史萃菡，李綺琪，隋承融，束 剛，江青艷，朱燦俊

（華南農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院，廣東 廣州 510642）

【研究意義】采食是動物維持生命活動中營養(yǎng)攝取的首要過程。采食量決定營養(yǎng)攝入量，是保證動物遺傳潛力和生產(chǎn)性能充分發(fā)揮的關鍵因素，也是提高生產(chǎn)效率和經(jīng)濟效益的重要前提[1]。當豬的能量攝入與自身維持需要比從2.3提高到2.6后，其耗料增重比可以降低17%[2]。哺乳母豬的采食量對仔豬斷奶存活率、斷奶窩重、斷奶體重的影響呈正相關，且較高的采食量可以顯著減少哺乳母豬體質(zhì)量損失、縮短下次發(fā)情間隔時間[3]。影響畜禽采食的因素有很多，主要包括生理因素（如遺傳、感官刺激[4]）、環(huán)境因素（如溫度、濕度、飼養(yǎng)密度）、日糧因素（如飼料適口性、能量水平）和病理因素（如胃腸道疾病、寄生蟲）[5]。動物采食量受中樞多個核團組成的復雜“神經(jīng)網(wǎng)絡”調(diào)控。其中，循環(huán)系統(tǒng)的激素（瘦素、胰島素等）和營養(yǎng)素（葡萄糖、脂肪酸等）等信號跨血腦屏障直接被下丘腦食欲調(diào)控中樞所感應，并通過復雜的神經(jīng)投射系統(tǒng)傳入高級中樞進行信息整合，最終通過神經(jīng)-體液途徑以調(diào)控機體的采食量。此外，腸道、感覺器官（視覺、聽覺和嗅覺等）等信號還可通過外周神經(jīng)傳入腦干，經(jīng)腦干初步整合后通過神經(jīng)投射，一方面將信號傳遞至下丘腦等核團，引起能量穩(wěn)態(tài)介導的采食調(diào)控，另一方面將信號傳遞至中腦腹側(cè)被蓋區(qū)（ventral tegmental area，VTA）等核團，引起非能量穩(wěn)態(tài)（愉悅、偏好和獎賞等）介導的采食量調(diào)控[6]。因此，挖掘中樞潛在食欲調(diào)控核團，為提高畜禽采食量提供新的思路具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】能量的攝入量是由動物食欲決定的。饑餓禁食促使動物食欲增強，產(chǎn)生攝食行為，而持續(xù)的采食會引發(fā)飽感，進而停止攝食行為。饑餓、攝食和飽感間相互調(diào)節(jié)，最終決定食物攝入量。大腦作為食欲調(diào)控中樞，存在多個與攝食相關的核團，這些核團通過對食欲信號的感應、整合和傳遞，最終調(diào)控動物的采食量。下丘腦是調(diào)控代謝穩(wěn)態(tài)與能量平衡的關鍵腦區(qū)，其中弓狀核（arcuate hypothalamic nucleus，ARC）是下丘腦感受能量信號的重要核團之一，室旁核（paraventricular nucleus，PVN）、背內(nèi)側(cè)核（dorsomedial hypothalamic nucleus，DMH）、腹內(nèi)側(cè)核（ventromedial hypothalamic nucleus，VMH）和下丘腦旁側(cè)核（lateral hypothalamic area，LHA）等不僅可直接感應多種能量調(diào)控信號，還可接收來自ARC的食欲信號投射。除下丘腦介導的能量穩(wěn)態(tài)（homeostatic pathways）在食欲調(diào)控中發(fā)揮重要作用外，其他腦區(qū)也參與采食調(diào)控。研究表明：由紋狀體（corpus striatum）、VTA、伏隔核（accumbens nucleus，Acb）等核團介導的非能量穩(wěn)態(tài)（non-homeostatic pathways）在動物食欲調(diào)控中同樣發(fā)揮重要作用[7-9]（圖1）。綜上所述，動物的食欲調(diào)控是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)多個核團共同參與的復雜過程。神經(jīng)元興奮是其功能發(fā)揮的前提，F(xiàn)BJ小鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物（cellular Finkel-Biskis-Jinkins murine osteosarcoma viral oncogene homolog，c-Fos），是一種典型的即刻早期應答基因（immediate early response genes，IEG）[10-11]。神經(jīng)細胞受外界信號刺激，會快速誘導c-Fos基因表達。因此，目前普遍認為c-Fos 蛋白是神經(jīng)元激活的標志蛋白?！颈狙芯壳腥朦c】目前關于動物采食中樞的調(diào)控機制研究已有許多相關報道，激活下丘腦弓狀核的刺鼠相關蛋白（agouti-related peptide，AgRP）神經(jīng)元可顯著提高動物的食欲和采食量；相反，激活弓狀核的阿黑皮素原（pro-opiomelanocortin，POMC）神經(jīng)元則會引起降低食欲、導致厭食[12]；下丘腦室旁核（PVN）則主要參與飽腹感調(diào)節(jié)，從而阻止肥胖的發(fā)生等[13]。但是，上述研究主要集中在下丘腦等已知核團，大腦是否還存在更多與采食相關的核團，值得進一步探索?！緮M解決的關鍵問題】本研究擬選用C57BL/6 雄性小鼠為模型，通過c-Fos 免疫熒光技術檢測小鼠大腦中不同核團在持續(xù)禁食和恢復采食狀態(tài)下的興奮性變化，通過數(shù)據(jù)分析，篩選出參與食欲調(diào)控的潛在中樞核團。研究結(jié)果不僅可挖掘出調(diào)控動物食欲的新核團，豐富和完善動物采食中樞的調(diào)控機制，而且可望為研發(fā)高效、安全的新型誘食劑提供新的靶點，具有重要的科學意義和實踐價值。

