徐梅玲 張育珠 申大年
(1青海省第五人民醫(yī)院疼痛科,青海 西寧 810007;2西寧市第一人民醫(yī)院疼痛科;3青海省第五人民醫(yī)院泌尿科)
骨質疏松(OP)以骨量減少、骨組織結構改變?yōu)樘卣鳎S著社會老齡化的發(fā)展,患有OP病例逐漸升高,加重了患者家人及社會的負擔〔1〕。成骨細胞是骨重建中維持骨量的主要細胞之一,是骨形成過程中的重要功能細胞,其來源于骨髓間充質干細胞(BMSCs)分化失衡是引發(fā)OP的關鍵〔2,3〕。研究表明長鏈非編碼RNA(lncRNA)廣泛參與BMSCs成骨分化進程,調節(jié)干細胞及成骨細胞的增殖與凋亡,在干細胞的多能分化及骨科相關疾病的發(fā)生發(fā)展起重要的調控作用〔4〕。MCF2L可增加滑膜成纖維細胞凋亡及誘導炎癥反應從而促進骨關節(jié)炎的發(fā)生〔5〕。MCF2L的反義RNA1(MCF2L-AS1)是一種lncRNA,研究報道MCF2L-AS1通過使miR-33a海綿化而積極調節(jié)Runx2的表達,可促進BMSCs的成骨分化〔6〕。但MCF2L-AS1對BMSCs分子機制尚不清楚。研究顯示,MSCs誘導分化為汗腺樣細胞過程中has-miR-138-5p減少〔7〕。高脂環(huán)境下BMSCs向成骨細胞分化減少,miR-138-5p參與調控高脂環(huán)境下骨代謝和成骨細胞的生物學活性〔8〕。本實驗旨在研究MCF2L-AS1可能通過靶向調控miR-138-5p對BMSCs增殖、凋亡和成骨分化的影響。
1.1組織來源 收集手術切除的正常骨組織和OP患者的疏松骨組織各25例。所選病例資料完整,無代謝性相關疾病病史及慢性用藥史。
1.2細胞與主要藥品 hBMSCs購自廣州賽萊拉干細胞科技公司;成骨分化培養(yǎng)基購自德國PromoCell公司;人BMSCs(hBMSCs)完全培養(yǎng)基購自武漢益普生物;熒光定量試劑盒購自日本Takara公司;蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自北京百奧萊博;CCK-8、凋亡試劑盒、雙熒光素酶報告基因試劑盒購自北京索萊寶。
1.3細胞培養(yǎng) 將hBMSCs接種于hBMSCs完全培養(yǎng)基中,在37℃水浴中進行復蘇;取對數(shù)生長期hBMSCs,將其接種于成骨分化培養(yǎng)基中在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔天換液1次,分別收集第0、1、3、7、14天培養(yǎng)細胞備用。
1.4細胞轉染與分組 將si-NC、si-MCF2L-AS1、miR-NC、miR-138-5p、pcDNA-NC、pcDNA-MCF2L-AS1轉染至hBMSCs中,記為si-MCF2L-AS1組、si-NC組、miR-138-5p組、miR-NC組、pcDNA-MCF2L-AS1組、pcDNA-NC組;將si-MCF2L-AS1分別與anti-miR-NC、anti-miR-138-5p共轉染,記為si-MCF2L-AS1+anti-miR-NC組和si-MCF2L-AS1+anti-miR-138-5p組。
1.5實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測LncRNA MCF2L-AS1、miR-138-5p、ALP、RUNX2、OCN表達水平 提取正常骨組織、OP患者骨組織、誘導分化0、1、3、7、14 d的hBMSCs及各組細胞的總RNA,合成cDNA,按熒光定量試劑盒進行PCR,相對表達量用2-△△Ct法計算。以GAPDH和U6為作為內參,MCF2L-AS1上游引物:5′-TCCAGCTCGTGTCTATG-CAG-3′,下游:5′-CTGCTTCTGCCTCAG-CTTCT-3′;miR-138-5p上游引物:5′-TGCGGAGCTGGTGTTGTGAATC-3′,下游:5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′;ALP上游引物:5′-GCCATTGGCACCTGCCTTAC-3′,下游:5′-AGCTCCAGGCATATTTCAGTGTC-3′;RunX2上游引物:5′-CCGGTCTCCTTCCAGGAT-3′,下游:5′-GGGAACTGCTGTGGCTTC-3′;OCN上游引物:5′-ACCCTCTCTCTGCTCACTCTGCT-3′,下游:5′-GCTGGGGCTCCAAGTCCATT-3′。
