謝娟珂，張亞楠，王 倩，陳圓輝，張翠蓮

(河南省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，河南 鄭州 450000)

自1978年世界首例試管嬰兒Louise Brown誕生以來(lái)，輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)已成為治療不孕癥的重要方法[1]。但同時(shí)ART技術(shù)的安全性也日益成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。在ART治療過(guò)程中，超生理劑量的激素類藥物使用是否會(huì)對(duì)女性遠(yuǎn)期健康產(chǎn)生不良影響，值得關(guān)注；促排卵藥物的使用會(huì)使機(jī)體性激素水平升高，反復(fù)周期性使用促排卵藥物是否會(huì)增加女性遠(yuǎn)期罹患乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌等婦科腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，以及內(nèi)分泌代謝系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)的遠(yuǎn)期并發(fā)癥等風(fēng)險(xiǎn)是否會(huì)增加，目前尚無(wú)定論[2]。雖然，目前大多數(shù)研究報(bào)道對(duì)ART的安全性持樂(lè)觀態(tài)度，但由于ART未經(jīng)正常生殖活動(dòng)中的自然選擇過(guò)程，可能會(huì)將一些缺陷遺傳給下一代[3]。

在臨床工作中，為提高妊娠率，常使用控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)來(lái)促進(jìn)卵巢內(nèi)多個(gè)卵泡同時(shí)發(fā)育，由此獲得更多的胚胎進(jìn)行移植。但部分不孕患者在接受1次COH治療后并不能成功妊娠，需要接受多個(gè)COH周期。本研究通過(guò)比較不同COH次數(shù)患者的臨床資料，探討反復(fù)COH對(duì)胚胎發(fā)育潛能及臨床妊娠結(jié)局的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2014年1月至2020年7月于河南省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心接受體外受精-胚胎移植(invitrofertilization-embryo transfer，IVF-ET)助孕治療的7 086例患者的臨床資料。病例納入標(biāo)準(zhǔn):(1)女方年齡≤35歲；(2)新鮮取卵周期，受精方式為IVF；(3)不孕年限<5 a；(4)基礎(chǔ)卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH) 5.00～10.00 IU·L-1；(5)COH次數(shù)≤4。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)夫婦雙方染色體均異常；(2)卵巢功能不全[4]；(3)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)[5]及反復(fù)種植失敗[6]者；(4)補(bǔ)救單精子卵胞漿內(nèi)注射(rescue intra-cytoplasmic sperm injection,Re-ICSI)助孕周期、經(jīng)皮附睪穿刺取精(percutaneous epididymal sperm aspiration，PESA)助孕周期、睪丸穿刺取精(testicular sperm aspiration，TESA)周期、顯微手術(shù)取精助孕周期、供精/卵助孕周期者。根據(jù)COH次數(shù)將患者分為A組(首次行COH者)、B組(第2次行COH者)及C組(第3次或第4次行COH者)。3組患者的年齡、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)、不孕類型、基礎(chǔ)卵泡雌激素(base follicle-stimulating hormone,b-FSH)、抗苗勒管激素(anti-müllerian hormone,AMH)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)，具有可比性。本研究經(jīng)河南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。

表1 3組患者一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 促排卵方案及卵母細(xì)胞的采集與處理接受助孕治療的患者按常規(guī)方案進(jìn)行COH[7]，當(dāng)雙側(cè)卵巢的主導(dǎo)卵泡直徑≥18 mm時(shí)，肌內(nèi)注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)10 000 U，36～37 h后在陰道超聲引導(dǎo)下，采集卵冠丘復(fù)合物，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)6%CO2、體積分?jǐn)?shù)5%O2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 精液處理采用密度梯度離心法處理精液。對(duì)液化后的精液進(jìn)行充分混勻，將精液放入密度梯度液上方，以1 500 r·min-1離心15 min，棄去精子沉淀團(tuán)上的大部分上清液，用2 mL培養(yǎng)液重懸精子沉淀團(tuán)，輕輕吹打后，1 500 r·min-1離心5 min，用培養(yǎng)液再次重懸精子沉淀團(tuán)，并用精子全自動(dòng)分析儀測(cè)定精子濃度和活動(dòng)率。

