劉晉如 王平生 邱頤 王偉 王曉東

(1巴彥淖爾市醫(yī)院疼痛科，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000；2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科；3巴彥淖爾市醫(yī)院麻醉科)

帶狀皰疹后遺神神經(jīng)痛是皮膚科常見的皮膚性疾病之一，由水痘-帶狀皰疹病毒引起。該疾病會(huì)造成患者出現(xiàn)泛紅，發(fā)熱等癥狀，嚴(yán)重可能會(huì)造成肺炎和腦炎的發(fā)生，危及患者生命〔1〕。對(duì)于引起帶狀皰疹的病毒稱之為為嗜神經(jīng)性，病毒侵入感覺神經(jīng)末梢后，可沿神經(jīng)移動(dòng)至脊髓后根神經(jīng)節(jié)隱匿〔2〕。如果清除掉體內(nèi)的病毒和感知周圍神經(jīng)，將不會(huì)出現(xiàn)后遺神經(jīng)痛這一并發(fā)癥的發(fā)生。帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛為帶狀皰疹較為常見的并發(fā)癥，屬于頑固性神經(jīng)病理性疼痛疾病，主要癥狀多為自發(fā)痛、誘發(fā)痛、痛覺過(guò)敏等，此病病程大多遷延反復(fù)，臨床治療難度較大〔3〕。所以，對(duì)于帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛的發(fā)生，需要盡快干預(yù)，來(lái)緩解疾病情況〔4，5〕。本研究探究miR-339-5p過(guò)表達(dá)對(duì)帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛緩解機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 研究動(dòng)物：選取48只SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半〔單位名稱：山東大學(xué)，許可證號(hào)：SYXK(魯)2020 0022〕，月齡(4.75±0.95)個(gè)月，體重(268.38±35.62)g，溫度22～25℃、相對(duì)濕度52%的清潔級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)1 w，光照12 h/d。環(huán)境安靜，大鼠可自由飲水、飲食。

主要試劑：miR-339-5p(廣州威佳科技有限公司)，白細(xì)胞介素(IL)-2、腫瘤壞死因子(TNF)-α及5-羥色胺(HT)相關(guān)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒均購(gòu)自上海茁彩生物科技有限公司；神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)ELISA試劑盒購(gòu)自南京賽泓瑞生物科技有限公司，同源性磷酸張力蛋白誘導(dǎo)激酶(PINK)1抗體(武益普生物科技有限公司，貨號(hào)：ATA35522)，帕金森蛋白(Parkin)抗體(武益普生物科技有限公司，ATA35114)，電子測(cè)通儀(上海玉研科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：2091)。

1.2分組及建模 48只大鼠隨機(jī)分為空白組、過(guò)表達(dá)組、沉默組、模型組各12只，模型組、過(guò)表達(dá)組、沉默組。參照李晶晶等〔6〕研究實(shí)驗(yàn)帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛大鼠。構(gòu)建方法：將CV-1細(xì)胞添加到杜爾貝克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)/F12中，并培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，根據(jù)5.0×104/cm2接種于培養(yǎng)瓶，然后用VZV感染cV-1細(xì)胞，當(dāng)CV-1細(xì)胞80%被感染，立刻收集并作細(xì)胞懸液接種帶狀皰疹病毒，將SD大鼠放入SPF實(shí)驗(yàn)環(huán)境為中等濕度、溫度中，在造模前，用4%水合氯醛麻醉SD大鼠，在SD大鼠右腳底部皮下注射50 μl病毒接種溶液。感染7 d后如果大鼠出現(xiàn)機(jī)械痛敏閾值、熱痛敏閾值降低，為造模成功。

