杜曉映

(濰坊理工學(xué)院，山東 青州 262500)

荔枝草(Salvia plebeian R.Br.)是唇形科鼠尾草屬草本植物，也稱為青蛙草、蛤蟆草、皺皮草、雪見草等。荔枝草味苦性寒涼，具有諸多功效，如清熱解毒、利尿消炎、止血涼血等[1]。故可用于治療呼吸道炎癥、扁桃體炎、腎炎水腫、便血等疾病，外用可治療某些婦科疾病[2]。荔枝草在我國分布廣泛，主產(chǎn)于我國江蘇、安徽、福建、山東、河南等地，資源豐富，是一種很有前景的藥用植物。

我國民間廣泛運用荔枝草的功效治療疾病，隨著技術(shù)的進步，科研人員從荔枝草的藥理作用出發(fā)不斷探究其中的化學(xué)成分。研究表明，荔枝草中主要含有黃酮類、萜類、酚酸類、揮發(fā)油、植物甾醇類等多種化合物[3,4]，其中，黃酮類化合物具有抗氧化、預(yù)防心血管疾病、抗老化等功效，是眾多中藥的有效成分[5]。高車前苷是荔枝草中富含的一種主要的黃酮類化合物，藥理研究表明，高車前苷具有止咳平喘、抑菌、祛痰及保肝、抗組胺等作用[6]。齊墩果酸是萜類化合物的一種，也是荔枝草功能性成分之一，具有保肝、解毒功能，目前齊墩果酸已經(jīng)成為臨床上治療急性和慢性肝炎的藥物之一[7-9]。除此之外，齊墩果酸還具有降糖，降血脂，抗炎，抗細菌、病毒和原蟲，抗氧化，抗突變，抗心腦血管疾病，促進創(chuàng)傷恢復(fù)，抗腫瘤，增強免疫調(diào)節(jié)等多種功能。本研究通過對水提和醇提2種提取方法下獲得的荔枝草浸膏中總黃酮、高車前苷、齊墩果酸含量的測定與比較，為荔枝草產(chǎn)品的進一步開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料

主要儀器：Agilent 1260型高效液相色譜儀；RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；UV5200紫外可見分光光度計；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋。

實驗樣品購于當?shù)厮幏?，來源于河南，為荔枝草干草全株?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 荔枝草浸膏的提取

荔枝草的干燥全草，除去黃葉、雜質(zhì)，研碎成粗粉，以水或70%乙醇為溶劑，通過浸泡、加熱回流、抽濾、50℃減壓蒸餾得到浸膏。以浸膏得率為標準，優(yōu)選實驗方案，其中，水提法浸泡時間1h，回流時間1h，料液比1∶15；醇提法乙醇濃度70%，料液比1∶20，回流時間2h。

2.2 浸膏中總黃酮含量的測定

將醇提浸膏和水提浸膏干燥后各取1g，置于100mL小燒杯中，加70%乙醇進行溶解，過濾后轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中定容，混勻后得黃酮提取液，待用。

2.2.1 蘆丁標準曲線的繪制

電子天平精確稱取蘆丁標準品5mg，用70%乙醇溶解至小燒杯中，于25mL容量瓶中定容，搖勻，得到標準品溶液濃度為0.2mg·mL-1。移液槍準確吸取標準溶液0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL，分別置于7個已編號的10mL容量瓶中。先分別向上述7個容量瓶內(nèi)加入5% NaNO20.4mL，搖勻，避光靜置6min；后加入10%A1(NO3)30.4mL，搖勻，避光放置6min；最后加入5%NaOH 4.0mL，再加水定容，搖勻，避光放置15min。將上述溶液加到玻璃比色皿的2/3處，用70%乙醇作參比溶液，在510nm波長下依次測定吸光值后，根據(jù)數(shù)據(jù)繪制標準曲線并求出標準曲線方程和擬合參數(shù)[10]。

準確吸取上述提取液A、B、C各1.00mL于10mL容量瓶中，并按上述步驟依次加入5%NaNO2、10%A1(NO3)3、5%NaOH，再以70%乙醇作參比溶液，用比色皿在510nm波長處測定吸光度，用繪制出的標準曲線即可計算出總黃酮含量。

以不同濃度的標準品為橫坐標，以紫外分光光度計搭配玻璃比色皿測定溶液在510nm處的吸光度值，測量多次后取平均值為縱坐標，進行作圖，得到圖1所示蘆丁標準曲線。

圖1 蘆丁標準曲線

以最小二乘法做線性回歸，得方程為y=11.075x-0.0275，R2=0.9841，其中，y為吸光度值(A)；x為標準品濃度(mg·mL-1)；R2為擬合參數(shù)，0

2.2.2 樣品中總黃酮的測定結(jié)果

按照標準曲線的方法測定水提法和醇提法的提取物中總黃酮含量，水提法中提取物總黃酮含量為15.6mg·g-1，醇提法中提取物總黃酮含量為16.3mg·g-1，醇提法要高于水提法。在此基礎(chǔ)上，若加大乙醇回流時間至3h，醇提浸膏中黃酮得率可達到2.73%，換算成荔枝草干草中黃酮含量為1.5mg·g-1。

2.3 浸膏中齊墩果酸含量的測定

浸膏干燥后稱取5g溶解于20mL去離子水中，溶解液倒入分液漏斗中，加入適量水飽和的正丁醇在通風(fēng)櫥中分3次進行萃取，收集萃取液，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去正丁醇至無醇味為止，將圓底燒瓶內(nèi)蒸發(fā)剩余物用甲醇溶解，并定容于50mL容量瓶中[11-14]。用紫外分光光度計進行測定其吸光度，測3次取平均值(若數(shù)值偏大，稀釋后再測定，使數(shù)值處于線性范圍內(nèi))。