1.2.3 授精授精時(shí)取精子上游液最上層精子調(diào)整密度至(1～2)×109L-1，精子加入含有卵冠丘復(fù)合物的培養(yǎng)液微滴，每滴(50 μL)約含5 000～10 000 條精子；短時(shí)受精患者，精卵共孵育約4 h后機(jī)械剝離顆粒細(xì)胞；長(zhǎng)時(shí)受精患者，授精16～18 h后機(jī)械剝離顆粒細(xì)胞。

1.2.4 胚胎觀察及評(píng)分授精后16～18 h觀察胚胎受精情況，以出現(xiàn)2個(gè)原核及2個(gè)極體作為正常受精的標(biāo)準(zhǔn)。按照本中心常規(guī)培養(yǎng)胚胎流程進(jìn)行培養(yǎng)。取卵后第2天和第3天分別于倒置顯微鏡下評(píng)估卵裂期胚胎的形態(tài)。本中心卵裂期胚胎評(píng)分參考Brian Dale評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[8]：1級(jí)：細(xì)胞大小均勻、形態(tài)規(guī)則，透明帶完整，胞質(zhì)清晰、無(wú)顆?，F(xiàn)象，碎片比例<5%；2級(jí)：細(xì)胞大小略不均勻、形態(tài)略不規(guī)則，胞質(zhì)內(nèi)可見顆?，F(xiàn)象，碎片比例6%～20%；2.5級(jí)：細(xì)胞大小均勻或略不均勻、形態(tài)規(guī)則或略不規(guī)則，碎片比例21%～25%；3級(jí)：細(xì)胞大小明顯不均勻、形態(tài)明顯不規(guī)則，胞質(zhì)內(nèi)可見顆?，F(xiàn)象，碎片比例 26%～50%；4級(jí)：細(xì)胞大小嚴(yán)重不均勻，胞質(zhì)內(nèi)可見嚴(yán)重的顆?，F(xiàn)象，碎片比例>50%?？衫门咛ヅ袛鄻?biāo)準(zhǔn)為：1級(jí)、2級(jí)或2.5級(jí)胚胎，且同時(shí)滿足取卵后第1天正常受精、取卵后第2天至第3天至少增長(zhǎng)2個(gè)卵裂球、取卵后第3天胚胎卵裂球數(shù)≥4個(gè)。

1.3 觀察指標(biāo)記錄3組患者胚胎發(fā)育指標(biāo)，包括卵子成熟率、正常受精率、正常卵裂率和可利用胚胎率。卵子成熟率=成熟卵子數(shù)/獲卵數(shù)×100%；正常受精率=兩原核胚胎數(shù)/獲卵數(shù)×100%；正常卵裂率=第2天發(fā)生卵裂的兩原核胚胎數(shù)/兩原核胚胎總數(shù)×100%；可利用胚胎率=第3天可利用胚胎數(shù)/第2天發(fā)生卵裂的兩原核胚胎數(shù)×100%。

1.4 臨床結(jié)局評(píng)價(jià)患者于胚胎移植后按黃體支持方案繼續(xù)給予黃體支持，移植后14 d測(cè)外周血β-人絨毛膜促性腺激素(β-human chorionic gonadotropin,β-HCG)水平，β-HCG≥50 IU·L-1為生化妊娠。生化妊娠者于移植后4～5周行陰道超聲檢查，若有孕囊及原始心管搏動(dòng)，則為臨床妊娠。若 β-HCG陽(yáng)性、子宮內(nèi)未見孕囊，但宮外附件區(qū)可見孕囊者，經(jīng)腹腔鏡及術(shù)后組織病理檢查確診為異位妊娠，并及時(shí)處理。妊娠不足28周、胎兒體質(zhì)量不足1 000 g而終止妊娠者為流產(chǎn)。流產(chǎn)發(fā)生于妊娠12周前者為早期流產(chǎn)。胚胎種植率=胎心數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%；生化妊娠率=生化妊娠例數(shù)/移植周期數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠例數(shù)/移植周期數(shù)×100%；異位妊娠率=異位妊娠例數(shù)/臨床妊娠例數(shù)×100%；流產(chǎn)率=早期流產(chǎn)例數(shù)/臨床妊娠例數(shù)×100%；早期流產(chǎn)率=早期流產(chǎn)例數(shù)/臨床妊娠例數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 3組患者胚胎發(fā)育指標(biāo)比較結(jié)果見表2。3組患者的卵子成熟率、正常受精率隨COH次數(shù)的增加有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。A組患者的正常卵裂率和可利用胚胎率均顯著高于B組、C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；B組與C組患者的正常卵裂率、可利用胚胎率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 3組患者胚胎發(fā)育指標(biāo)比較

