì)損傷血管，白血病細(xì)胞是否會(huì)進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成人為CNSL，尚有待商榷。

2.3 分子靶向治療20世紀(jì)60年代，伊馬替尼獲批上市標(biāo)志著腫瘤治療進(jìn)入分子靶向治療時(shí)代，隨著EML發(fā)病機(jī)制的逐漸明晰，越來(lái)越多潛在治療靶點(diǎn)也隨之被報(bào)道[27]。越來(lái)越多的研究表明，EML幾乎均伴隨基因水平及相關(guān)信號(hào)通路異常，在臨床研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)新的EML生物標(biāo)志物與立足于此尋找能夠逆轉(zhuǎn)癌基因表達(dá)的相關(guān)酶抑制劑完美契合。目前已有多種用于EML治療的靶向藥物獲批上市，如抗血管生成的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2、酪氨酸激酶抑制劑阿帕替尼、抑制細(xì)胞分化的組蛋白去乙?；敢种苿┣乓志谹、抑制腫瘤細(xì)胞向骨髓外遷移的趨化因子受體CXCR4抑制劑普利沙福及直接識(shí)別、殺傷腫瘤細(xì)胞的CD22靶向識(shí)別劑奧英妥珠單抗等；同時(shí)，尚有一些仍在臨床試驗(yàn)階段的制劑已被證實(shí)有效，如抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的PI3K抑制劑LY294002、抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的p38MAPK抑制劑SB202190、抑制腫瘤細(xì)胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)遷移的VCAM-1配體抑制劑TCB3486及抑制腫瘤細(xì)胞腦黏附的造血干細(xì)胞動(dòng)員化合物Me6TREN等，盡管這部分藥物的研究尚處于臨床試驗(yàn)階段，但結(jié)合最新文獻(xiàn)，這些靶向藥物使更多的EML患者受益應(yīng)該只是時(shí)間問(wèn)題[41-46]。

2.4 嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞(chimeric antigen receptor-modified T cell,CAR-T)療法和造血干細(xì)胞移植CAR-T療法是通過(guò)體外重組并轉(zhuǎn)染患者T細(xì)胞，使患者T細(xì)胞表達(dá)腫瘤抗原以精準(zhǔn)識(shí)別、殺傷腫瘤細(xì)胞，但對(duì)EML的療效不佳，這迫使人們?cè)诿鎸?duì)EML時(shí)改進(jìn)CAR-T方案。WENG等[47]以1928z慢病毒載體轉(zhuǎn)染T淋巴細(xì)胞，同時(shí)引入部分Toll樣受體2(Toll-like receptor 2,TLR2)的結(jié)構(gòu)域，產(chǎn)生了靶向CD19的1928zT2CAR-T，TLR2是一種典型的共刺激受體，與之結(jié)合后的1928zT2CAR-T的功能顯著改善。LIU等[48]在國(guó)內(nèi)首次應(yīng)用靶向CD19的CAR-T成功治療EML患者，在接受CD19CAR-T治療后46 d患者接受異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)，隨訪未見EML復(fù)發(fā)跡象，CD19 CAR-T治療可能是橋接化學(xué)治療與allo-HSCT的良好媒介。MRD是allo-HSCT面臨的重大臨床問(wèn)題，大部分MRD來(lái)源于EML，這也是白血病髓外復(fù)發(fā)的重要原因之一。HU等[49]認(rèn)為，在MRD引導(dǎo)治療的基礎(chǔ)上，allo-HSCT可能會(huì)改善高危兒童t(821)AML及其EML的預(yù)后，但EML患者在接受allo-HSCT 前仍需監(jiān)測(cè)骨髓形態(tài)及MRD。目前，allo-HSCT 是有望治愈白血病的手段之一，盡管中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤(rùn)在CML患者中極為罕見，但已有研究肯定了allo-HSCT在CML中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累中的價(jià)值[50]。總之，消除EML并達(dá)成臨床治愈是白血病治療的最終目的，個(gè)體化方案的制定有利于提升患者的生活質(zhì)量及生存希望。

3 小結(jié)與展望

EML診斷的生物標(biāo)志物與治療方案相輔相成，隨著環(huán)境改變疾病本身也會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化，每發(fā)現(xiàn)有新的致病基因，必有新的信號(hào)傳導(dǎo)通路以及蛋白質(zhì)水平變化被隨之發(fā)現(xiàn)，著手于此研發(fā)的靶向藥物也不斷問(wèn)世。雖然三聯(lián)鞘內(nèi)注射治療方案早期應(yīng)用取得了一定的效果，其他類型的EML也應(yīng)該在出現(xiàn)嚴(yán)重臨床后果之前被預(yù)防，期待未來(lái)生物標(biāo)志物能夠在EML的三級(jí)預(yù)防中發(fā)揮潛能，也期待更多的精準(zhǔn)治療手段進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)。