方 正

(貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550001)

前言

MicroRNA(miRNAs)是一類主要由內(nèi)源基因編碼的，長(zhǎng)度約為18～25nt的非編碼單鏈小分子RNA[1]。2003年首個(gè)miRNA(lin-4)在秀麗新小桿線蟲(Caenorhabditis elegan)中被證實(shí)通過抑制lin-14蛋白表達(dá)導(dǎo)致線蟲躍過L1期并直接進(jìn)入L2發(fā)育期及發(fā)育后期[2]，從而開啟了miRNA的研究熱潮。隨著學(xué)者對(duì)人類、動(dòng)物、植物等的深入研究,發(fā)現(xiàn)miRNA在腫瘤發(fā)生、生物發(fā)育、抗病毒、宿主免疫、表觀調(diào)節(jié)以及代謝方面有著重要的調(diào)控作用，且已在動(dòng)物、植物和病毒等中發(fā)現(xiàn)大量的miRNA[3]。由于miRNA的尺寸小、占據(jù)相對(duì)較小的基因組空間、甚至可能是非免疫原性的,且特異地調(diào)控靶基因的表達(dá)，因此病毒miRNA(病毒編碼的miRNA)可作為病毒抵御宿主免疫的有力武器[4]。MiRNA主要通過抑制靶基因mRNA翻譯或促進(jìn)mRNA降解，在轉(zhuǎn)錄后水平實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控[3]。

桿狀病毒(Baculovirus)是一類具有桿狀核衣殼的雙鏈DNA病毒，具有嚢膜包裹，其整個(gè)生命周期會(huì)產(chǎn)生出芽型病毒(budded virion，BV)和包涵體衍生型病毒(occlusion-derived virion，ODV)2種形態(tài)的病毒粒子，分別具有不同的生物學(xué)意義[5]。桿狀病毒的宿主范圍包括鱗翅目、膜翅目和雙翅目等昆蟲，是自然環(huán)境中昆蟲種群和數(shù)量的重要調(diào)節(jié)因子[6-10]。因此，其對(duì)農(nóng)業(yè)害蟲防治具有重要的研究應(yīng)用價(jià)值，已被開發(fā)為生物殺蟲劑廣泛應(yīng)用于農(nóng)林害蟲的生物防治。但有關(guān)桿狀病毒編碼的miRNA研究起步較晚，相關(guān)參考資料較少。本文綜述了桿狀病毒miRNA的發(fā)現(xiàn)與鑒定及其生物學(xué)功能，旨在為桿狀病毒miRNA進(jìn)一步研究提供參考。

1 桿狀病毒miRNA的發(fā)現(xiàn)與鑒定

迄今為止，已對(duì)超過200個(gè)桿狀病毒全基因組進(jìn)行測(cè)序并提交到NCBI數(shù)據(jù)庫中。然而，與皰疹病毒編碼的200多個(gè)miRNAs的功能研究相比[4]，桿狀病毒編碼的miRNAs的研究仍處于起步階段。2010年Singh等結(jié)合小RNA測(cè)序、生物信息學(xué)分析、莖環(huán)PCR和Northern blot等手段證實(shí)在家蠶核多角體病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV)感染的家蠶幼蟲體內(nèi)存在4個(gè)BmNPV miRNAs[6]，這也是首次發(fā)現(xiàn)桿狀病毒miRNA。Zhu等于2013年通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、RT-PCR和Norther nblot在苜蓿芽紋夜蛾核多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)中鑒定到一個(gè)AcMNPV miRNA(AcMNPV-miR-1)[7]，隨后其又通過小RNA測(cè)序鑒定到更多的AcMNPV miRNA[8]。Kharbanda等通過小RNA測(cè)序在斜紋夜蛾核多角體病毒(Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus，SpltNPV)感染的Sf21細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有48個(gè)SpltNPV miRNA[9]。Ferrelli通過生物信息學(xué)分析大豆夜蛾核多角體病毒(Anticarsia gemmatalis nucleopolyhedrovirus AgMNPV)中預(yù)測(cè)到與BmNPV-miR-4同源的AgMNPV miRNA序列，并進(jìn)一步利用Northern blot實(shí)驗(yàn)手段在AgMNPV感染的High Five細(xì)胞中得到證實(shí)[10]。

目前，在桿狀病毒miRNA的研究中常用的手段是生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、莖環(huán)PCR、RT-PCR、Northern blot和小RNA測(cè)序等技術(shù)手段。截至2022年11月，文獻(xiàn)報(bào)道僅在BmNPV、AcMNPV、SpltNPV和AgMNPV 4個(gè)桿狀病毒中鑒定到miRNA，隨著分析手段的不斷完善和研究的不斷深入，相信在不久的將來會(huì)有更多的桿狀病毒miRNA被揭示。