1.3miR-339-5p基因表達(dá)量 收集入組所有大鼠的靜脈血3 ml,對(duì)其靜脈血進(jìn)行離心處理，2 000 r/min，離心半徑10 cm，離心8 min。miRNA采用miRVana PARIS試劑盒提取純化。在室溫下加入取出的500 μl血清樣品等體積變性液,混合均勻，加入同樣多的體積酸性酚氯仿,搖晃30～60 s；室溫下14 000 r/min離心5 min。把上清液放到另一個(gè)管中，加入1.25倍無(wú)水乙醇充分混勻，然后加入柱中，12 000 r/min離心30 s,棄濾液；700 μl加入柱中，清洗1次,12 000 r/min離心30 s，棄濾液；把500 μl加入柱中，清洗2次,12 000 r/min離心1 min；95℃預(yù)熱洗脫液60 μl加入柱子中，離心1 min 12 000 r/min,收集miRNA。miR-339-5p序列由miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)查得，miR-339-5p引物：5′-UCCCUGUCCUCCAGGAGCUCACA-3′。RNU6B上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AACG CTTCACGAATTTG-3′。qRT-PCR提取DNA 0.5 ml血清加等量的裂解液于尖底離心管中，37℃孵育1 h,加入0.1 ml樣品稀釋液。PCR擴(kuò)增取上述0.02 ml DNA提取液加入分裝好的反應(yīng)液管中。

1.4病理觀察 采用猝死老鼠的方法，迅速分離出背部神經(jīng)節(jié)組織，行病理切片，做常規(guī)脫蠟處理，蘇木素-伊紅(HE)染色，使用顯微鏡觀察大鼠背部神經(jīng)節(jié)組織病理變化情況。

1.5機(jī)械痛閾測(cè)定 使用電子測(cè)痛儀進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定時(shí)間為早晨8∶00～12∶00。將大鼠放在透明玻璃箱中，箱中底部有金屬網(wǎng)，大鼠在玻璃箱中適應(yīng)20 min，等大鼠平靜后開始。各組實(shí)驗(yàn)大鼠刺激部位一樣，用電子測(cè)痛儀刺激探頭尖端輕輕垂直的刺激大鼠后腳足底，刺激強(qiáng)度逐漸增加，表示電子疼痛儀顯示的強(qiáng)度值(單位：G)。如果大鼠出現(xiàn)舔足、縮足等,記錄電子測(cè)痛儀顯示的最大值(單位:g)。5 min/次,重復(fù)3次,機(jī)械縮足閾值(PMWT)是以3次健側(cè)結(jié)果的平均值。

1.6IL-2、TNF-α、5-HT、NGF水平檢測(cè) 采用ELISA檢測(cè)大鼠IL-2、TNF-α、5-HT、NGF，采集所有大鼠血樣本，靜置1 h，3 000 r/min離心10 min,用移液槍吸取上清液，采用ELISA檢測(cè)大鼠IL-2、TNF-α、5-HT、NGF，將IL-2、TNF-α、5-HT、NGF放入微孔中，依次放入標(biāo)準(zhǔn)樣品、標(biāo)本和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體中，溫育后清洗干凈。底物是TMB，TMB在酸的作用下成黃色，過(guò)氧化物酶的催化下成藍(lán)色。酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，計(jì)算樣品濃度。

1.7Western印跡檢測(cè)PINK1、Parkin蛋白表達(dá) 取相關(guān)脊髓組織，采用RIPA裂解液，從相關(guān)組織的勻漿內(nèi)，提取蛋白，用二喹啉甲酸(BCA)法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，并將其浸泡于脫脂牛奶內(nèi)，室溫下密封4 h，加入稀釋后的PINK1、Parkin兔單抗，孵育過(guò)夜(4℃)，加二抗，室溫下孵育60 min。采用ECL定影，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。內(nèi)參蛋白為β-actin，目標(biāo)蛋白同內(nèi)參蛋白的比值，作為蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行F檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1病理觀察 空白組無(wú)單核細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；模型組出現(xiàn)單核細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞變性；過(guò)表達(dá)組存在較輕的單核細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常；沉默組出現(xiàn)大量單核細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞變性。見圖1。

