許高鼎，張丹楓，熊建華，杜 娟

（江西農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，江西 南昌 330045）

【研究意義】氧氟沙星（ofloxacin，OFL）是第三代喹諾酮類抗生素，因其具有良好的抗菌效果和廣譜抗菌活性，同時交叉耐藥性低、價格低廉，曾被廣泛應用到治療人類、畜禽及水產(chǎn)動物的多種感染性疾病中。但其可降解性差，長期使用會在環(huán)境和食物中富集，并會導致過敏反應和胃腸道疾病，嚴重的會損壞肝臟器官及中樞神經(jīng)系統(tǒng)[1-2]。2015年9月，農(nóng)業(yè)部發(fā)布第2292號公告，宣布自2016年12月31日起禁止使用OFL 用于食品動物[3]，但是OFL 在食品動物中被檢出的情況仍有發(fā)生，亟需開發(fā)簡單、快速、靈敏的檢測方法?！厩叭搜芯窟M展】氧氟沙星（OFL）的檢測方法有高效液相色譜法（HPLC）[4]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS）[5]、酶聯(lián)免疫法（ELISA）[6]和電化學法（ES）[7]。其中HPLC 和LC-MS不僅靈敏度和精密度較高，而且可以同時測定多種目標待測物，是目前檢測OFL 最為常見的方法之一，但HPLC 和LC-MS 需要相對復雜的預處理，耗時長且依賴于昂貴的大型儀器，檢測不便。ELISA 法需要制備抗體，成本較高；ES法需合成電極材料，步驟較為繁瑣。因此，開發(fā)一種簡單、快速、靈敏的檢測方法是必要的。核酸適配體（aptamer，Apt）結合金納米粒子（gold nanoparticles，AuNPs）在快速檢測領域的應用是目前研究的熱點[8-10]。AuNPs是目前研究和使用最多的金屬納米材料，當AuNPs在溶液中處于分散狀態(tài)或聚集狀態(tài)時，溶液分別呈現(xiàn)出酒紅色或藍灰色，并且具有獨特的光學特性[11-12]。Apt被稱為化學抗體，是通過體外指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）篩選制備的單鏈DNA 或RNA[13]。其具有類似抗體的特異性識別功能，且毒性低、穩(wěn)定性好、純度高、存儲條件溫和[14]，同時可以通過鍵能吸附于AuNPs 表面，因此，正逐步替代抗體應用于檢測領域中。相比于傳統(tǒng)的檢測方法，通過Apt結合AuNPs 建立的檢測傳感體系不僅操作簡單，耗時短，不需依賴大型儀器，且具有較好的靈敏度，有望成為快速檢測領域的新趨勢?！颈狙芯壳腥朦c】經(jīng)檸檬酸鈉制備的AuNPs遇到帶正電荷的陽離子表面活性劑時，AuNPs 表面靜電平衡狀態(tài)被破化，導致AuNPs 聚集，然而加入Apt 后，可以有效阻止AuNPs的聚集。但反應體系存在靶標時，Apt因其具有類似抗體的特異性識別功能[15]，會優(yōu)先與靶標特異性結合，導致AuNPs 重新聚集?！緮M解決的關鍵問題】鑒于此，本研究利用AuNPs 在陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨（cationic surfactant hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）作用下的顏色變化，結合Apt對OFL的特異性識別功能，建立OFL檢測的比色分析方法，通過優(yōu)化相應條件，提高反應體系的檢測靈敏度。相比于普通的金屬離子聚集AuNPs 的體系，CTAB 不僅可以破壞AuNPs 表面的靜電平衡，而且可以與Apt 形成超分子結構[16-17]，通過Apt、CTAB 和OFL 之間的競爭關系，更有利于提高反應靈敏度。

1 材料與方法

1.1 實驗原理

核酸適配體結合膠體金可視化檢測氧氟沙星的原理如圖1所示，當Apt溶液中存在OFL 靶標時，Apt會與OFL 靶標特異性結合形成剛性結構[18]，再加入AuNPs 后，Apt 將無法通過其N 元素與Au 元素形成Au-N鍵吸附于AuNPs表面[19]。CTAB是一種陽離子表面活性劑，可以與帶負電荷的Apt結合成超分子結構[16-17]。同時CTAB 帶正電荷，可以破壞表面帶負電荷AuNPs 之間的靜電平衡[20]。因此加入CTAB 后，由于AuNPs表面無Apt吸附，從而發(fā)生聚集現(xiàn)象，AuNPs溶液呈藍灰色。當無OFL靶標時，結合于AuNPs表面的Apt會與CTAB 靜電結合，從而阻止了AuNPs 表面的靜電平衡被破壞，AuNPs 溶液呈酒紅色。因此，OFL的濃度變化可以影響到納米金的聚集程度，根據(jù)這一變化規(guī)律可以實現(xiàn)對OFL的檢測。