2 桿狀病毒miRNA的作用機(jī)制

部分DNA病毒miRNA和真核miRNA一樣通過經(jīng)典途徑合成，由Drosha和Dicer(即Drosha-Dicer方式)加工處理產(chǎn)生成熟體發(fā)揮功能。如乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)HBV-miR-3是通過經(jīng)典的Drosha-Dicer方式合成[11]。但某些病毒miRNA的生物合成不依賴上述經(jīng)典途徑，如鼠γ-皰疹病毒68(Murine gamma-herpesvirus 68，MHV68)pri-miRNA是由位于相鄰病毒轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(transfer ribonucleic acid，tRNA)樣序列內(nèi)的RNA pol III啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生串聯(lián)tRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)，得到的5tRNA部分的pri-miRNA不經(jīng)Drosha處理，而是由宿主tRNase Z切割tRNA結(jié)構(gòu)的下游，釋放pre-miRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)，然后由Dicer處理產(chǎn)生成熟的miRNA[11]。在桿狀病毒中，BmNPV miRNA是由經(jīng)典的真核miRNA生物合成途徑合成的，見圖1[3]，但其它的桿狀病毒miRNA生物合成方式目前尚不清楚。

圖1 BmNPV miRNA生物合成及其對(duì)靶基因的調(diào)控方式[11]

作為1種基因表達(dá)調(diào)控因子，miRNA調(diào)控靶基因表達(dá)的方式主要有2種，通過與靶基因mRNA 3′UTR完全互補(bǔ)結(jié)合，降解其mRNA，從而降低靶基因的表達(dá)，見圖1；miRNA通過不完全結(jié)合靶基因的mRNA 3′UTR，然后抑制靶基因的蛋白翻譯，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的負(fù)調(diào)控[12]。隨著miRNA研究的不斷深入及越來越多miRNA從各種生物中發(fā)現(xiàn)，研究人員發(fā)現(xiàn)，miRNA不僅能通過結(jié)合靶基因mRNA的3′UTR，而且能夠通過結(jié)合靶基因mRNA的5′UTR和CDS區(qū)進(jìn)行基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[13]。此外，1個(gè)miRNA可以調(diào)控多個(gè)靶基因，1個(gè)靶基因也可能受到多個(gè)miRNA的調(diào)控，形成一個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，最終實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的生物學(xué)調(diào)控[1]。

桿狀病毒miRNA的作用方式也是多樣的，如AcMNPV-miR-1通過靶向自身及基因ODV-E25的CDS區(qū)并誘導(dǎo)mRNA的降解，進(jìn)而減少BV的產(chǎn)生并促進(jìn)ODV的形成。同時(shí)，AcMNPV-miR-1還可以靶向調(diào)控自身基因ac18和ac95[14]。BmNPV-miR-3可與BmNPV P6.9 mRNA的3′UTR完全互補(bǔ)，并負(fù)調(diào)控P6.9的表達(dá)，從而促進(jìn)BmNPV的感染[15]。但還沒有桿狀病毒miRNA通過結(jié)合到靶基因的5′UTR來調(diào)控基因表達(dá)，以及多個(gè)病毒miRNA靶向同一靶基因的相關(guān)研究，這可能由于桿狀病毒miRNA研究較少，許多作用機(jī)制還待揭示。

3 桿狀病毒miRNA的生物學(xué)功能

病毒miRNA通過調(diào)節(jié)與病毒感染相關(guān)的多種生物學(xué)過程，包括宿主凋亡、免疫逃避、病毒感染周期等，促進(jìn)病毒在宿主中復(fù)制增殖，使病毒能在宿主細(xì)胞中存活[15,16]。如皰疹病毒(Epstein barr virus，EBV)EBV-miR-BART2可以完全互補(bǔ)靶向自身的DNA聚合酶基因，負(fù)調(diào)控DNA聚合酶蛋白的合成并抑制潛伏感染EBV的激活[16]。在猴病毒40(Simianvirus40，SV40)miRNA在病毒復(fù)制晚期表達(dá)，并靶向降解SV40 T抗原的轉(zhuǎn)錄本，使SV40免受T淋巴細(xì)胞清除[17]。

桿狀病毒miRNA通過調(diào)控自身基因的表達(dá)來逃避宿主免疫或促進(jìn)病毒感染。在昆蟲系統(tǒng)中，酚氧化酶原、絲氨酸蛋白、Hemolin等在先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，Hemolin作為鱗翅目特有的模式識(shí)別蛋白，參與抗病毒活性，如血細(xì)胞聚集、結(jié)節(jié)形成和吞噬[18]。BmNPV miRNAs預(yù)測(cè)靶基因包括家蠶絲氨酸蛋白酶、Hemolin和酚氧化酶原等宿主抗病毒蛋白[6]。因此，可以推斷BmNPV miRNAs通過靶向負(fù)調(diào)控這些宿主先天免疫相關(guān)蛋白的表達(dá)，這可能是桿狀病毒逃逸宿主免疫應(yīng)答的一種有效策略。BmNPV P6.9作為病毒組裝的必需蛋白，但不影響病毒復(fù)基因，BmNPV-miR-3通過與P6.9的3′UTR完全互補(bǔ)的方式抑制P6.9表達(dá)，從而減少感染早期病毒載量，使BmNPV逃避宿主早期免疫[15]。此外，BmNPV-miR-3還能與p40、p95、極晚期因子1(vlf1)、fusolin、chitinase、bp15和lef-8結(jié)合，抑制其表達(dá)，延遲病毒成熟，有利于病毒自身逃避宿主免疫清除[3]。過表達(dá)AcMNPV-miR-1會(huì)降低出芽型病毒粒子BV的感染性，促進(jìn)多角體的感染[14]。