2.2 3組患者臨床妊娠結(jié)局比較結(jié)果見表3。A組患者的胚胎種植率、生化妊娠率、臨床妊娠率均顯著高于B組和C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；B組與C組患者的胚胎種植率、生化妊娠率、臨床妊娠率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組患者的異位妊娠率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。B組患者的流產(chǎn)率和早期流產(chǎn)率顯著高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其余各組患者流產(chǎn)率和早期流產(chǎn)率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 3組患者妊娠結(jié)局比較

3 討論

在應(yīng)用ART治療不孕不育患者的過(guò)程中，很多患者由于沒(méi)有足夠的可利用胚胎，需要經(jīng)過(guò)多個(gè)治療周期才能得到活產(chǎn)嬰兒。這些患者在一定時(shí)間內(nèi)需要進(jìn)行多次控制性促排卵治療，COH治療是否會(huì)對(duì)子代健康、女性健康，尤其是卵巢的結(jié)構(gòu)和功能造成影響，已成為不可忽視的問(wèn)題?；诖耍狙芯炕仡櫺苑治隽私邮躀VF-ET助孕治療患者的臨床資料，旨在探討反復(fù)COH對(duì)胚胎發(fā)育潛能及妊娠結(jié)局的影響。為排除由于年齡及卵巢功能不全造成的影響，研究對(duì)象均為年齡≤35歲且卵巢儲(chǔ)備功能正常的女性，同時(shí)排除夫婦雙方染色體異常者、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及反復(fù)種植失敗者；為排除男方因素的影響，排除Re-ICSI周期、PESA周期、TESA周期、顯微手術(shù)取精周期及供精/卵助孕周期者。通過(guò)比較各組患者胚胎發(fā)育指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，3組患者的卵子成熟率、正常受精率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；A組患者正常卵裂率和可利用胚胎率均顯著高于B組、C組，B組與C組患者的正常卵裂率、可利用胚胎率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究還發(fā)現(xiàn)，A組患者的胚胎種植率、生化妊娠率、臨床妊娠率均顯著高于B組和C組，但A組患者的異位妊娠率與B組和C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果提示，多次COH可能會(huì)影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量及胚胎的發(fā)育潛能，繼而影響妊娠結(jié)局。

目前已有關(guān)于COH治療的安全性評(píng)估報(bào)道，但尚無(wú)定論。這些評(píng)估大多是針對(duì)臨床病例的調(diào)查性研究，缺乏對(duì)COH遠(yuǎn)期影響的評(píng)估。ART的實(shí)施階段正處于表觀遺傳重編輯的關(guān)鍵時(shí)期，若在ART治療過(guò)程中，基因印記缺失發(fā)生于配子形成過(guò)程，不僅會(huì)影響胚胎形成、發(fā)育、胎盤分化及胎兒生長(zhǎng)，還會(huì)導(dǎo)致印記基因失調(diào)性疾病[9]，這可能與 IVF 過(guò)程中應(yīng)用培養(yǎng)液或促排卵藥物有關(guān)，但也不能排除是不孕因素本身導(dǎo)致的配子形成受損，目前尚缺乏確切的證據(jù)。對(duì)動(dòng)物模型的研究發(fā)現(xiàn)，COH以劑量依賴的方式影響卵母細(xì)胞DNA的甲基化修飾水平[10]，且對(duì)早期胚胎表觀遺傳學(xué)修飾有明顯的影響[11]。在小鼠實(shí)驗(yàn)和人體研究中[12]，使用大劑量的促性腺激素后，除H19以外，印記基因DNA甲基化并未發(fā)生改變。但另有研究發(fā)現(xiàn)，COH并不會(huì)引起胚胎印記基因的改變[13]。以上研究均表明了COH不會(huì)明顯影響卵母細(xì)胞印記基因的DNA甲基化模式，但會(huì)影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量。