圖1 基于核酸適配體結合納米金比色法檢測氧氟沙星實驗原理Fig.1 Schematic diagram of the Apt-AuNPs colorimetric assay for the detection of ofloxacin

1.2 材料和試劑

氧氟沙星（OFL）、恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、鹽酸沙拉沙星（sarafloxacin hydrochloride，SFX）、諾氟沙星（norfloxacin，NOR）、培氟沙星（pefloxacin，PFL）、洛美沙星（lomefloxacin，LOM）和氯霉素（chloramphenicol，CAP）（標準品，金克隆生物技術有限公司）；四水合氯金酸（1 g，國藥集團化學試劑有限公司）；二水合檸檬酸鈉、乙酸（西隴化學試劑有限公司）；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）（天津市光復精細化工研究所）；3-（N-嗎啡啉）丙磺酸鈉（MOPS-Na）（上海生工生物技術有限公司）；甲醇（色譜級，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰荆?。氧氟沙星核酸適配體（Apt）由上海生工生物技術有限公司合成序列為5′-ATA CCA GCT TAT TCA ATT AGT TGT GTA TTG AGG TTT GAT CTA GGC ATA GTC AAC AGA GCA CGA TCG ATC TGG CTT GTT CTA CAA TCG TAA TCA GTT AG-3′[21]。適配體使用時5 000 r/min離心1 min，然后用超純水溶解，稀釋成100 nmol/L的適配體儲備液，4 ℃保存。

1.3 儀器

Specord 200紫外-可見分光光度計（德國耶拿分析儀器股份公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁性攪拌器（上海鷹迪儀器設備有限公司）；HC-2518R 臺式高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；KB3旋渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；FEI Tecnai F20透射電子顯微鏡（美國FEI公司）；Zeta Nano ZS納米粒度儀（英國Malvern公司）。

1.4 AuNPs的制備

根據(jù)Du 等[22]報道合成AuNPs。所有玻璃器皿及攪拌子用王水浸泡30 min，然后直接用超純水清洗干凈，置于烘箱烘干后待用。用移液管準確量取超純水80 mL，然后加入2 mL 1%的氯金酸，放于磁力攪拌器上加熱攪拌至沸騰狀態(tài)，然后迅速加入8 mL 1%的檸檬酸鈉溶液，將混合物繼續(xù)加熱攪拌，溶液先由淡黃色變?yōu)榈仙?，然后由淡紫色變成酒紅色。15 min后停止加熱，放于室溫下繼續(xù)攪拌30 min使溶液形成穩(wěn)定的AuNPs，然后用超純水定容至100 mL，保存于4 °C。

1.5 檢測條件

在離心管中分別加入30 μL Apt 溶液（終濃度為1.5 nmol/L）和100 μL 不同濃度的OFL 標準溶液，然后加入1 180 μL MOPS-Na（10 mmol/L pH 7.0）緩沖液，混勻后于37 ℃孵育30 min，然后加入500 μL AuNPs，混勻后于37 ℃繼續(xù)孵育30 min，最后加入190 μL 10 μmol/L CTAB，反應體系最終體積為2 mL，反應15 min 后用全波段紫外分光光度計掃描400～800 nm 波長下的光譜圖。以不加入OFL 目標物為對照體系，計算ΔA650/A520的值。

1.6 檢測條件優(yōu)化

1.6.1 CTAB 濃度優(yōu)化 分別將體積為0，40，80，100，120，140，160，180，190，200，220，240，260 μL 的10 μmol/L CTAB 溶液添加到含有500 μL AuNPs 的體系中，其中含有適量體積的MOPS-Na 緩沖液，使反應體系的最終體積為2 mL，體系中CTAB 溶液的最終濃度分別為0，0.2，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，0.95，1.0，1.1，1.2，1.3 μmol/L。充分震蕩混勻后，于37℃孵育15 min 后，用紫外-可見分光光度計掃描400～800 nm 的吸收光譜，測量溶液的650 nm 和520 nm 處的吸光值，得到的吸光度比值A650/A520的平均值為縱坐標、CTAB 濃度為橫坐標作圖，選擇使AuNPs顆粒完全聚集即達到最大的A650/A520值對應的濃度作為最佳的CTAB濃度。