1.6Western印跡檢測細胞周期蛋白(Cyclin)D1、裂解半胱天冬酶(Cleaved-caspase)-3蛋白表達 提取細胞總蛋白,行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),轉膜、封閉后,加一抗4℃孵育過夜,加二抗室溫孵育90 min,顯影、成像,檢測蛋白條帶的灰度值。
1.7CCK-8檢測細胞增殖率 細胞培養(yǎng)48 h,每孔加10 μl CCK-8試劑,孵育2 h,酶標儀檢測490 nm處吸光度值(A)。
1.8流式細胞術檢測細胞凋亡率 細胞培養(yǎng)48 h,加膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)混勻,避光孵育10 min;流式細胞儀檢測細胞凋亡率。
1.9熒光素酶報告實驗檢測LncRNA MCF2L-AS1和miR-138-5p的靶向關系 構建含有miR-138-5p結合位點的LncRNA MCF2L-AS1野生型及突變型報告基因載體,hBMSCs細胞轉染miR-NC、miR-138-5p和LncRNA MCF2L-AS1野生型及突變型載體,按說明書檢測熒光素酶活性。
1.10統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、方差分析。
2.1LncRNA MCF2L-AS1和miR-138-5p在OP的表達水平 OP骨組織中LncRNA MCF2L-AS1表達水平明顯低于正常骨組織,miR-138-5p表達水平明顯高于正常骨組織(均P<0.001),見表1。
表1 OP患者中LncRNA MCF2L-AS1和miR-138-5p的表達水平
2.2在hBMSCs分化培養(yǎng)中LncRNA MCF2L-AS1和miR-138-5p的表達水平 與0 d相比,在hBMSCs分化培養(yǎng)1、3、7、14 d時LncRNA MCF2L-AS1表達、ALP、RUNX2、OCN表達水平明顯升高,miR-138-5p表達水平明顯降低(P<0.05),見表2。
表2 在hBMSCs分化培養(yǎng)中LncRNA MCF2L-AS1、miR-138-5p及成骨分化相關因子的表達水平
2.3低表達LncRNA MCF2L-AS1對hBMSCs細胞增殖、凋亡和成骨分化的影響 與si-NC組相比,si-MCF2L-AS1組Cleaved-caspase-3表達水平、細胞凋亡率明顯升高,LncRNA MCF2L-AS1表達、ALP、RUNX2、OCN、CyclinD1表達水平、細胞增殖率明顯降低(P<0.05),見圖1、圖2、表3。
圖1 低表達LncRNA MCF2L-AS1對hBMSCs細胞凋亡的影響
圖2 Western印跡檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達
表3 低表達LncRNA MCF2L-AS1對hBMSCs細胞增殖、凋亡和成骨分化的影響
2.4高表達miR-138-5p對hBMSCs細胞增殖、凋亡和成骨分化的影響 與miR-NC組相比,miR-138-5p組miR-138-5p表達水平、Cleaved-caspase-3表達水平、細胞凋亡率明顯升高,ALP、RUNX2、OCN、CyclinD1表達水平、細胞增殖率明顯降低(P<0.05),見表4、圖3。