反復(fù)COH可影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量，但具體機(jī)制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，反復(fù)COH可以對(duì)小鼠的卵巢造成氧化損傷，引起線粒體DNA突變[14]，造成小鼠卵母細(xì)胞中細(xì)胞器分布的改變[15]，引起胚胎發(fā)育延緩，增加異常囊胚形成的概率，造成胎兒生長(zhǎng)遲緩。這些改變表明COH可能影響了小鼠卵母細(xì)胞的質(zhì)量[16]。另有報(bào)道指出，反復(fù)的卵巢刺激可增加小鼠卵母細(xì)胞紡錘體缺陷的發(fā)生率[17]。本課題組前期研究證明，反復(fù)COH可降低小鼠顆粒細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)，影響顆粒細(xì)胞線粒體編碼基因的表達(dá)[18]。卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能與其周圍的顆粒細(xì)胞相關(guān)[19]。顆粒細(xì)胞為卵母細(xì)胞的發(fā)育提供能量及必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在真核生物中，線粒體是提供能量和代謝底物的基礎(chǔ)細(xì)胞器。有研究表明，小鼠卵母細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)下降至正常值的11%時(shí)不會(huì)影響排卵及卵子的受精能力，但當(dāng)小鼠胚胎的線粒體拷貝數(shù)少于50 000時(shí)其著床能力會(huì)受到影響[20]。說(shuō)明線粒體拷貝數(shù)達(dá)到一定閾值時(shí)胚胎才能正常發(fā)育。因此，推測(cè)反復(fù)COH可能影響了顆粒細(xì)胞的線粒體功能，從而影響卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能。本研究中患者的2PN胚胎卵裂率及可利用胚胎率隨促排次數(shù)的增加而下降，證實(shí)了反復(fù)COH對(duì)卵子成熟及胚胎發(fā)育潛能有影響。

此外，有研究發(fā)現(xiàn)，COH對(duì)小鼠子代有不利影響[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，反復(fù)COH可以造成恒河猴子代卵巢結(jié)構(gòu)和功能的改變[22]。DIAMOND等[23]進(jìn)行的臨床調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)的COH可能會(huì)影響卵巢的反應(yīng)性和(或)改變卵母細(xì)胞的質(zhì)量。有研究發(fā)現(xiàn)，在IVF治療的5個(gè)周期中，每個(gè)周期獲得的卵子數(shù)目基本相同，并且卵子質(zhì)量也無(wú)明顯差異，故反復(fù)COH過(guò)程中年齡的增長(zhǎng)可能才是妊娠率、出生率低的決定性因素[24]。雖然越來(lái)越多的研究者專注于反復(fù)COH對(duì)卵巢或卵母細(xì)胞的影響，但迄今為止未能得到明確結(jié)論，這可能是因?yàn)椴煌芯恐谢颊叩纳眢w狀況不同、藥物使用不一致或隨訪時(shí)間不同等造成的[25]。

目前主要提倡自然周期IVF，有研究認(rèn)為，自然周期可以減少潛在的不良圍產(chǎn)期結(jié)局，同時(shí)得到健康子代的概率又不低于COH治療的患者[26]。本研究結(jié)果也提示，多次COH可能會(huì)影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量、胚胎發(fā)育潛能及妊娠結(jié)局。ART治療不應(yīng)追求獲卵數(shù)，而應(yīng)提高卵子的利用率，減少并發(fā)癥的發(fā)生。但本研究尚有一定的局限性，如不同患者使用的促排卵藥物不盡相同，且不能排除混雜因素的影響，故反復(fù)COH對(duì)胚胎發(fā)育潛能及妊娠結(jié)局的影響，尚需進(jìn)一步的研究。