陳彩玲 鄭曉艷 王可欣 劉翠娟 田佳 鐘燕婷 林瑞 吳鐵 許碧蓮 崔燎，3

(1廣東醫(yī)科大學藥學院藥理學教研室，廣東 湛江 524023；2廣東醫(yī)科大學·廣東潤和生物科技有限公司輔酶Q10聯(lián)合研究中心；3廣東天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室)

根據(jù)世界衛(wèi)生組織定義，骨質疏松(OP)是以單位骨量減少及骨組織顯微結構破壞為特征，并導致骨生物力學性能下降，骨脆性增加、發(fā)生骨折及相關并發(fā)癥的風險增加的一種全身性骨骼疾病〔1〕。隨著年齡的增長，中老年男性的睪酮水平逐漸降低，發(fā)生睪酮缺乏〔2,3〕。傳統(tǒng)觀點認為老年男性OP主要與增齡性退化有關，近年來研究發(fā)現(xiàn)男性與女性相似，性激素水平在調節(jié)骨質量和骨代謝中起重要作用，睪酮缺乏是老年男性OP常見的繼發(fā)因素之一，睪丸激素水平與骨折風險呈負相關〔4〕。男性性腺功能低下，雄激素不敏感綜合征和接受雄激素剝奪療法的前列腺癌與骨質流失和骨折風險增加密切相關〔5〕。臨床研究表明對雄激素缺乏的男性OP患者補充雄激素有緩解作用〔6〕，隨著各種雄激素補充劑的出現(xiàn)，如睪丸甾類，睪酮酯，烷基化睪酮，新雄激素制劑的普遍運用〔7〕，副作用也越來越明顯，包括前列腺增生和前列腺癌〔8〕。為減少不良反應，人們相繼研究開發(fā)選擇性雄激素受體調節(jié)劑,如SARM，NEP28〔9〕，GTx-024〔10〕。

牡丹籽油(PSO)是從牡丹種子中提取的一種新型植物油，含有豐富的不飽和脂肪酸(n-3 PUFAs)：硬脂酸、棕櫚酸、亞油酸、油酸和α硬亞麻酸，以α麻亞麻酸為主〔11〕，具有較高營養(yǎng)價值和保健功效，依據(jù)國家《食品安全性毒理學評價程序和方法》分析和探討PSO的毒理學作用，PSO無急性毒性、遺傳毒性和亞急性毒性，具有較高的食用安全性，作為功能性食品之一〔12〕。研究表明，PSO能可以降血糖〔13〕、降血脂〔14〕，其中含有的多不飽和脂肪酸具有潛在的抗炎和抗氧化活性〔15〕，對自由基和體內抗氧化能力具有較強的清除作用，可保護多種生物因素引起的氧化損傷〔16〕，還可對抗小鼠的衰老模型〔17〕，目前PSO對去睪丸小鼠骨組織的影響尚未見研究。本研究探討PSO對去睪丸小鼠骨骼的影響。

1 材料和方法

1.1實驗動物 40只SPF級4周齡雄性KM小鼠，體重(26±1)g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，許可證號為SCXK(粵)2018-0002。

1.2藥物與試劑 TU購于浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，批號：H10970240。PSO購于廣東省廣州市番禺南利油脂制品有限公司，批號：LS/T3242。生理鹽水，購于廣西裕源藥業(yè)有限公司，批號：H19042908。

1.3儀器 PTY-224-423 電子天平( 福州華志科學儀器有限公司)；858 Mini Bionix型材料測試系統(tǒng)(美國MST公司) ；Viva Micro CT 40(SCANCO Medical AG) 。

1.4實驗動物分組與給藥 4周齡小鼠適應性飼養(yǎng)2 w后，按體質量隨機區(qū)組法，隨機分為假手術(Sham)組、去睪丸(ORX)組、TU組、PSO組，每組10只。Sham組進行假手術，其余組均進行雙側睪丸摘除手術。術后第2天開始灌胃給藥，Sham和ORX組給予溶劑對照，TU組給予TU 10.4 mg/kg，PSO組給予牡丹籽油0.1 ml/10 g，給藥1次/d，連續(xù)給藥8 w。