1.6.2 Apt濃度優(yōu)化 為保證反應體系的靈敏度，試驗采用差值法優(yōu)化Apt濃度。首先設置存在30 ng/mL的OFL 的試驗組A1和不存在OFL 的空白組A，然后將終濃度為1.0，1.5，2.0、2.5，3.0、3.5，4.0、4.5，5.0 nmol/L 的Apt溶液和適量的MOPS-Na 緩沖液分別與試驗組和空白組在37℃孵育30 min，接著向每個溶液中加入500 μL AuNPs溶液再進行30 min的反應，最后加入此前最佳濃度的CTAB溶液。在15 min的相互作用后，測定吸光度獲得A1和A，并計算得到ΔA=A1-A，以吸光度比值的差值ΔA 的平均值為縱坐標，Apt濃度為橫坐標作圖，選擇最大ΔA值處的濃度作為最優(yōu)的Apt濃度。

1.7 標準曲線的建立及反應的特異性分析

根據(jù)上述優(yōu)化的試驗條件，通過改變靶標OFL 的濃度建立標準工作曲線。固定加入100 μL 不同濃度的OFL，使最終濃度為0，5，12.5，25，50，75，150，200 ng/mL，然后加入最優(yōu)濃度的Apt 和1 180 μL MOPS-Na（10 mmol/L pH 7.0）緩沖液、混勻后于37 ℃孵育30 min，接著加入500 μL 的AuNPs 渦旋混勻后于37 ℃孵育30 min，最后加最佳體積的10 μmol/L CTAB 混勻在37 ℃孵育15 min 后掃描400～800 nm 波長的吸收光譜。測量520 nm 和650 nm 的吸光值，以OFL 濃度為橫坐標，A650/A520為縱坐標。通過加入OFL與空白對照的吸光度比值的差值ΔA得到標準工作曲線圖。

對于反應體系的特異性考察，根據(jù)上述優(yōu)化好的條件，在優(yōu)化的檢測系統(tǒng)中選擇多種不同的干擾物代替OFL，包括ENR、LOM、NOR、PFL、CIP、SFX 和CAP，以及包括OFL 在內(nèi)的8 種抗生素的混合物，所有抗生素的濃度均為30 ng/mL，并用紫外分光光度計分別測定A650/A520，并以不加測定物為空白對照組，并計算各干擾物與空白組的差值ΔA。以ΔA為縱坐標，各類干擾物的名稱為橫坐標作坐標圖，判斷該反應體系的特異性。

2 結果與分析

2.1 反應的發(fā)生

為了驗證方法的可行性，試驗中測定了加入了CTAB 及適配體前后AuNPs 的吸收光譜。如圖2a 所示，AuNPs 在波長520 nm 處有明顯的特征吸收峰；當加入陽離子表面活性劑CTAB 時，AuNPs表面的檸檬酸根離子電荷平衡被破壞，此時AuNPs 溶液發(fā)生聚集，可以觀測到其520 nm 處的吸收峰下降，650 nm 附近的吸收峰上升（圖2d）；在AuNP 溶液中加入Apt 時，Apt 會吸附在AuNPs 表面，阻止了AuNPs 溶液的聚集（圖2b），同時從圖中可以看到，吸收峰變寬，最大吸收波長略有紅移，這是因為Apt不是處于完全飽和狀態(tài)，仍有部分AuNPs 發(fā)生了聚集現(xiàn)象[23]。然而，當反應體系中存在OFL 時，AuNPs 溶液又重新出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，520 nm 處的吸光度強度降低，而650 nm處出現(xiàn)的新峰強度增加（圖2c）。圖3顯示了不同聚集狀態(tài)下AuNPs的透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）圖。單獨的AuNPs 分散均勻，顆粒規(guī)則（圖3a）；加入CTAB 后，AuNPs 完全聚集（圖3b）；在Apt存在的情況下，AuNPs分散良好，僅有極少部分聚集（圖3c）；最后加入OFL后，AuNPs又發(fā)生聚集（圖3d）。這一現(xiàn)象結果也與紫外-可見分光光譜一致。Zeta 電位可以用于確認溶液中AuNPs 與Apt 的結合狀態(tài)。如圖4 所示，合成的AuNPs 溶液由于表面帶有檸檬酸根，zeta電位呈負值[24]，為（-31.70±1.06）mV，與Apt孵育30 min后，zeta電位變?yōu)椋?36.20±1.07）mV，絕對值增大，表明Apt與AuNPs發(fā)生了結合[25-26]。

圖2 不同狀態(tài)下AuNPs的紫外-可見吸收光譜Fig.2 UV-Vis absorption spectra of AuNPs under different conditions

圖3 不同狀態(tài)下AuNPs的透射電子顯微鏡表征Fig.3 The characterization by transmission electron microscope of AuNPs under different conditions

圖4 不同狀態(tài)下AuNPs的zeta電位Fig.4 The zeta potentials of AuNPs under different conditions