2.3.1 齊墩果酸標準曲線繪制

準確稱量齊墩果酸標準品(CAS：508-02-1；分子式：C30H48O3)10.0mg，用甲醇進行充分溶解，再定容至50mL，搖勻后即得標準品溶液，其濃度為0.2mg·mL-1[15]。用移液槍精密吸取標準品溶液0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、3mL、4mL、5mL、7mL，再用甲醇定容于10mL容量瓶中，即得0.01mg·mL-1、0.02mg·mL-1、0.03mg·mL-1、0.04mg·mL-1、0.06mg·mL-1、0.08mg·mL-1、0.10mg·mL-1、0.14mg·mL-1的標準品溶液。用紫外分光光度計在258nm波長下測定其分光光度值，繪制齊墩果酸在258nm下的標準曲線及回歸線方程[15,16]。

采用紫外分光光度法測定齊墩果酸標準品配制的密度梯度溶液，測得標準曲線方程為y=0.0047x-0.0258，R2=0.9946。結(jié)果表明，齊墩果酸在10～140mg·g-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

圖2 紫外分光光度法測齊墩果酸標準曲線

2.3.2 樣品中齊墩果酸的測定結(jié)果

按照標準曲線的方法測定水提法和醇提法的提取物中齊墩果酸含量。其中，醇提法測得齊墩果酸含量為0.187mg·g-1，水提法測得齊墩果酸含量為0.104mg·g-1，醇提法大于水提法。在此基礎(chǔ)上，若提前浸泡1h并加大乙醇回流時間至3h，齊墩果酸含量可達0.245mg·g-1。折合到干草中齊墩果酸含量為0.093mg·g-1。

2.4 浸膏中高車前苷含量的測定

2.4.1 對照品溶液的配制

精密稱取對照品6mg，置于10mL的量瓶中，用流動相(52%甲醇)定容至刻度，得濃度為604mg·L-1的高車前苷儲備液。再吸取上述儲備液2mL加流動相定容至10mL，即得高車前苷標準品溶液。

2.4.2 供試品溶液的配制

不同提取方式荔枝草提取物的制備：將醇提浸膏和水提浸膏干燥后分別稀釋至濃度為0.8g·mL-1，高速離心后上清液通過D101大孔樹脂柱，用10倍柱體積70%的無水乙醇通過大孔樹脂，收集70%無水乙醇部分，回收乙醇后，水浴蒸至近干，減壓干燥，研缽研細，過80目篩即得樣品。

精密稱取荔枝草提取物樣品10mg，加流動相(50%甲醇)，超聲溶解，定容至10mL，搖勻。

2.4.3 色譜條件

ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm),流動相色譜甲醇-0.1%冰醋酸水溶液(v/v，52∶50)，柱溫35℃，流速1mL·min-1，檢測波長335nm[6]。按上述色譜條件對對照品和供試品分別測定，結(jié)果塔板數(shù)>5000，分離度R>1.5，對照品溶液及供試品溶液的色譜圖見圖3、圖4。

注：濃度604mg·L-1，進樣10μL，波長335nm。

注：進樣10μL，波長335nm。

以進樣量對峰面積進行線性回歸，得回歸方程y=1027.5x-7.1324(R2=0.9995)，結(jié)果表明,高車前苷在0.20～2.01μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。對色譜條件進行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及加樣回收試驗，表現(xiàn)良好。

2.4.4 不同提取方式的樣品中高車前苷的含量測定

取水提法和醇提法樣品各4批，進樣10μL，HPLC測定，用標準曲線法計算，4批樣品中高車前苷含量測定結(jié)果見表1。其中，水提法樣品中高車前苷平均含量為0.498mg·g-1，醇提法樣品中高車前苷平均含量為1.018mg·g-1。

表1 不同提取方式下1g荔枝草提取物樣品中高車前苷的含量測定

3 討論

3.1 浸膏的提取

在藥用植物的開發(fā)利用中，往往需要先將植物的有效成分提取制成浸膏，再加工成產(chǎn)品，在浸膏的提取中，浸膏得率受多種因素的影響，本試驗所用的水提法是以浸泡時間、料液比、回流時間為主要影響因素，醇提法是以乙醇濃度、料液比、回流時間為主要影響因素，分別作三因素三水平正交實驗后，以浸膏得率為測定指標，優(yōu)選的浸膏提取方案。

其中，水提法采用浸泡時間1h，料液比1∶15，回流時間1h。醇提法采用乙醇濃度70%，料液比1∶20，回流時間2h。在2種方法中水提法浸膏得率要略高于醇提法。

3.2 不同提取物3種成分的含量比較

經(jīng)過反復(fù)試驗發(fā)現(xiàn)，70%醇提下總黃酮、齊墩果酸、高車前苷的含量都遠遠高于水提樣品中3種物質(zhì)的含量。

本試驗先以浸膏提取率為標準優(yōu)選了水提法和醇提法中浸膏得率最高的2種方案，再對2種浸膏中總黃酮、齊墩果酸和高車前苷進行了測定與比較，需要注意的是，在浸膏的提取中，浸膏得率最大的方案并不是其有效成分最高的方案。如果加大浸泡時間或回流時間，可以進一步提高其有效成分的含量。該方法標準統(tǒng)一，因此測定結(jié)果相對可靠，對荔枝草富含的其他藥用植物有效成分的進一步測定和荔枝草產(chǎn)品的進一步開發(fā)應(yīng)用都具有一定的指導(dǎo)意義。