1.5觀察指標及測定方法

1.5.1體重的檢測 實驗開始后，每周稱量小鼠體重1次，直至實驗結束。取材前稱體重作為最后的體重。第1次體重和最后的體重差值為體重增長值(△W)。

1.5.2骨生物力學的檢測 實驗結束后，取左側股骨，去除股骨周圍的肌肉和肌腱，采用Lloyd LR5K Plus 骨生物力學檢測系統(tǒng)檢測和分析標本的生物力學指標，實驗采用三點彎曲法，步驟如下：將小鼠左側股骨置于試驗機上，用1 mm直徑的壓頭，加載速度為2 mm/min，跨距為20 mm，股骨加壓至發(fā)生骨折，這可提供屈服點和骨折參數(shù)的測量，儀器將及時記錄出每個時刻點的載荷和橈度變化值，繪制出載荷-位移曲線，然后讀取最大載荷、斷裂載荷、彈性載荷，并計算剛性系數(shù)。

1.5.3Micro-CT的檢測 將小鼠左側股骨除盡肌肉和附著組織，放入微型計算機斷層掃描技術(Micro-CT)儀，對股骨干骺端進行X射線掃描。viva CT40選擇掃描參數(shù):圖像矩陣為2 048×2 048，整合時間為200 ms，能量/強度為70 kVp，114 μA，8 W。以0°旋轉進行掃描。掃描完成后，選取距生長板遠端1.0 mm、層厚2.0 mm的骨組織為松質骨感興趣區(qū)域(ROI)行三維重建，以最低閾值為150提取圖像信息。定量分析使用SCANCO Medical AG軟件，分析參數(shù)。參數(shù)如下：連接密度(ConnD)、結構模型指數(shù)(SMI)、體積骨密度(BMD)、骨體積分數(shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)。

1.5.4血清指標檢測 實驗結束時，小鼠眼球取血于1.5 ml EP管中4℃靜置4 h，3 000 r/min離心10 min取上層血清。按照相應試劑盒說明書，測血清指標：超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、白細胞介素(IL)-6、超敏C反應蛋白(hs-CRP)。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件進行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組不同時間點體重及△W 與Sham組比較，ORX組ΔW下降但無統(tǒng)計學意義；與ORX組比較，TU組和POS組ΔW明顯上升(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 各組不同時間點體重及ΔW比較

2.2各組骨生物力學性能的變化 與Sham組相比，ORX組彈性載荷明顯降低(P<0.05)；與ORX組相比，TU組剛性系數(shù)明顯升高(P<0.01)，PSO組最大載荷、彈性載荷和剛性系數(shù)均明顯升高(P<0.05，P<0.01)。見表2。

2.3各組股骨骨微結構的變化 與Sham組相比，ORX組Micro-CT參數(shù)中Conn.D.、BV/TV、Tb.N均明顯下降(P<0.01)，而SMI和Tb.Sp明顯增大(P<0.05，P<0.01)；與ORX組比較，TU組Conn.D.、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均明顯增大，而SMI、Tb.Sp均明顯下降(P<0.05，P<0.01)；PSO組Conn.D.、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均明顯增大，SMI、Tb.Sp均明顯下降(P<0.05，P<0.01)。見表2。

2.4各組血清生化指標檢測 與Sham組相比，ORX組IL-6、hs-CRP含量明顯升高(P<0.05，P<0.01)；與ORX組比較，TU組hs-CRP含量明顯降低(P<0.05)；與ORX組比較，POS組血清SOD含量明顯增加(P<0.01)，MDA、IL-6、Hs-CRP含量有下降趨勢但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組股骨遠端骨微結構及血清生化指標比較