2.2 檢測條件優(yōu)化

CTAB 作為AuNPs 聚集的誘導劑，CTAB 的濃度對AuNPs 的聚集效果有重要影響。CTAB 的濃度太低，AuNPs無法完全聚集，故CTAB 的濃度優(yōu)化是必要的[17]。如圖5所示，隨著CTAB 濃度的增大，A650/A520比值逐漸增大，當CTAB 濃度達到0.95 μmol/L 時，A650/A520比值達到最大值，隨著繼續(xù)增大CTAB 濃度，A650/A520比值仍保持在最大值，這一過程說明當CTAB 濃度達到0.95 μmol/L 時，AuNPs的聚集達到飽和狀態(tài)，因此在后續(xù)的試驗中選擇0.95 μmol/L作為CTAB的使用濃度。

圖5 CTAB濃度對反應體系的影響Fig.5 Effect of CTAB concentration on the reactive system

Apt 的濃度同樣影響著AuNPs 的聚集效果。當Apt 濃度過高時，部分Apt 與OFL 優(yōu)先結合后，多余的Apt會繼續(xù)吸附到AuNPs表面，AuNPs都會被Apt保護從而無法聚集；當Apt濃度過低時，AuNPs 表面無法被Apt吸附完全，無論OFL 存在與否，在CTAB 的存在下都會使AuNPs 聚集，這一現(xiàn)象容易導致試驗結果假陽性[27]，故Apt 的濃度優(yōu)化尤為重要。試驗結果如圖6 所示，隨著Apt 濃度的增大，無OFL 的空白組A 與存在OFL 的試驗組A1都呈下降趨勢，表明Apt 起到了阻止AuNPs 聚集的作用，A1相對大于A，這是因為Apt 優(yōu)先與OFL 結合，剩余的Apt 起到了一定的保護作用。與A1相比，A的降低趨勢較緩，表明Apt濃度處于阻止CTAB聚集AuNPs 的飽和狀態(tài)。當Apt濃度為1.5 nmol/L 時，A1與A 的差值達到最大，因此Apt最優(yōu)使用濃度為1.5 nmol/L。

圖6 Apt濃度對反應體系的影響Fig.6 Effect of Apt concentration on the reactive system

2.3 線性范圍與檢出限測定

為了研究該體系檢測OFL 的可行性，在最佳試驗條件下，測定了不同濃度OFL 下檢測體系的吸光度的變化。隨著OFL 濃度的升高，在650 nm 處的吸光強度逐漸升高（圖7a），A650/A520隨著OFL 濃度的增加而增加，在5～75 ng/mL OFL 內(nèi)，ΔA650/A520與OFL 濃度呈良好的線性關系，線性回歸方程為Y＝0.012 5X+0.036 2（R2=0.988 3）（圖7b）。通過計算得到該方法的檢出限（LOD）為0.295 ng/mL，如表1 所示，與其他檢測方法相比，該方法不需要使用大型儀器，且操作簡便快速，并具有更高的靈敏度。

表1 不同OFL檢測方法的比較Tab.1 Comparison of different ofloxacin detection methods

圖7 不同濃度OFL對反應體系的影響Fig.7 Effect of the ofloxacinof different concentration on the reactive system

2.4 特異性評價

選擇6 種氟喹諾酮類藥物ENR、LOM、NOR、PFL、CIP 和SFX，以及1 種氯霉素類藥物CAP，在相同條件下反應，研究該體系的特異性。結果如圖8所示，加入OFL的ΔA650/A520值明顯高于其他7種藥物，表明該檢測體系對OFL 的特異性識別強于其他藥物，所有藥物混合后其吸光值與OFL 相比，有了較小的增大。這些結果表明，該比色分析法對OFL 的檢測具有良好的特異性。ENR 的吸光值較高可能是其化學結構特征與OFL相似[31-32]。

圖8 核酸適配體結合膠體金比色法檢測OFL體系的特異性分析Fig.8 Specific analysis of the aptamer combined with AuNPs colorimetric method for the detection of ofloxacin

3 討論與結論

本研究采用氧氟沙星核酸適配體對氧氟沙星的特異性識別功能及陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）聚集金納米粒子產(chǎn)生的光學變化，初步建立了一種快速檢測氧氟沙星的比色分析方法，優(yōu)化了CTAB 和Apt 的濃度，評估了檢測體系的靈敏度和特異性。在CTAB濃度為0.95 μmol/L，Apt 濃度為1.5 nmol/L 的條件下，OFL 濃度在5～75 ng/mL 具有良好的線性關系，最低檢測限為0.295 ng/mL。本方法利用適配體的特異性識別能力，靈敏度較高，基于納米金粒子的聚集特性實現(xiàn)比色檢測，無需使用大型儀器，操作簡便、快速，有望制成快速檢測試劑盒，應用到實際樣品現(xiàn)場檢測中。