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        lncRNA XIST通過NF-κB/NLRP3炎性體通路影響急性肺損傷大鼠炎癥反應(yīng)和細胞凋亡

        2023-02-02 03:18:40湯建華劉克勤姜愛雯馮平張志華
        中國老年學(xué)雜志 2023年1期
        關(guān)鍵詞:組肺組織細胞炎性

        湯建華 劉克勤 姜愛雯 馮平 張志華

        (河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 1藥學(xué)部,河北 張家口 075000;2呼吸內(nèi)科)

        急性肺損傷(ALI)是一種常見的比較嚴(yán)重的臨床并發(fā)癥,由肺炎、尿毒癥、外傷等因素引起的,主要表現(xiàn)為呼吸困難、咯血、肺水腫等,嚴(yán)重時可誘發(fā)急性呼吸窘迫綜合征,其病死率為40%左右〔1〕。相關(guān)文獻〔2〕表明,炎癥反應(yīng)的失控和炎癥因子的異常表達是ALI發(fā)病的主要機制。不具備蛋白編碼能力的長鏈非編碼RNA(lncRNA)可參與調(diào)控疾病的生理過程。長鏈非編碼RNA-X染色體失活特異轉(zhuǎn)錄物(lncRNA XIST)作為lncRNA的一員,在腫瘤細胞中研究較多,在胃癌〔3〕、乳腺癌〔4〕、卵巢癌〔5〕中均呈現(xiàn)高表達,然而其在ALI方面的研究較少。目前已證實lncRNA XIST在ALI模型中顯著上調(diào)表達〔6〕,但是其具體的作用機制尚不完全清楚。因此,本研究將通過構(gòu)建ALI模型大鼠,并沉默lncRNA XIST表達,進而探討lncRNA XIST對ALI大鼠炎癥反應(yīng)和細胞凋亡的影響及其可能的分子機制,為治療ALI提供新的依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1試劑與儀器 脂多糖(LPS)購自上海新睿生物科技有限公司;含有l(wèi)ncRNA XIST-NC和lncRNA XIST-shRNA的psiCHECK2重組載體質(zhì)粒購自上海吉瑪生物公司;核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB/核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白(NLRP)3炎性體通路激活劑CHPG購自MedChemExpress公司;Opti-MEM培養(yǎng)基和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒,髓過氧化物酶(MPO)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6和IL-1β試劑盒均購自上海晶抗生物工程有限公司;末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)試劑盒和電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑購自上海翌圣生物科技有限公司;活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved caspase)-3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3、NF-κB p65、p-NF-κB p65、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)、NLRP3、Cleaved caspase-1、Caspase-1抗體購自美國Abcam公司。酶標(biāo)儀購自上海美谷分子儀器有限公司;電子天平購自上海精密儀器儀表有限公司;光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡購自上海豫光儀器有限公司;組織石蠟包埋機和切片機購自孝感康瑞德電子科技有限公司。

        1.2實驗動物 健康SD大鼠,雄性,SPF級,共60只,體重160~180 g,均購自北京邁德康納生物技術(shù)有限公司,實驗動物許可證號為SYXK(京)2020-0050。所有大鼠在濕度為(55±5)%、溫度為21~25℃的條件下飼養(yǎng)。

        1.3動物分組、造模及l(fā)ncRNA干預(yù) 將60只SD大鼠隨機分組為Control組、ALI組、lncRNA XIST-NC組、lncRNA XIST-shRNA組和lncRNA XIST-shRNA+CHPG組,每組12只。除了Control組之外,其余各組大鼠均采用腹腔注射5 mg/kg LPS〔7〕進行ALI造模。利用Opti-MEM培養(yǎng)基將10 μl的Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、5 μg的lncRNA XIST-NC或lncRNA XIST-shRNA的重組載體質(zhì)粒各稀釋至30 μl,靜置后將二者混勻得到質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物。lncRNA XIST-NC組和lncRNA XIST-shRNA組大鼠分別于造模后從尾靜脈注射lncRNA XIST-NC和lncRNA XIST-shRNA質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物,lncRNA XIST-shRNA+CHPG組大鼠在lncRNA XIST-shRNA組大鼠的基礎(chǔ)上再注射0.5 mg/kg NF-κB/NLRP3炎性體通路激活劑CHPG〔8〕,而Control組和ALI組大鼠則注射等量的Opti-MEM培養(yǎng)基。

        1.4肺組織lncRNA XIST水平的檢測 各組大鼠按照1.3的方法進行處理,7 d后將其處死并取出左上肺組織,采用TRIzol試劑提取肺組織總RNA,然后將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,并以此為模板,按照qRT-PCR試劑盒和儀器的使用說明進行PCR。所得數(shù)據(jù)使用GAPDH作為內(nèi)參進行歸一化,并采用2-ΔΔCt法計算lncRNA XIST相對表達量。lncRNA XIST引物序列為:正向5′-AGGGTGTGTGTGCATATGGA-3′,反向5′-CCGCCATCTTTTCCTGTACG-3′。