3 討 論

在臨床上，雄激素剝奪療法是治療前列腺癌的有效方法，但研究發(fā)現(xiàn)其與骨質流失和骨折風險增加有關〔18〕，也常常采用唑來膦酸〔19〕、雙膦酸鹽〔20〕等藥物預防雄激素阻斷引起的骨丟失。在眾多動物模型中尋找合適的雄激素缺乏引起的OP模型，發(fā)現(xiàn)睪丸切除術引起的原發(fā)性腺功能減退是誘導動物睪丸激素缺乏的首選方法，且符合臨床雄激素剝奪療法，并且有研究表明去睪丸模型大鼠出現(xiàn)骨礦物質密度和含量降低，骨骼的微結構損傷〔21〕。臨床研究數(shù)據(jù)顯示，TU對雄激素水平下降引起的老年男性OP的骨量及骨代謝有影響〔22〕，所以本研究采用TU作為陽性藥物對照。PSO是一種天然植物油脂，成為我國的新資源食用油品種之一，其具有良好的抗氧化作用〔23〕，且具有較高的食用安全性〔12〕。在OP方面尚未見報道。

本研究ORX組骨量明顯比Sham組少，給予TU后，骨量增多。這是因為睪酮由男性的睪丸或女性的卵巢分泌，具有維持肌肉強度及質量、維持骨質密度及強度、提升體能等作用，老年男性適當補充睪酮有利于維持骨質量和骨強度〔22〕。隨著研究的深入，對骨微結構的觀察已成為判斷骨質量的常用指標〔24〕。SMI反映骨小梁板狀和桿狀的程度，板狀骨小梁和桿狀骨小梁的SMI依次為0和3。出現(xiàn)OP時，骨小梁從板狀轉變?yōu)闂U狀，SMI值增加。在服用睪酮或者PSO的小鼠，骨小梁丟失減少，阻止去睪丸后骨骼的骨小梁網(wǎng)絡之間連接數(shù)量的減少，骨體積分數(shù)增加，這說明這兩個藥物可以減少這種骨的丟失，但還是遠遠不能達到對照組的水平。PSO與睪酮的作用一樣，可以骨小梁數(shù)量和骨小梁厚度明顯增加，并降低了骨小梁分離度，明顯對抗去睪丸導致的骨量丟失的作用，但與對照組比較，這種拮抗作用，還是不能達到對照組的水平。延長給藥周期會是否會更好的效果，這有待進一步的研究。

骨量增加并不一定表示骨的性能提高，需要進一步進行骨生物力學評價。骨生物力學特性測試以實現(xiàn)模擬真實受力情況并對骨骼進行力學特性評估。斷裂載荷是指骨質在發(fā)生骨折前的塑性應變量，反映骨材料的可塑性，最大載荷反映了骨所能承受的最大外力，彈性載荷反映了骨在彈性范圍所能承受的最大變形長度，剛性系數(shù)反映了骨標本外在的硬度，PSO明顯增加了骨的最大載荷、彈性載荷和剛性系數(shù)這三種力學性能，說明了PSO具有明顯的強骨功能，其中，應用PSO治療的小鼠骨的彈性載荷比應用睪酮治療的小鼠更強，骨組織抗變形能力上升，提示了PSO可以替代睪酮用于預防由于雄激素減少導致的骨力學性能下降。

激素的缺乏易引起機體出現(xiàn)相關衰老疾病，特別是氧化應激方面〔25〕。本研究結果顯示，SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基保護細胞免受損傷，MDA引發(fā)脂質過氧化作用，形成脂質過氧化物。SOD活力的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力，而MDA的高低又間接反映了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。結果表明PSO對機體具有抗氧化作用〔17〕。另外，血清中相關炎癥因子IL-6、hs-CRP含量下降，進一步說明PSO可能通過抗氧化對OP起到抑制作用。

本實驗研究結果表明，PSO能改善去睪丸雄性小鼠的骨微觀結構破壞，并增強骨生物力學性能。由相關炎癥因子檢測結果表明，PSO可以對抗機體的氧化作用。OP是常見的老年性疾病，由OP引起的老年性骨折越來越多，而且其術后恢復較差。在日常生活中，OP時常不伴隨相關疼痛癥狀而且治療OP的藥物價格相對昂貴，并未引起人們的關注。PSO因具有較高的食用安全性，目前已經(jīng)成為公認的功能性食品之一，其對于骨組織的影響尚未見報道，本實驗研究成果為PSO在OP藥物進一步的開發(fā)以及運用方面提供了理論依據(jù)。