劉敏，趙雯，萬(wàn)林春

江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

丁香為桃金娘科植物丁香Eugenia caryophllataThunb.的干燥花蕾，當(dāng)花蕾由綠色轉(zhuǎn)紅時(shí)采摘，曬干［1］。丁香始載于《名醫(yī)別錄》［2］，別名“雞舌香”“丁子香”“公丁香”［3］。丁香中含大量揮發(fā)油，為酚類、酯類、烯類等成分；具有良好的抗菌、抗氧化、麻醉止痛作用［4-5］。丁香是藥食同源的藥材，在臨床、藥品、食品、香精香料等方面多有研究與運(yùn)用［6-8］。

目前，丁香質(zhì)量控制項(xiàng)為丁香酚，采用外標(biāo)法（ESM）進(jìn)行含量測(cè)定。然而，丁香中有效成分較多，僅控制丁香酚一項(xiàng)指標(biāo)難以反映丁香的整體質(zhì)量。一測(cè)多評(píng)（QAMS）法通過(guò)測(cè)定內(nèi)標(biāo)物的含量，以內(nèi)標(biāo)物與其他待測(cè)物間的檢測(cè)響應(yīng)值的比例關(guān)系（相對(duì)校正因子），來(lái)計(jì)算其他待測(cè)物的含量［9-10］。因此，QAMS 能夠解決對(duì)照品缺失和昂貴的問(wèn)題，還能夠提高方法的實(shí)用性，可以有效地、全面地控制中藥的質(zhì)量［11-12］。目前，一測(cè)多評(píng)法已成功應(yīng)用于連翹、廣藿香、蒼術(shù)、砂仁等揮發(fā)性藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)中［13-16］。而有關(guān)于丁香的一測(cè)多評(píng)方法的構(gòu)建未見(jiàn)報(bào)道。本課題擬建立丁香一測(cè)多評(píng)法，為丁香的質(zhì)量控制方法進(jìn)行補(bǔ)充，并為中藥的品質(zhì)評(píng)價(jià)方法研究提供參考。

1 儀器、試劑與試藥

1.1 儀器

Agilent 6890N 氣相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；GC-2010 氣相色譜儀（日本島津公司）；Agilent DBWAX 毛細(xì)管柱（30 m ×0.32 mm，0.25 μm；美國(guó)安捷倫公司）；SH Rtx-WAX毛細(xì)管柱（30 m ×0.32 mm，0.25 μm；日本島津公司）；BT25S 型電子天平、BSA124SCW 型電子天平［賽多利斯（北京）有限公司］。

1.2 試劑

均為分析純?cè)噭?/p>

1.3 試藥

丁香酚對(duì)照品（110725-201615，含量99.3%）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，β-石竹烯對(duì)照品（0001321406，含量98.5%）購(gòu)于美國(guó)SIGMA 公司，α-石竹烯對(duì)照品（Z25M8H36799，含量93.0%）、乙酸丁香酚酯對(duì)照品（Z25M8H36798，含量98.0%）均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。本試驗(yàn)收集的21 批次丁香樣品為國(guó)家藥品評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)（2017 年）樣品，樣品信息見(jiàn)表1。

圖1 丁香四個(gè)成分化學(xué)結(jié)構(gòu)式

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 色譜條件采用FID 檢測(cè)器，DB-WAX 毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm），載氣為N2，流速25 mL/min，H2 流速30 mL/min，空氣流速300 mL/min，柱溫170 ℃；進(jìn)樣口溫度280 ℃；檢測(cè)器溫度300 ℃，進(jìn)樣量1 μL，分流比10∶1。在上述色譜條件下，混合對(duì)照品和丁香樣品色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 色譜圖：A.混合對(duì)照品；B.丁香樣品

2.1.2 混合對(duì)照品溶液制備取丁香酚、β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯適量，精密稱定，加正己烷溶解，配制成含丁香酚、β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯分別為2.125 0、0.402 6、0.046 1、0.434 7 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液，置于8℃冰箱保存，備用。

2.1.3 供試品溶液制備取丁香樣品，粉碎，過(guò)24目篩，取過(guò)篩的丁香粉末約0.3 g，精密稱定，精密加入正己烷20 mL，稱定重量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）15 min，放置至室溫，再稱定重量，用正己烷補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察精密吸取混合對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 μL 注入氣相色譜儀，檢測(cè)各色譜峰。以對(duì)照品進(jìn)樣質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，色譜峰峰面積（X）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明丁香酚、β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯在測(cè)定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。保留時(shí)間、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍見(jiàn)表2。