        1.5肺病理變化的觀察 取各組大鼠右上肺組織,用4%甲醛固定48 h,用乙醇脫水,然后將其進行石蠟包埋和切片。完成后采用HE法對切片進行染色,中性膠密封。最后使用光學(xué)顯微鏡評估肺組織病理變化。

        1.6肺濕/干比的測定 各組大鼠處死后,切除右肺中葉,使用吸水紙吸去表面水分,用電子天平進行稱重并記錄濕重(W)。然后將其置于60℃干燥箱中,重量不再變化時停止烘干,再次進行稱重并記錄為干重(D)。W/D值即可評價肺水腫。

        1.7MPO活力的測定 將各組大鼠左肺中葉制備成組織勻漿,并按照1∶19的質(zhì)量體積比加入MPO試劑,然后放置于96孔板上,在60℃下水浴15 min,最后使用酶標(biāo)儀在460 nm處測定吸光度值,并計算其活力值。MPO活力值(U/g)=(A實驗-A對照)/11.3×肺組織質(zhì)量(g)。

        1.8炎癥因子水平的測定 各組大鼠頸主動脈取血,通過離心獲得其上清液,參照酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒說明書的方法檢測血清中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平。

        1.9大鼠肺組織細胞凋亡的檢測 按照TUNEL試劑盒的說明對各組肺組織切片進行處理,然后加入50 μl TUNEL溶液,37℃孵育5 min,在熒光顯微鏡下觀察各組大鼠肺組織細胞凋亡情況。

        1.10凋亡相關(guān)蛋白及NF-κB/NLRP3炎性體通路相關(guān)蛋白表達水平的檢測 將從各組大鼠右下肺葉中提取的總蛋白進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,并轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,脫脂牛奶封閉后,加入Cleaved caspase-3、Caspase-3、NF-κB p65、p-NF-κB p65、ASC、NLRP3、Cleaved caspase-1、Caspase-1一抗過夜孵育,然后用對應(yīng)二抗繼續(xù)孵育2 h,添加ECL試劑進行顯色,并使用Image J軟件對上述蛋白水平進行分析。

        1.11統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件單因素方差分析。

        2 結(jié) 果

        2.1lncRNA XIST在各組肺組織中表達水平 ALI組肺組織中l(wèi)ncRNA XIST水平顯著高于Control組(P<0.05);lncRNA XIST-shRNA組肺組織中l(wèi)ncRNA XIST水平顯著低于ALI組和lncRNA XIST-NC組(P<0.05);lncRNA XIST-shRNA+CHPG組肺組織中l(wèi)ncRNA XIST水平顯著明顯高于lncRNA XIST-shRNA組(P<0.05),見表1。

        2.2lncRNA XIST-shRNA對各組損傷的影響 Control組肺部沒有病變跡象;ALI組肺部病變嚴(yán)重,出現(xiàn)大量炎性細胞,肺泡壁加厚且肺泡血管阻塞;與ALI組比較,lncRNA XIST-shRNA組肺部病灶明顯減少,炎性細胞數(shù)量也減少;而lncRNA XIST-shRNA+CHPG組肺部病灶比lncRNA XIST-shRNA組明顯變多。見圖1。與Control組相比,ALI組W/D值和MPO活力值明顯升高(P<0.05);與ALI組和lncRNA XIST-NC組相比,lncRNA XIST-shRNA組W/D值和MPO活力值明顯下降(P<0.05);而lncRNA XIST-shRNA+CHPG組W/D值和MPO活力值明顯高于lncRNA XIST-shRNA組(P<0.05),見表1。

        圖1 各組肺病理變化(HE染色,×200)

        2.3lncRNA XIST-shRNA對ALI大鼠血清炎癥因子的影響 與Control組相比,ALI組TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著升高(P<0.05);與ALI組和lncRNA XIST-NC組相比,lncRNA XIST-shRNA組TNF-α、IL-6和IL-1β水平明顯降低(P<0.05);與lncRNA XIST-shRNA組相比,lncRNA XIST-shRNA+CHPG組TNF-α、IL-6和IL-1β水平明顯升高(P<0.05),見表1。

        表1 lncRNA XIST-shRNA對ALI大鼠肺組織損傷、lncRNA XIST表達及血清炎癥因子的影響

        2.4lncRNA XIST-shRNA對ALI大鼠肺組織細胞凋亡的影響 ALI組肺組織細胞凋亡率和Cleaved caspase-3表達明顯高于Control組(P<0.05);與ALI組和lncRNA XIST-NC組相比,lncRNA XIST-shRNA組肺組織細胞凋亡率和Cleaved caspase-3表達明顯減少(P<0.05),而lncRNA XIST-NC組和ALI組肺組織細胞凋亡率和Cleaved caspase-3表達沒有顯著差異;與lncRNA XIST-shRNA組相比,lncRNA XIST-shRNA+CHPG組肺組織細胞凋亡率和Cleaved caspase-3表達顯著增加(P<0.05),見圖2、表2、圖3。

