張國燕 尚軍 陳海娟 陳志

(1青海師范大學生命科學學院，青海 西寧 810008；2青海省青藏高原藥用動植物資源重點實驗室)

原發(fā)性肝癌是人類常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，是全球第6大高發(fā)病率的惡性腫瘤，作為原發(fā)性肝癌最常見形式之一的肝細胞癌，因其早期臨床癥狀不明顯，進展迅速及腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力導致遠端轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后普遍較差，死亡率極高〔1，2〕。臨床治療肝細胞癌患者的主要治療方式是化療，但是由于化療藥物往往為單靶點藥物，導致用藥后肝癌細胞可以通過替代途徑，改變細胞膜通透性及增加藥物外排等產(chǎn)生獲得性耐藥和多藥耐藥〔3〕，因此化療方法的臨床應(yīng)用具有一定限制。

高良姜素具有一定抗腫瘤活性，可以保護機體免受致癌因素的損傷，同時抑制腫瘤侵襲和遷移〔4～6〕，最近的研究表明，高良姜素可抑制肝癌細胞增殖，侵襲及遷移，其機制與高良姜素誘導肝癌細胞凋亡密切相關(guān)〔7，8〕，但是高良姜素對于肝細胞癌體內(nèi)作用及其相關(guān)機制未見報道。本研究探討高良姜素對二乙基亞硝胺(DEN)誘發(fā)大鼠肝癌模型的抑制作用及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1試劑 高良姜素(質(zhì)量分數(shù)98%，擎科生物技術(shù)有限公司，中國)；TBST(恒瑞公司，中國)，磷脂酰肌醇3激酶(PIK3)一抗(CST，美國)，蛋白激酶B(AKT)一抗(CST，美國)，p-AKT一抗(CST，美國)，裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-9一抗(CST，美國)，第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白(PTEN)一抗(CST，美國)，GAPDH一抗(CST，美國)，辣根過氧化物酶耦聯(lián)的小鼠二抗(Santa Cruz Biotechnology，美國)，電化學發(fā)光(ECL)顯影劑(阿斯利康，美國)。

1.2DEN誘導Wistar大鼠肝癌模型 從大學實驗動物中心購入60只健康雄性Wistar大鼠，在12 h的人工光照/黑暗周期下飼養(yǎng)。溫度(23±1)℃，相對濕度為(50±5)%。小鼠自由進食和飲水。隨機分為正常對照組，模型對照組，高劑量組和低劑量組各15只，根據(jù)相關(guān)文獻〔9〕，后3組采用DEN誘導建立大鼠肝癌模型，高劑量組和低劑量組分別給予40 mg/kg、10 mg/kg高良姜素溶液灌胃治療，高良姜素加入二甲基亞砜(DMSO)稀釋至終濃度達到40 mg/L、10 mg/L，給藥時按照小鼠體重和給藥濃度計算給藥體積。正常對照組和模型對照組給予含1% DMSO的生理鹽水灌胃，3次/d，記錄各組大鼠一般情況如大鼠活動、進食、精神、性格及毛發(fā)情況，連續(xù)飼養(yǎng)4 w ，試驗結(jié)束后測量大鼠體質(zhì)量，頸椎脫臼法處死大鼠并獲得記錄肝質(zhì)量，由3名資深實驗員測量并評估外周表面的灰白色結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)直徑，病灶及肝癌分化程度(肝癌的病理分級：采用國際上常用的Edmondson-Steiner分級法)并獲取肝癌組織作進一步分析。實驗方案由實驗動物倫理委員會批準。

1.3血清分析 取大鼠心臟血2 ml，加入5 μl枸櫞酸鈉抗凝劑(碧云天試劑公司，中國)置于EP管中，4℃下，2 000 r/min離心3 min，取上清，按照試劑商說明，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(擎科生物技術(shù)有限公司，中國)，采用雙抗體一步夾心法ELISA，并通過RT-6100 酶標儀(CST，美國)檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)水平。

1.4Wesetrn印跡檢測 肝癌組織勻漿后進行胰酶消化，使用TBST將細胞稀釋至1×106/ml，1 000 r/min，離心5 min收集細胞，將細胞溶解在裂解緩沖液(CST，美國)，4℃反應(yīng)10 min后，4℃下，1 000 r/min離心3 min。按照制造商的說明，通過Bio-Rad蛋白質(zhì)檢測試劑盒(Bio-Rad Laboratories，美國)測定蛋白質(zhì)濃度，加熱使蛋白質(zhì)變性后，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Bio-Rad Laboratories，美國)，120 V，電泳90 min，濕法轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜(GE公司，英國)中。含5%脫脂牛奶的PBST中室溫封閉2 h，分別與以下一抗AKT一抗(1：1 000)，p-AKT一抗(1∶1 000)，PIK3一抗(1∶1 000)，PTEN一抗(1∶1 000)，GAPDH一抗(1∶1 000)及裂解Caspase-9一抗(1∶1 000)，4℃時振搖孵育過夜，TBST洗3次，每次5 min，與辣根過氧化物酶標記的小鼠免疫球蛋白(Ig)G二抗在37℃孵育1 h，TBST洗3次后添加ECL顯影劑，室溫孵育5 min后，以GAPDH為內(nèi)部對照，通過ImageJ軟件1.2版(貝塞斯達公司，美國)進行印跡分析。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0軟件進行χ2檢驗、方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組一般情況比較 正常對照組活動及進食正常，精神良好，性格活潑，毛發(fā)光滑、白潤；模型對照組飲食減少，精神萎靡，出現(xiàn)明顯的掉毛，毛發(fā)粗糙雜亂疏松無光澤，反應(yīng)遲鈍。與模型對照組比較，高劑量組和低劑量組癥狀有所減輕，反應(yīng)略遲鈍，飲食減少，偶有腹瀉，體型偏瘦，精神稍差，活動尚可。高劑量組癥狀較低劑量組又有所減輕。模型對照組、高劑量組和低劑量組體重明顯低于正常對照組，肝重和肝/體重明顯高于正常對照組(P<0.05)；模型對照組、高劑量組和低劑量組3組間體重比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而高劑量組和低劑量組肝重和肝/體重明顯低于模型對照組，且高劑量組明顯低于低劑量組(P<0.05)；各組死亡率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2各組肝功能各項指標測定結(jié)果 各組ALT、AST、GGT、TBIL比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中肝癌各組ALT、AST、GGT、TBIL均明顯高于正常對照組，而高劑量組和低劑量組ALT、AST、GGT、TBIL均明顯低于模型對照組，高劑量組明顯低于低劑量組(P<0.05)。見表1。