圖1 穩(wěn)態(tài)途徑和非穩(wěn)態(tài)途徑調(diào)控采食的主要神經(jīng)環(huán)路Fig.1 The main neural circuits of feeding controlled by homeostatic and non-homeostatic pathways ways

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

試驗動物為：3周齡的雄性C57BL/6小鼠，購自廣東省動物實驗中心，許可證號：SCXK（粵）2018-0002，動物實驗倫理批號：2021F072。試驗小鼠可自由飲食飲水，光照時間12 h，溫度（24±2）℃，濕度（55±10）%。

主要試劑：c-Fos 抗體（貨號2250，美國Cell Signaling Technology 公司），山羊抗兔熒光二抗（紅色cy3熒光，貨號111-035-003，美國Jackson Immuno Research 公司）。儀器：共聚焦顯微鏡（Eclipse Ti-S 日本Nikon Instruments），平推切片機（HM 450，英國賽默飛公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 動物造模 小鼠適應性喂養(yǎng)4周后，根據(jù)體質(zhì)量將小鼠隨機分為2組：持續(xù)禁食組和恢復采食組，每組4只。每次從2個組中選取體質(zhì)量相近的2只小鼠進行造模。2只鼠同時持續(xù)禁食處理36 h，持續(xù)禁食組繼續(xù)持續(xù)禁食2 h，恢復采食組則喂食2 h。先后使用生理鹽水和4%多聚甲醛灌流小鼠，收取小鼠的腦組織固定在4%多聚甲醛中備用。以上配對試驗重復4次。

1.2.2 c-Fos 免疫熒光染色 將小鼠腦組織在多聚甲醛中固定24 h，經(jīng)30%的蔗糖溶液脫水24 h 后，放置平推切片機從前囟-8.24 mm 到前囟2.34 mm 連續(xù)切片，厚度為30 μm[14]，放置于0.1%的疊氮化鈉溶液中。腦片在0.1%的PBST 溶液中漂洗3 次（10 min/次）放入3%的羊血清溶液中室溫封閉1 h。轉(zhuǎn)移至含有c-Fos抗體（1∶2 000）的0.3% PBST溶液中，4 ℃孵育過夜。第2天用0.1%的PBST溶液中漂洗3次。在含有山羊抗兔熒光二抗（1∶400）的0.3% PBST 溶液中室溫避光孵育2 h。之后用0.1% PBST 避光漂洗后裱片、風干、封片。