表4 高表達miR-138-5p對hBMSCs細胞增殖、凋亡和成骨分化的影響
圖3 高表達miR-138-5p對hBMSCs細胞增殖、凋亡相關蛋白的影響
2.5LncRNA MCF2L-AS1靶向miR-138-5p 圖4顯示MCF2L-AS1與miR-138-5p存在結合位點。與miR-NC組比較,miR-138-5p降低WT熒光素酶活性(P<0.001);對MUT熒光素酶活性無顯著差異,見表5。pcDNA-MCF2L-AS1組miR-138-5p表達水平(0.43±0.04)明顯低于pcDNA-NC組(1.00±0.08,P<0.05),si-MCF2L-AS1組miR-138-5p表達水平(1.73±0.11)明顯高于si-NC組(0.98±0.09,P<0.05)。
表5 雙熒光素報告實驗
圖4 miR-138-5p和LncRNA MCF2L-AS1結合位點
2.6低表達miR-138-5p部分逆轉MCF2L-AS1低表達對hBMSCs細胞增殖、凋亡和成骨分化的影響 si-MCF2L-AS1+anti-miR-138-5p組miR-138-5p表達水平、Cleaved-caspase-3表達水平、細胞凋亡率明顯低于si-MCF2L-AS1+anti-miR-NC組,ALP、RUNX2、OCN、CyclinD1表達水平、細胞增殖率明顯高于si-MCF2L-AS1+anti-miR-NC組(P<0.05),見表6、圖5。
表6 低表達miR-138-5p 可以部分逆轉MCF2L-AS1低表達對hBMSCs細胞增殖、凋亡和成骨分化的影響
1~2:si-MCF2L-AS1+anti-miR-NC組,si-MCF2L-AS1+anti-miR-138-5p組圖5 低表達miR-138-5p 和MCF2L-AS1對hBMSCs細胞增殖、凋亡相關蛋白的表達
OP患者BMSCs成骨分化能力減弱,因此增強BMSCs的成骨分化能力及促進BMSCs增殖、抑制凋亡是防治OP的重要途徑之一〔9〕。研究報道LncRNA影響B(tài)MSCs的成骨分化進而影響骨代謝進程〔10〕。且已有研究表明LncRNA MCF2L-AS1參與BMSCs的成骨分化〔6〕。本研究結果表明,LncRNA MCF2L-AS1的確參與了BMSCs的成骨分化過程,且與OP的發(fā)生發(fā)展可能有關。本實驗顯示,ALP、RunX2、OCN表達水平降低,細胞增殖率降低,細胞凋亡率升高。
ALP、RUNX2、OCN均是成骨分化相關因子,ALP是骨組織分解代謝的一種酶,與鈣化有關,可反映成骨細胞分化及功能狀態(tài)〔11〕。RUNX2是成骨細胞分化及骨形成的重要轉錄因子,RUNX2能調控間質細胞向前成骨細胞分化〔12〕。OCN由成熟骨細胞分泌,是骨細胞成熟標志〔13〕。本實驗結果表明,低表達LncRNA MCF2L-AS1可抑制hBMSCs增殖促進細胞、凋亡及抑制成骨分化。
研究報道在力學去負荷條件下miR-138-5p表達水平明顯升高,成骨細胞分化能力降低;而 抑制miR-138-5p能有效地逆轉力學去負荷對成骨細胞分化的抑制作用〔14〕。非病毒寡核苷酸抗miR-138傳遞至間充質干細胞可顯著增強BMSC片的體外成骨分化,上調成骨相關基因RUNX2、ALP、OCN和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)2表達〔15〕。miR-138可抑制人去分化軟骨細胞的成骨分化和礦化作用〔16〕,表明miR-138-5p參與成骨分化。本實驗結果與上述研究結果相符。還有研究報道LOC103691336競爭結合miR-138-5p從而上調BMPR2的表達促進鎂介導的成骨分化〔17〕。本實驗提示,MCF2L-AS1可能通過調控miR-138-5p影響hBMSCs增殖、凋亡和成骨分化。
綜上,低表達LncRNA MCF2L-AS1通過調控miR-138-5p抑制hBMSCs增殖和成骨分化,促進細胞凋亡。低表達LncRNA MCF2L-AS1可能抑制hBMSCs成骨分化影響OP的發(fā)展。