尚海巍

(遼寧科技學院 生物醫(yī)藥與化學工程學院，遼寧 本溪117004)

逆向工程是通過對產品進行逆向解析，剖析產品中部分輔料含量的一種方法，它可以有效降低仿制藥開發(fā)的難度，縮短分析時間，為我國的仿制藥質量與療效一致性評價提供了一條新思路[1]。

薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯(IPM)都可以作為透皮制劑的促滲劑，對某些藥物的促滲作用比氮酮還要強[2-3]。二者均可以可逆地改變皮膚結構，降低皮膚對藥物的阻礙，增加藥物透皮吸收速率從而增加藥物透過量[4-5]?；瘜W結構如圖1所示。

圖1 薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯的結構示意圖

氟比洛芬(Flurbiprofe, FP)是一種芳基丙酸類非甾體抗炎藥，常用于治療關節(jié)炎，緩解疼痛[6-7]。氟比洛芬凝膠貼膏具有透皮性能高，吸收起效快，作用時間長，副作用小等特點，受到人們的廣泛關注[8]。目前國內已上市的氟比洛芬凝膠貼膏有得百安和澤普思兩種。經查閱，兩種氟比洛芬的市售制劑中均采用薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯作為促滲劑，促進氟比洛芬的經皮透過量。為了進一步確定市售凝膠貼膏中薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯的含量，文章采用“逆向工程”技術對其進行了研究。

藥典及相關文獻都只有單獨一種促滲劑的含量測定方法，沒有同時測定兩種化學促滲劑的方法[9-11]。本文建立了可以同時測定薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯含量的方法。通過測定市售氟比洛芬凝膠貼膏中薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯的含量，證明該方法可簡單，快速，高效的測定氟比洛芬凝膠貼膏中兩種促滲劑的含量，也為其他透皮制劑中兩種促滲劑含量的同時測定提供了方向。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 7890A氣相色譜儀(FID檢測器，安捷倫科技有限公司)、KQ-500E型超聲清洗器(昆山超聲儀器系統(tǒng)有限公司)、ML204T電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

1.2 試藥

薄荷醇(安徽銀豐藥業(yè)股份有限公司)、肉豆蔻酸異丙酯(上海凜恩科技發(fā)展有限公司)、水楊酸甲酯(分析純，天津市大茂化學試劑廠)、無水乙醇(色譜純，山東禹王和天下新材料有限公司)、得百安氟比洛芬凝膠貼膏(北京泰德制藥股份有限公司)、澤普思氟比洛芬凝膠貼膏(北京泰德制藥股份有限公司)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent DB-5毛細管色譜柱(50 m×320 μm×0.52 μm)；檢測器：氫火焰離子化檢測器(FID)；進樣口溫度: 230 ℃；檢測器溫度:240 ℃；分流比：10∶1；進樣量：1 μL；程序升溫：初始溫度88 °C, 保持1 min, 以20 °C·min-1的速率升溫至200 °C, 保持7 min, 以10 °C·min-1的速率升溫至220 °C后, 保持10 min。

2.2 溶液的配制

薄荷醇對照品儲備液的配制：取10 mg薄荷醇，精密稱定，置100 mL量瓶中，無水乙醇溶解稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.1 mg·mL-1的薄荷醇對照品儲備液。

肉豆蔻酸異丙酯對照品儲備液的配制：取100 mg肉豆蔻酸異丙酯，精密稱定，置100 mL量瓶中，無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度為1 mg·mL-1的肉豆蔻酸異丙酯對照品儲備液。

內標溶液的配制：取40 mg水楊酸甲酯，精密稱定，置100 mL量瓶中，無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.4 mg·mL-1的內標溶液。

混合對照品溶液的配制：精密移取薄荷醇對照品儲備液4 mL，肉豆蔻酸異丙酯對照品儲備液1 mL，內標溶液1 mL置10 mL量瓶中，無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，得薄荷醇濃度為0.04 mg·mL-1，肉豆蔻酸異丙酯濃度為0.1 mg·mL-1的對照品溶液。

供試品溶液的制備：取2 cm×2 cm的得百安，澤普思氟比洛芬凝膠貼膏，剪碎，置10 mL量瓶中，加無水乙醇約5 mL，超聲20 min，放冷，加內標溶液1 mL，無水乙醇定容至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

陰性對照溶液的制備：取不加薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯的氟比洛芬凝膠貼膏2 cm×2 cm，剪碎，置至10 mL量瓶中，加無水乙醇5 mL，超聲20 min，放冷，加內標溶液1 mL，無水乙醇定容至刻度，搖勻，作為陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性

取“2.2 溶液配制”項下的混合對照品溶液和供試品溶液，按“2.1 色譜條件”進行分析，各峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)大于5 000，拖尾因子在0.95 ～ 1.05之間。另取混合對照品溶液，連續(xù)進樣六次，計算薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯與內標峰面積比值的RSD值分別為0.7%和0.6%，表明系統(tǒng)適用性良好。

2.4 方法學驗證

2.4.1 專屬性

取“2.2 溶液的配制”項下的混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液、無水乙醇，按“2.1 色譜條件”進行分析，記錄色譜圖。結果顯示，供試品溶液中的薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯的色譜峰與對照品有相同的保留時間，無水乙醇、陰性對照溶液對供試品中薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯的含量測定沒有影響。各溶液的色譜圖如圖2所示。