1.2.3 核團定位與圖像采集 所有組織學圖像均采用共聚焦顯微鏡獲取圖像。參照小鼠腦立體定位圖譜[15]，依據(jù)核團周圍的腦室形狀、穹窿位置、乳頭丘腦束位置、核團本身的形狀和神經(jīng)元表達的輪廓確定各個核團的位置。盡量使兩組同一核團的切片在同一切面，保證數(shù)據(jù)的可比性。每只小鼠單個核團選取3 張代表性腦片進行c-Fos 免疫熒光。使用Image J 軟件對c-Fos 陽性神經(jīng)元進行計數(shù)，取3 張腦片平均數(shù)為該小鼠單個核團表達c-Fos神經(jīng)元數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用GraphPad Prism 7.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準誤（xˉ±s）表示,數(shù)據(jù)的比較采用配對樣本t檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 持續(xù)禁食和恢復采食狀態(tài)下c-Fos神經(jīng)元在腦中的分布

試驗過程如圖2所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)c-Fos陽性神經(jīng)元在小鼠全腦有廣泛的分布。其中，在ARC，水管周灰質(zhì)（periaqueductal gray，PAG），未定帶（zona incerta，ZI），前背視前核（anterodorsal preoptic nucleus，ADP），DMH，背腱膜（dorsal tenia tecta，DTT）等前腦和中腦多個核團中分布密集。

圖2 試驗流程Fig.2 Experimental flow chart

2.2 持續(xù)禁食與恢復采食小鼠前腦中c-Fos的表達

前腦范圍內(nèi)，與持續(xù)禁食組相比，恢復采食組的ARC，ZI、ADP、前緣皮層（prelimbic cortex，PrL）、外側(cè)隔核（lateral septal nucleus，LS）、外側(cè)韁核（lateral habenular nucleus，LHb）、DMH、下丘腦后區(qū)（posterior hypothalamic area，PH）、側(cè)視前區(qū)（lateral preoptic area，LPO）核團的c-Fos 陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少（P＜0.05）；在PVN、SO、VMH 恢復采食組的c-Fos 陽性神經(jīng)元數(shù)量多于持續(xù)禁食組（P＜0.05）；MeA、DTT、M2、MPO、LA核團中，恢復采食組的c-Fos陽性神經(jīng)元數(shù)量相比持續(xù)禁食組有減少趨勢，但是沒有達到傳統(tǒng)統(tǒng)計學的顯著水平（0.05＜P＜0.1）。PV核團在恢復采食組的c-Fos神經(jīng)元的表達數(shù)量增多趨勢，但是沒有達到傳統(tǒng)統(tǒng)計學的顯著水平（0.05＜P＜0.1）（圖3，表1）。

圖3 持續(xù)禁食與恢復采食對小鼠前腦區(qū)域核團變化的影響Fig.3 Effects of fasting and refeed on nuclear mass changes in forebrain regions of mice

表1 持續(xù)禁食與恢復采食對小鼠前腦核團c-Fos神經(jīng)元數(shù)量變化的影響Tab.1 Effects of fasting and refeed on the number of c-Fos neurons in the forebrain nucleus of mice

2.3 持續(xù)禁食與恢復采食小鼠中腦和后腦內(nèi)c-Fos的表達

在中腦范圍內(nèi)，持續(xù)禁食組的小鼠的PAG核團中的c-Fos陽性神經(jīng)元數(shù)量顯著多于恢復采食組（P＜0.05）。在后腦范圍內(nèi)，在恢復采食組小鼠的Sol核團中的c-Fos神經(jīng)元數(shù)量顯著多于持續(xù)禁食組（P＜0.05）；AP核團c-Fos 表達在恢復采食組的數(shù)量比持續(xù)禁食組有增多趨勢，MnR 核團的c-Fos 神經(jīng)元數(shù)量在持續(xù)禁食組有增多趨勢，但是兩者都沒有達到統(tǒng)計學顯著水平（圖4，表2）。

圖4 持續(xù)禁食與恢復采食對小鼠中腦和后腦區(qū)域核團變化的影響Fig.4 Effects of fasting and refeed on nuclear mass changes in midbrain and hindbrain regions of mice

表2 持續(xù)禁食與恢復采食對小鼠中腦核團和后腦核團c-Fos神經(jīng)元數(shù)量變化的影響Tab.2 Effects of fasting and refeed on the number of c-Fos neurons in midbrain nucleus and hindbrain nucleus of mice