表1 各組一般情況及各項指標比較

2.3各組肝臟病理情況 正常對照組肝臟大體形態(tài)正常 ，模型對照組顯示出嚴重的肝腫大和肝外周表面的灰白色結(jié)節(jié)和病灶，大部分病灶和結(jié)節(jié)從肝臟中消失在高劑量組中，低劑量組結(jié)節(jié)數(shù)顯著減少，且結(jié)節(jié)直徑較小。見圖1。高劑量組和低劑量組癌結(jié)節(jié)個數(shù)、包塊最大直徑≤2 mm、>2 mm個數(shù)均明顯低于模型對照組，而高劑量組明顯低于低劑量組(P<0.05)；模型對照組多為低分化肝癌，而高劑量組和低劑量組多為高分化癌，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組肝臟病理情況

圖1 各組肝臟大體形態(tài)

2.4各組肝癌組織PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達水平比較 各組肝癌組織中PI3K、AKT蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，高劑量組和低劑量組P-AKT蛋白表達明顯低于模型對照組，而PTEN、Caspase-9明顯高于模型對照組，高劑量組P-AKT蛋白表達明顯低于低劑量組，PTEN、Caspase-9明顯高于低劑量組(均P<0.05)。見表3、圖2。

表3 各組肝癌組織PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達水平比較

圖2 各組肝癌組織PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達水平

3 討 論

原發(fā)性肝癌是常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，我國原發(fā)性肝癌發(fā)病率逐年增加，患者死亡率高，預(yù)后極差，隨著傳統(tǒng)中藥研究的深入，從中藥材中提取有效的且毒副作用較小的肝癌治療藥物具有重要意義，高良姜素由中藥材高良姜提取而來，主要化學成分之一黃酮是一類含15個碳原子的多元酚化合物〔10～12〕，高良姜具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、抗菌及抗癌活性，近年來，其抗癌機制受到廣泛研究〔12～14〕。高良姜素可抑制包括肺癌，肝癌，結(jié)腸癌及白血病等在內(nèi)的多種惡性腫瘤的生長和侵襲，抗癌譜相對廣泛，具有很好的應(yīng)用前景〔12～16〕。本研究結(jié)果提示高良姜素可能是肝癌治療的一種新途徑。

PI3K/AKT/mTOR 通路廣泛存在于各種生物細胞中，介導包括細胞生長、存活和遷移、腫瘤形成和血管生成等多種過程，與肝癌細胞的生長、凋亡、轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)〔15〕，PI3K可以被生長因子、激素、細胞因子等啟動激活，活化PI3Ks磷酸化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(PIP 2)為磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(PIP3)，誘導下游AKT磷酸化，磷酸化的AKT通過中間結(jié)節(jié)性硬化復合物1/2激活絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶/mTOR，促進蛋白質(zhì)合成和肝癌細胞的生長和侵襲〔16〕。PTEN 作為重要的抑癌基因，可以通過去磷酸化PI3K，抑制AKT的激活，發(fā)揮PI3K/AKT 信號轉(zhuǎn)導負反饋調(diào)節(jié)功能，PTEN表達缺失與腫瘤進展、侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良密切相關(guān)〔17〕。研究發(fā)現(xiàn)，肝細胞癌中PI3K/AKT信號通路的異常調(diào)控頻繁發(fā)生，近年來研究表明，羅格列酮，ADAMTS9等藥物均可以通過 PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路抑制人肝癌細胞增殖及侵襲，在肝癌中發(fā)揮腫瘤抑制作用〔18～20〕。本研究結(jié)果表明，高良姜素可以通過PI3K/PTEN/AKT信號轉(zhuǎn)導發(fā)揮肝癌細胞侵襲遷移抑制作用。Wang等〔21〕發(fā)現(xiàn)，高良姜素可以通過調(diào)節(jié)caspase-3和AKT信號通路抑制人喉癌進展。

肝癌患者由于肝內(nèi)阻塞以及肝癌細胞合成，患者血清中GGT水平顯著升高，國內(nèi)外研究表明GGT水平和GGT/ALT比值的聯(lián)合分析對肝癌診斷具有重要價值，研究表明可通過血清GGT水平，GGT/ALT比值與AST/ALT比值聯(lián)合分析有效排除膽囊結(jié)石、硬化性膽管、胰腺癌及膽囊炎炎患者所致假陽性，明顯提高原發(fā)性肝癌診斷的準確率〔22〕，本研究提示，高良姜素可以有效保護肝臟組織，抑制因癌細胞浸潤導致的肝細胞損傷。