圖1 各組背部神經(jīng)節(jié)組織HE染色

2.2各組miR-339-5p基因表達(dá)量及不同時(shí)間點(diǎn)痛閾值比較 與空白組相比，模型組、過(guò)表達(dá)組、沉默組miR-339-5p表達(dá)均降低，模型組、過(guò)表達(dá)組、沉默組不同時(shí)間點(diǎn)痛閾值明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，過(guò)表達(dá)組miR-339-5p表達(dá)升高，不同時(shí)間點(diǎn)痛閾值降低；沉默組miR-339-5p表達(dá)降低，不同時(shí)間點(diǎn)痛閾值升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。與過(guò)表達(dá)組相比，沉默組不同時(shí)間點(diǎn)痛閾值升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表1。

表1 各組miR-339-5p基因、不同時(shí)間點(diǎn)痛閾值比較

2.3各組SD大鼠血清IL-2、TNF-α、5-HT、NGF、PINK1、Parkin水平比較 與空白組相比,模型組、過(guò)表達(dá)組、沉默組IL-2、TNF-α 、5-HT、NGF水平明顯升高,PINK1、Parkin表達(dá)明顯降低(均P<0.05)。過(guò)表達(dá)組IL-2、TNF-α 、5-HT、NGF水平明顯明顯低于模型組,PINK1、Parkin明顯高于模型組(均P<0.05)。與模型組相比,沉默組 IL-2、TNF-α、5-HT、NGF水平明顯升高, PINK1、Parkin水平降低(均P<0.05)。與過(guò)表達(dá)組比較,沉默組IL-2、TNF-α 、5-HT、NGF水平明顯升高,沉默組 PINK1、Parkin 表達(dá)明顯降低(均P<0.05)。 見表2、圖2。

表2 各組SD大鼠血清IL-2、TNF-α、疼痛5-HT、NGF、PINK1/Parkin信號(hào)通路基因水平比較

圖2 Western印跡檢測(cè)各組細(xì)胞PINK1/Parkin信號(hào)通路蛋白

3 討 論

帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛屬于一種與脊髓、脊髓上中樞、外住神經(jīng)敏化相關(guān)的神經(jīng)疼痛，該疼痛呈現(xiàn)出陣發(fā)性電擊樣疼痛和針刺樣持續(xù)燒灼痛〔7〕。皰疹治愈后，越有可能出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)疼痛，需要早期干預(yù)；注意休息，認(rèn)真吃藥和擦藥，服藥期間不要吃辛辣食物:如海鮮、雞蛋、魚、牛羊肉及油炸食品，以清淡為主，多吃蔬菜和水果，補(bǔ)充維生素〔8,9〕。老年患者和虛弱病的患者應(yīng)該避免嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生:大多數(shù)老年患者由于身體功能下降,免疫功能低下,在帶狀皰疹的相關(guān)原因的作用,疾病容易發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥后,對(duì)虛弱的人來(lái)說(shuō),特別是長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素的患者一樣,所以預(yù)防嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生是非常重要的〔10,11〕。本研究說(shuō)明miR-339-5p能夠抑制5-HT、NGF釋放，明顯減少疼痛時(shí)間。

miRNA在神經(jīng)系統(tǒng)中起到重要的作用，在機(jī)體內(nèi)對(duì)腦內(nèi)神經(jīng)元的分化、神經(jīng)元退行等過(guò)程進(jìn)行參與，能夠?qū)C(jī)體神經(jīng)元的正常運(yùn)作產(chǎn)生作用。而miRNA的作用也與神經(jīng)病毒的感染具有一定關(guān)聯(lián)。如HSV-1、HIV等。在細(xì)胞凋亡、炎性的過(guò)程中，相關(guān)神經(jīng)通過(guò)血液中的miRNA進(jìn)行信號(hào)交換〔12〕。miR-339-5p在機(jī)體內(nèi)對(duì)于神經(jīng)元軸突形成突觸這一過(guò)程進(jìn)行參與，并且與神經(jīng)祖細(xì)胞及神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞相比，miR-339-5p自身的表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)狀態(tài)，由此可得出，miR-339-5p可能對(duì)于神經(jīng)元分化成熟過(guò)程進(jìn)行了參與。miR-339-5p在不同神經(jīng)病中的表達(dá)不同，miR-339-5p表達(dá)上調(diào)是由于乙醇誘導(dǎo)的大腦炎癥導(dǎo)致的，乙醇可以刺激鼠小膠質(zhì)細(xì)胞和大腦組織中miR-339-5p及炎性因子的表達(dá)。miR-339-5p在帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛表達(dá)下降，本研究結(jié)果表明miR-339-5p可能參與帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛的發(fā)展、發(fā)生。