3 結(jié)論與討論

提高采食量是充分發(fā)揮畜禽生產(chǎn)潛力的最有效途徑之一。動物的采食量受中樞復雜的神經(jīng)網(wǎng)絡調(diào)控。本研究為探究中樞食欲調(diào)控的潛在區(qū)域，以持續(xù)禁食/恢復采食小鼠為模型，通過c-Fos免疫熒光檢測神經(jīng)元興奮性的變化。研究結(jié)果系統(tǒng)揭示了不同能量狀態(tài)下中樞核團興奮性的變化規(guī)律，為進一步闡明動物食欲的中樞整合機制提供理論基礎。

研究發(fā)現(xiàn)，動物的食欲受多個因素影響，機體的能量水平、腸道飽感、環(huán)境因素、應激刺激等信號經(jīng)中樞整合，最終引起動物采食量改變[16]。目前普遍認為下丘腦作為食欲調(diào)控中樞，在動物食欲調(diào)控中發(fā)揮關鍵作用。特別是下丘腦ARC 因其血腦屏障薄弱[17-18]，富含大量促采食的AgRP 神經(jīng)元，這些神經(jīng)元作為“一級神經(jīng)元”能夠直接感應外周能量水平（營養(yǎng)物質(zhì)、激素水平等）的改變[19]。饑餓禁食可顯著提高ARC 中AgRP 神經(jīng)元興奮性并刺激神經(jīng)末梢促食欲神經(jīng)肽的釋放，而下丘腦PVN、DMH 和VMH 作為AgRP 神經(jīng)元下游投射靶點，AgRP 神經(jīng)元釋放的神經(jīng)肽可有效抑制PVH 和VMH 神經(jīng)元興奮性，提高DMH 神經(jīng)元興奮性，增強動物食欲[20-22]。腸道作為動物食物儲存和消化吸收的重要場所，存在大量的食欲調(diào)控信號，這些信號通過腸道迷走傳入神經(jīng)投射至腦干Sol和AP 區(qū)域[23]，恢復采食后腸道各種機械或化學信號經(jīng)迷走神經(jīng)顯著激活Sol和AP神經(jīng)元，引起動物飽感[24]。

前腦邊緣皮層（PrL）位于內(nèi)側(cè)前額葉皮層（medial prefrontal cortex，mPFC），對應激有抑制作用[25]。光遺傳激活PrL 神經(jīng)元可抑制動物應激行為[26]，糖皮質(zhì)激素可負反饋調(diào)控來減弱或終止應激反應[25]。隔核是連接高級認知中樞和低級執(zhí)行系統(tǒng)的中間環(huán)路。外側(cè)隔核（LS）是隔核的重要組成部分。有研究表明，來自ARC 的胃饑餓素神經(jīng)元可投射至LS 核團[27]，并且通過促食欲的胃饑餓素提高LS 神經(jīng)元興奮。而光遺傳抑制LS 到下丘腦LH 的投射環(huán)路會抑制采食[28]，結(jié)合本研究發(fā)現(xiàn)饑餓可顯著提高LS 神經(jīng)元興奮性，提示LS 可能在提高動物食欲方面發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)饑餓禁食狀態(tài)下PrL 和LS 核團神經(jīng)元同樣被激活，提示PrL和LS核團除參與緩解動物應激外還可能調(diào)控動物食欲。相反，PVH作為應激調(diào)控中樞，急性應激可顯著激活PVH，但饑餓則有效抑制其興奮性，說明應激與動物食欲間存在密切聯(lián)系，饑餓禁食狀態(tài)下動物應激反應明顯減弱。

背腱膜（DTT）被認為是治療身心障礙的潛在靶點[29]，在采食方面的作用尚不明確。從結(jié)果可以看出，DTT在持續(xù)禁食的狀態(tài)下，表達的c-Fos神經(jīng)元數(shù)量比恢復采食的神經(jīng)元數(shù)量多，提示DTT可能是調(diào)控食欲的潛在核團。