2.4.2 線性與范圍

精密移取薄荷醇對照品儲備液1 mL、2 mL、3 mL、5 mL、6 mL、8 mL，肉豆蔻酸異丙酯對照品儲備液0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL，內標溶液1 mL置同一個10 mL量瓶中，無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，得薄荷醇濃度為0.01 mg·mL-1、

圖2 供試品溶液(A)和混合對照品溶液(B)的氣相色譜圖

0.02 mg·mL-1、0.03 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.06 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1，肉豆蔻酸異丙酯濃度為0.02 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1的系列混合對照品溶液。按“2.1 色譜條件”進行分析，以濃度C對薄荷醇、肉豆蔻酸異丙酯峰面積與內標溶液峰面積的比值A進行線性回歸，得到薄荷醇的線性回歸方程：A= 41.018C-0.035處5(r=0.999)，肉豆蔻酸異丙酯的線性回歸方程：A= 33.049C+0.726 8(r=0.999)。結果表明，薄荷醇在0.01 mg·mL-1～ 0.08mg·mL-1的濃度范圍內具有良好的線性相關性，肉豆蔻酸異丙酯在0.02 mg·mL-1～ 0.2 mg·mL-1的濃度范圍內具有良好的線性相關性。

2.4.3 重復性

取同一批次的得百安，澤普思氟比洛芬凝膠貼膏，按照“2.2 溶液的配制”項下供試品溶液配制方法，平行配制六份，按“2.1 色譜條件”進行分析。得百安，澤普思氟比洛芬凝膠貼膏中薄荷醇含量的RSD分別為6.1%，5.1%，肉豆蔻酸異丙酯含量的RSD分別為9.4%，7.9%，表明該方法重復性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性

取同一批次的得百安、澤普思氟比洛芬凝膠貼膏，按照“2.2 溶液的配制”項下供試品溶液配制方法，配制成供試品溶液，室溫放置，分別于 0、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h 進樣測定，記錄色譜峰面積。薄荷醇，肉豆蔻酸異丙酯與內標峰面積的比值RSD值分別為0.4%，0.6%，表明供試品溶液在室溫下放置10 h穩(wěn)定。

2.4.5 回收率

取同一批次制作的陰性對照溶液1 mL，精密量取，置10 mL量瓶中(共9份)，作為本底。分別移取0.1 mg·mL-1的薄荷醇對照品溶液2.4 mL、3 mL、3.6 mL，1 mg·mL-1濃度的肉豆蔻酸異丙酯對照品溶液0.8 mL，1 mL，1.2 mL，內標溶液1 mL各三份置于上述9個10 mL量瓶中，無水乙醇稀釋至刻度搖勻，即得80%(L)、100%(M)、120%(H)的準確度溶液。將這9個樣品按“2.1 色譜條件”分別進行分析，采用內標法計算回收率，結果如表1所示，薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯的平均回收率分別為100.5%和101.7%，RSD分別為0.8%和1.1%，表明該方法準確度良好。

表1 回收率實驗結果(n=9)

2.5 含量測定

取同一批次的得百安、澤普思氟比洛芬凝膠貼膏，按照“2.2 溶液的配制”項下供試品溶液配制方法，平行配制六份，按“2.1 色譜條件”進行分析。用內標法計算兩種市售氟比洛芬凝膠貼膏中薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯的含量，結果如表2所示。

表2 不同氟比洛芬凝膠貼膏市售制劑中薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯的含量測定結果(Mean±SD n=6)

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

查閱相關數(shù)據得知，薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯的沸點相差23 °C，采用以極性和沸點作為分離基礎的色譜柱更容易分離[12]。內標法可以避免由于操作條件等變化所引起的誤差，測定結果比較準確。水楊酸甲酯不會對薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯的含量測定造成影響，且位于薄荷醇色譜峰附近[13]。因此選用水楊酸甲酯作為內標物。通過調整柱溫升溫的速率和保持時間，改善薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯色譜峰的分離效果，最終確定初始溫度88 °C, 保持1 min, 以20 °C·min-1的速率升溫至200 °C, 保持7 min, 以10 °C·min-1的速率升溫至220 °C后, 保持10 min為最佳程序升溫條件。

3.2 含量測定結果分析

由含量測定結果可知，得百安與澤普思氟比洛芬凝膠貼膏兩種市售制劑中所含的薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯含量不存在顯著性差異(P>0.05)。兩種市售制劑中薄荷醇的含量是15.57 mg/貼～18.27 mg/貼，肉豆蔻酸異丙酯的含量是33.60 mg/貼～42.70 mg/貼。文章所建立的揮發(fā)性成分的含量測定方法準確、可靠、操作方便，適用于測定氟比洛芬凝膠貼膏中薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯的含量，可以為凝膠貼膏的質量評價提供參考。

4 結論

文章建立了得百安，澤普思氟比洛芬凝膠貼膏中揮發(fā)性成分(薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯)“逆向工程”分析方法。結果表明，該方法可以簡便、快速、高效地測定氟比洛芬凝膠貼膏中薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯的含量，且兩者市售制劑中薄荷醇和肉豆蔻酸異丙酯的含量不存在顯著性差異(P>0.05)。