桿狀病毒miRNA通過全局調(diào)控宿主miRNA表達(dá)。Export-5作為Ran GTPase結(jié)合蛋白家族的一員，是miRNAs等小RNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中的關(guān)鍵蛋白，并依賴于Ran GTP，Ran是export-5介導(dǎo)的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的重要組成部分，BmNPV-miR-1通過靶向負(fù)調(diào)控Ran抑制宿主miRNA的合成，在細(xì)胞水平或蟲體水平顯著提高了BmNPV的病毒載量[19]。

4 桿狀病毒miRNA在持續(xù)性感染中的作用

持續(xù)性感染是指能夠形成長(zhǎng)期感染而不被宿主免疫反應(yīng)清除，持續(xù)感染的能力對(duì)于促進(jìn)病毒的傳播至關(guān)重要，且桿狀病毒持續(xù)感染現(xiàn)象普遍[20]。病毒潛伏期是一種持續(xù)性感染形式，感染細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生任何病毒子代，病毒基因轉(zhuǎn)錄但不翻譯成蛋白質(zhì)。研究表明，這些潛伏感染狀態(tài)病毒基因的轉(zhuǎn)錄本通過編碼miRNA調(diào)控基因表達(dá)來建立潛伏感染，如在棉鈴蟲裸病毒(Helicoverpa zea nudivirus，HzNV-1)潛伏感染的草地貪夜蛾、粉紋夜蛾等昆蟲細(xì)胞中，僅轉(zhuǎn)錄一個(gè)與持續(xù)性感染相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(persistence associated gene 1，pag1)，隨后證實(shí)HzNV-1 pag1編碼的多個(gè)miRNAs通過抑制早期基因-hhi1的表達(dá)，建立了潛伏感染，抑制pag1編碼的miRNAs可以將潛伏感染的HzNV-1激活為裂解性感染[21]。幾乎所有的人類皰疹病毒都編碼抑制自身早期基因IE表達(dá)的病毒miRNA，以此調(diào)節(jié)病毒的裂解性感染和潛伏感染[16]。桿狀病毒潛伏感染狀態(tài)下亦轉(zhuǎn)錄部分病毒基因，但不表達(dá)病毒蛋白[22]。在甜菜夜蛾核多角體病毒(Spodoptera exigua multicapsid nucleopolyhedrovirus，SeMNPV)潛伏感染的甜菜夜蛾細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄了至少16個(gè)病毒基因，但未檢測(cè)到病毒蛋白的表達(dá)[23]，這些病毒基因是否以非編碼RNA的形式調(diào)控宿主或自身基因表達(dá)來建立和維持潛伏感染還需要研究。

5 展望

桿狀病毒miRNA在過去的10a中得到了越來越多的關(guān)注，這一領(lǐng)域的研究不斷擴(kuò)大了人們對(duì)桿狀病毒與宿主相互作用的認(rèn)知。但與其它病毒miRNA相比，桿狀病毒miRNA仍有許多未知領(lǐng)域有待進(jìn)一步研究：新的桿狀病毒miRNA及其靶基因鑒定，從NCBI數(shù)據(jù)庫可知已有超過200個(gè)桿狀病毒完成全基因組測(cè)序，但有miRNA相關(guān)研究的桿狀病毒只有BmMPV、AcMNPV、SpltNPV 和AgMNPV;桿狀病毒miRNA在解性感染和持續(xù)感染轉(zhuǎn)換中的作用，病毒miRNA在病毒持續(xù)性感染建立過程中具有重要作用，桿狀病毒持續(xù)感染現(xiàn)象也普遍存在，但桿狀病毒miRNA是否參與持續(xù)性感染的建立以及激活還不清楚;桿狀病毒miRNA的其它生物學(xué)功能探索，現(xiàn)有研究表明病毒miRNA的生物學(xué)功能豐富多樣，但目前有關(guān)桿狀病毒miRNA的生物學(xué)功能研究主要集中在調(diào)控宿主免疫基因和自身基因以促進(jìn)病毒復(fù)制；桿狀病毒miRNA對(duì)宿主代謝、抗逆性和發(fā)育等方面是否具有調(diào)控作用尚不清楚，這也可能是今后的研究方向。