外側(cè)韁核（LHb）被認為參與動物眾恐懼、緊張、焦慮等眾多負面情緒調(diào)控，進而抑制動物愉悅采食[30]。外側(cè)視前區(qū)（LPO）作為下丘腦的一部分，大鼠體內(nèi)注射芬弗拉明（5-羥色胺類藥物），LPO 的中NPY 表達量和采食量均顯著降低[31]。本研究則發(fā)現(xiàn)在饑餓禁食狀態(tài)下小鼠LHb 和LPO 興奮性均顯著提高，提示LHb 和LPO 不僅介導食欲的非能量穩(wěn)態(tài)調(diào)控，而且參與動物食欲的能量穩(wěn)態(tài)調(diào)控[32]。進一步揭示食欲的能量穩(wěn)態(tài)和非能量穩(wěn)態(tài)調(diào)控并不是完全獨立的，存在相互調(diào)控的關系。

丘腦室旁核（PV）能夠調(diào)控進食行為。PV 損傷會導致采食量和體質(zhì)量的增加[33]。藥物激活PV 中胰高血糖素樣肽-1 受體（glucagon-like peptide-1 recepter，GLP1R）減少動物采食行為[34]。光遺傳激活ZI 投射到PV 的γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric，GABA）能神經(jīng)元可以增加采食量[35]。這些研究結(jié)果表明PV 神經(jīng)元參與飽感信號調(diào)控[36]。本研究也同樣發(fā)現(xiàn)，在飽食狀態(tài)下，PV核團神經(jīng)元興奮性升高。

內(nèi)側(cè)杏仁核（MeA）是杏仁核皮質(zhì)內(nèi)側(cè)群的一部分。一般認為內(nèi)側(cè)杏仁核參與應激相關的調(diào)控[37]，進而影響采食和體質(zhì)量。貓、狗和猴的MeA 損傷會破壞正常進食，引起暴飲暴食及體質(zhì)量增加[38]。光遺傳特異性激活投射到MeA 中弓狀核來源的POMC 神經(jīng)元會減少短期內(nèi)的采食量[39]。但是也有研究說明MeA損壞后采食量會降低[40]，而且使體質(zhì)量減少[41]。筆者推測MeA核團中有不同功能的調(diào)控采食的神經(jīng)元，該核團對于采食的調(diào)控還需進一步探索。本研究發(fā)現(xiàn)饑餓禁食狀態(tài)下的MeA 的興奮性有增強的趨勢，提示MeA的神經(jīng)元可能是以促采食神經(jīng)元為主。

中腦水管周灰質(zhì)（PAG）與動物獵食行為相關[42-44]，因此饑餓可誘導PAG 神經(jīng)元興奮，進而刺激動物產(chǎn)生攝食行為。位于丘腦下核團未定帶（ZI）主要由抑制性γ-氨基丁酸（GABA）能神經(jīng)元構(gòu)成。研究發(fā)現(xiàn)，ZI 通過GABA 神經(jīng)元投射抑制PAG 活性，進而削弱動物捕食行為[45]，光遺傳等激活ZI 神經(jīng)元則顯著降低動物采食[46]。而本研究發(fā)現(xiàn)饑餓禁食可顯著激活ZI 神經(jīng)元活性，而出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是ZI 核團參與廣泛的生理調(diào)控過程，比如參與調(diào)控內(nèi)臟活動、意識、注意力和運動等，因此在饑餓禁食狀態(tài)下出現(xiàn)ZI核團活性升高現(xiàn)象。

綜上所述，本研究通過系統(tǒng)對比持續(xù)禁食與恢復采食情況下小鼠中樞不同核團興奮性變化，發(fā)現(xiàn)除經(jīng)典的食欲調(diào)控關鍵核團神經(jīng)元興奮性發(fā)生顯著變化外，還存在多個核團有明顯的c-Fos表達差異包括分泌催產(chǎn)素和抗利尿激素的視上核（SO ）[47]，與抗應激相關的前緣皮層核（PrL），以及可以抑制棕色脂肪產(chǎn)生的下丘腦后區(qū)核團（PH）[48]等。本研究發(fā)現(xiàn)SO、PrL和PH 等核團可能在食欲調(diào)節(jié)中同樣發(fā)揮重要作用，該研究結(jié)果進一步豐富和完善了動物采食中樞的調(diào)控機制，也為研發(fā)高效、安全的新型誘食劑提供新的靶點。