表2 線性關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.1.5 精密度試驗(yàn)精密稱取同一丁香樣品（批號(hào)：316040085），按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定四種化合物峰面積。結(jié)果測(cè)得丁香酚、β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯峰面積的RSD 分別為1.3%、1.3%、1.3%、1.3%。表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、6、8、10、12、24h測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)下4 種化合物色譜峰面積，計(jì)算4 種化合物色譜峰面積的RSD。結(jié)果丁香酚、β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯峰面積的RSD 分別為1.5%、1.4%、1.9%、1.7%。表明供試品中4 種化合物在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取同一丁香樣品（批號(hào)：316040085）6 份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。測(cè)得丁香酚、β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯平均含量分別為147.208 4 mg/g、12.408 1 mg/g、1.642 5 mg/g、23.464 7 mg/g，RSD 分別為2.0%、1.4%、1.7%、2.0%。結(jié)果表明試驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率考察精密稱取同一丁香樣品（批號(hào)：316040085）6 份，每份0.15 g，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入每1 mL 含有丁香酚1.146 62 mg、β-石竹烯0.095 69 mg、α-石竹烯0.012 98 mg、乙酸丁香酚酯0.183 46 mg 的混合對(duì)照品正己烷溶液20 mL。按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備回收率樣品，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定4 種化合物色譜峰，分別計(jì)算丁香酚、β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯的加樣回收率以及RSD。結(jié)果見(jiàn)表3，表明方法回收率良好。

表3 丁香中四種活性成分的加樣回收率（n=6）

2.2 相對(duì)校正因子計(jì)算

2.2.1 丁香待測(cè)指標(biāo)相對(duì)校正因子計(jì)算依次精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 μL 分別進(jìn)樣，測(cè)定各成分色譜峰峰面積。以丁香酚為內(nèi)參物，計(jì)算β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯相對(duì)于丁香酚的f 值，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 相對(duì)校正因子

2.2.2 一測(cè)多評(píng)法的耐用性和系統(tǒng)適應(yīng)性評(píng)價(jià)精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，采用DB-WAX（30 m×0.32 mm×0.25 μm）、Rtx-WAX（30 m×0.32 mm×0.25 μm）兩種色譜柱，分別在Agilent 7890N、島津GC-2010 氣相色譜儀上進(jìn)樣分析，記錄4 種化合物色譜峰面積，計(jì)算以丁香酚為內(nèi)參物的β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚的相對(duì)校正因子，結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚的相對(duì)校正因子重現(xiàn)性良好。

表5 不同儀器及色譜柱測(cè)得的相對(duì)校正因子

2.3 一測(cè)多評(píng)法待測(cè)色譜峰的定位

為準(zhǔn)確定位待測(cè)色譜峰,試驗(yàn)分別用混合對(duì)照品溶液考察相對(duì)保留值和保留時(shí)間差在兩根不同的毛細(xì)管柱及兩臺(tái)不同的氣相色譜儀中的重現(xiàn)性。結(jié)果見(jiàn)表6，相對(duì)保留值的RSD 均小于2.0%，保留時(shí)間差的RSD 均小于8.0%；表明用相對(duì)保留值來(lái)定位色譜峰較為合理。

表6 不同儀器和色譜柱測(cè)得的相對(duì)保留值

2.4 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果的比較

分別精密吸取21 批次按“2.1.3”項(xiàng)下制備的丁香供試品溶液1 μL，用“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定4 種化合物的峰面積。采用外標(biāo)法和“一測(cè)多評(píng)”法分別計(jì)算丁香中丁香酚、β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯的含量，結(jié)果見(jiàn)表7。結(jié)果21 批丁香樣品中4 種化學(xué)成分（丁香酚、β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯）的一測(cè)多評(píng)法計(jì)算值與外標(biāo)法實(shí)測(cè)值之間相對(duì)誤差不超過(guò)3.0%。表明一測(cè)多評(píng)法用于丁香的多成分質(zhì)量評(píng)價(jià)研究是可行的。

表7 丁香中4種成分外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法含量測(cè)定比較（n=3） %

3 結(jié)論與討論

丁香中含有多種揮發(fā)性成分，其中丁香酚的含量高、穩(wěn)定性高，價(jià)格低廉易得，故選定丁香酚作為內(nèi)標(biāo)物。試驗(yàn)研究建立了以丁香酚為內(nèi)標(biāo)物，一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定丁香中β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯的含量，結(jié)果表明，建立的方法便捷、高效、專屬性強(qiáng)。采用一測(cè)多評(píng)法和外標(biāo)法分別測(cè)定21 批丁香中四種揮發(fā)性成分的含量，結(jié)果顯示兩種方法測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)誤差不超過(guò)3.0%，表明一測(cè)多評(píng)法在缺少部分對(duì)照品的情況下，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)丁香藥材的多指標(biāo)成分含量測(cè)定，并對(duì)丁香的質(zhì)量進(jìn)行更加全面的評(píng)價(jià)，為全面提升丁香藥材的質(zhì)量提供了新方法。