5-HT存在于血清中，而在動(dòng)物中存在于動(dòng)物相關(guān)組織內(nèi)，自身也是屬于一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)〔13,14〕。NGF是一種蛋白質(zhì)，在動(dòng)物中可以得出，能夠?qū)χ袠猩窠?jīng)元的生長(zhǎng)情況進(jìn)行調(diào)節(jié)，維持神經(jīng)元的存活〔15〕。IL-2是一種趨化因子家族的細(xì)胞因子，它是一種由多細(xì)胞來(lái)源，具有多向性作用〔16〕。在機(jī)體的免疫應(yīng)答和抗病毒感染中起著重要的作用，對(duì)T細(xì)胞的增殖能夠產(chǎn)生刺激作用，使其活化T細(xì)胞自身活性增強(qiáng)。并且還能夠?qū)K細(xì)胞的增殖產(chǎn)生刺激作用，并對(duì)LAK細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)作用〔17,18〕。TNF-α是由活化單核細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、B細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌的多向促炎細(xì)胞因子〔19〕。本研究說(shuō)明5-HT、NGF和帶狀皰疹疼痛調(diào)制相關(guān)性較好，有致痛和鎮(zhèn)痛雙重作用。

PINKI以蛋白酶形態(tài)存在，屬于高保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，自身的存在是由581個(gè)氨基酸組成，廣泛在哺乳動(dòng)物各組織器官中表達(dá),在心臟、骨骼肌、神經(jīng)系統(tǒng)中含量最高。Parkin是具有465個(gè)氨基酸的E3泛素連接酶，根據(jù)其氨基酸序列功能，可分為RINGO結(jié)構(gòu)域、RING1結(jié)構(gòu)域、N端泛素樣結(jié)構(gòu)域、RING2結(jié)構(gòu)域、RING1與RING2之間的IBR結(jié)構(gòu)域5個(gè)區(qū)域〔20〕。N端泛素樣結(jié)構(gòu)域的功能主要包括結(jié)合蛋白酶體、識(shí)別細(xì)胞基質(zhì)、結(jié)合SH3、Parkin活性、調(diào)節(jié)泛素蛋白等。有研究表明PINK1/Parkin信號(hào)通路是調(diào)節(jié)線粒體自噬的主要途徑之一。炎癥、創(chuàng)傷等其他疾病引起神經(jīng)損傷后,會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng),從而導(dǎo)致功能出現(xiàn)損傷和神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生。靳曉飛等〔21〕研究認(rèn)為在缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中PINK1/Parkin信號(hào)通路介導(dǎo)的線粒體自噬起到重要的作用，可能為預(yù)防和治療缺血性腦卒中找到新的治療靶點(diǎn)和機(jī)制。本研究說(shuō)明PINK1/Parkin信號(hào)通路在應(yīng)激性疾病發(fā)病機(jī)制中起到重要作用，通過(guò)過(guò)表達(dá)PINK1、Parkin達(dá)到減少疼痛的效果，在應(yīng)激狀態(tài)下PINK1/Parkin信號(hào)通路受到抑制,PINK1/Parkin水平明顯上升。

綜上，過(guò)表達(dá)miR-339-5p基因經(jīng)作用于PINK1/Parkin信號(hào)通路后，有效緩解疼痛程度，miR-339-5p可以成為對(duì)帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛診斷和病情判斷的分子標(biāo)志物。