        圖2 各組肺組織細胞凋亡(TUNEL染色,×200)

        表2 lncRNA XIST-shRNA對ALI大鼠凋亡及肺組織NF-κB/NLRP3炎性體通路相關(guān)蛋白表達的影響

        1~5:Control組、ALI組、lncRNA XIST-NC組、lncRNA XIST-shRNA、lncRNA XIST-shRNA+CHPG組;圖4同圖3 各組肺組織中凋亡蛋白表達比較

        2.5lncRNA XIST-shRNA對ALI大鼠肺組織NF-κB/NLRP3炎性體通路相關(guān)蛋白表達的影響 p-NF-κB p65、ASC、NLRP3和Cleaved caspase-1在ALI組的表達明顯高于Control組(P<0.05);p-NF-κB p65、ASC、NLRP3和Cleaved caspase-1在lncRNA XIST-shRNA組的表達明顯低于ALI組和lncRNA XIST-NC組(P<0.05);p-NF-κB p65、ASC、NLRP3和Cleaved caspase-1在lncRNA XIST-shRNA+CHPG組的表達顯明顯高于lncRNA XIST-shRNA組(P<0.05),見表2、圖4。

        圖4 各組肺組織NF-κB/NLRP3炎性體通路相關(guān)蛋白表達比較

        3 討 論

        lncRNA XIST在多種疾病中均起作用。有研究表明,lncRNA XIST的敲減不僅能夠減弱氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡及炎癥、氧化損傷〔9〕;也能改善膿毒癥大鼠的心功能和存活率,降低細胞凋亡〔10〕;還能在體外抑制單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎臟的凋亡、炎癥和纖維化〔11〕。上述證據(jù)均表明lncRNA XIST低表達具有抑制凋亡和炎癥反應(yīng)的作用。據(jù)文獻〔12〕報道,ALI可導(dǎo)致肺組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生,因而改善ALI誘導(dǎo)的肺組織病理損傷的最主要方式就是降低炎癥反應(yīng)。lncRNA XIST在ALI中的功能和作用機制還需進一步研究。

        ALI患者的主要病理特征之一是肺水腫和炎癥細胞的浸潤。陳蘭英等〔13〕研究顯示,LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞明顯增多,其中白細胞和中性粒細胞占大多數(shù)。而反映中性粒細胞數(shù)量的標(biāo)志物就是MPO,已有報道〔14〕顯示MPO含量在ALI大鼠肺組織勻漿中明顯增多。而炎癥因子水平也是評估炎癥反應(yīng)炎癥程度的指標(biāo)。研究〔15〕指出,TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高可促進炎癥反應(yīng)發(fā)生。本研究結(jié)果說明LPS能夠誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。W/D比值是肺水腫的主要評估方法。本文提示沉默lncRNA XIST可改善ALI大鼠的炎癥反應(yīng)和肺水腫,沉默lncRNA XIST能夠抑制ALI大鼠的炎癥反應(yīng)。

        肺組織細胞的過度凋亡是ALI的另一個病理特征。Caspase-3是細胞凋亡的重要調(diào)控因子,其經(jīng)過切割活化后會變成Cleaved caspase-3。多項研究〔16,17〕表明,Cleaved caspase-3/Caspase-3比值的降低可以緩解LPS引起的ALI。TUNEL染色結(jié)果說明沉默lncRNA XIST可有效抑制ALI大鼠肺組織細胞凋亡。

        NF-κB/NLRP3炎性體通路與LPS誘導(dǎo)的ALI關(guān)系密切,而NLRP3炎性體包括NLRP3、ASC、Caspase-1三個部分,在炎癥方面有著非常重要的作用。Song等〔18〕發(fā)現(xiàn),維拉帕米可能通過抑制NF-κB/NLRP3通路對LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI產(chǎn)生一定的保護作用。Yang等〔19〕指出,miR-16直接靶向TLR4降低了NF-κB和NLRP3炎癥小體的水平,進而改善LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI。Shi等〔20〕表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子結(jié)合蛋白(Rcn)3敲低通過抑制NF-κB通路和NLRP3依賴性炎癥小體的激活減弱LPS誘導(dǎo)的ALI和肺泡炎癥。本研究結(jié)果提示lncRNA XIST沉默可抑制NF-κB/NLRP3通路的激活。沉默lncRNA XIST可能通過抑制NF-κB/NLRP3通路的激活降低ALI大鼠的炎癥反應(yīng)和細胞凋亡。

        綜上所述,沉默lncRNA XIST在一定程度上可改善ALI大鼠的炎癥反應(yīng)和細胞凋亡,其機制是抑制NF-κB/NLRP3炎性體通路的激活,為ALI提供新的治療策略。

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