潘亞雄 周 俊 張 宇 陶晉升 潘佳琳 唐昭陽 樊軼為 胡名廣李慧菊 張建社 褚武英

(1.長沙學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院, 長沙 410022; 2.鹽城工學(xué)院海洋與生物工程學(xué)院, 鹽城 221051)

金屬硫蛋白(Metallothioneins, MTs)基因參與了魚類對水體重金屬脅迫下的解毒反應(yīng), 它通過與細(xì)胞內(nèi)重金屬結(jié)合, 降低游離重金屬離子濃度從而降低重金屬的毒性, 其基因表達(dá)的精準(zhǔn)調(diào)控對魚類抵抗重金屬毒性具有重要意義。金屬調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子-1 (mtf-1)是金屬誘導(dǎo)MTs基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[1], 其通過與MTs基因啟動(dòng)子上的金屬響應(yīng)元件(Metal-responsive elements, MREs)的結(jié)合, 進(jìn)而調(diào)控MTs的表達(dá)。mtf-1屬于核質(zhì)穿梭蛋白, 在細(xì)胞未受到外界刺激的條件下, 大部分mtf-1存在于細(xì)胞質(zhì)中, 當(dāng)細(xì)胞受到重金屬脅迫時(shí), 它會(huì)積聚到細(xì)胞核中, 與基因啟動(dòng)子上的MREs元件結(jié)合, 通過激活MTs等靶基因的轉(zhuǎn)錄, 在重金屬的解毒、氧化應(yīng)激的保護(hù)等生理過程中發(fā)揮重要作用[2—4]。mtf-1基因序列高度保守, 在小鼠(Rattus norvegicus)、人類(Homo sapiens)、果蠅(Drosophila melanogaster)、斑馬魚(Danio rerio)和水豚(Hydrochoerus hydrochaeris)等多個(gè)物種中均被鑒定研究[5], 其蛋白質(zhì)序列包含一個(gè)高度保守的DNA結(jié)合域和一個(gè)由三種轉(zhuǎn)錄激活域組成的反式激活域, 3種轉(zhuǎn)錄激活域分別為酸性、脯氨酸和富含絲氨酸/蘇氨酸的區(qū)域[6]。關(guān)于mtf-1功能的研究主要集中在哺乳動(dòng)物[7,8], 小鼠肝臟敲低mtf-1基因后對重金屬的耐受性大大減弱,mtf-1參與了哺乳動(dòng)物谷胱甘肽合成等抗氧化通路的調(diào)控[9],mtf-1基因在魚類的研究相對較少[1,10,11]。

鎘是一種生物非必需的有毒重金屬, 由于生物半衰期長, 即使是較低的濃度, 也容易在生物體內(nèi)蓄積, 進(jìn)而導(dǎo)致器官損傷等毒性作用。魚類作為長期生活在水中的低等脊椎動(dòng)物, 直接與水體中的重金屬接觸, 對鎘具有較高的敏感性[12]。鎘在魚類中主要通過鰓和胃腸道的吸收, 在鰓、肝臟和 腎臟等器官中持續(xù)蓄積, 進(jìn)而導(dǎo)致魚類器官損傷, 代謝紊亂等毒性效應(yīng)[13]。近年來, 越來越多的研究表明鎘會(huì)對生物體的晝夜節(jié)律產(chǎn)生毒性干擾, 其通過擾亂腦組織核心生物鐘基因節(jié)律性表達(dá), 進(jìn)而導(dǎo)致生物代謝紊亂, 氧化應(yīng)激損傷等[14—16]。與哺乳類一樣,魚類活動(dòng)也具有穩(wěn)定的晝夜節(jié)律性, 我們前期在翹嘴鱖中克隆得到了與哺乳類同源的全部核心生物鐘基因(CLOCKs、BMAL1、PERs、CRYs、RORs和REV-ERBs等), 證實(shí)了翹嘴鱖和哺乳類一樣, 具有同樣的由核心生物鐘基因振蕩調(diào)控的晝夜節(jié)律性機(jī)制[17]。mtf-1作為細(xì)胞對重金屬響應(yīng)和MTs基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子, 其是否介導(dǎo)了重金屬鎘的節(jié)律毒性效應(yīng)還并未有研究。

翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)是中國特有的淡水名貴魚類, 被廣泛養(yǎng)殖[18]。但翹嘴鱖對水質(zhì)要求較高,對水體環(huán)境污染的耐受性差, 易受水質(zhì)影響而導(dǎo)致存活率較低[19]。本研究鑒定得到翹嘴鱖mtf-1的cDNA全長序列, 對其組織表達(dá)模式及序列特征進(jìn)行了分析, 并研究了其在翹嘴鱖腦組織中的晝夜表達(dá)特征, 及鎘對翹嘴鱖mtf-1晝夜節(jié)律的影響, 為探究重金屬鎘對魚類生物節(jié)律毒性效應(yīng)提供了資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)翹嘴鱖均從長沙市望城區(qū)團(tuán)山湖村翹嘴鱖養(yǎng)殖場購入, 翹嘴鱖平均體重為 200 g, 將翹嘴鱖置于室內(nèi)實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行養(yǎng)殖, 所有魚每天在早上9:00和下午5:00飽食投喂餌料魚2次, 保證實(shí)驗(yàn)魚的生物周期性一致。翹嘴鱖首先在LD光制(12h光照/12h黑暗)下馴養(yǎng)2周, 在馴養(yǎng)結(jié)束后, 進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn),養(yǎng)殖用水為已曝氣去氯的自來水。實(shí)驗(yàn)中所用的鎘為CdCl2·2.5H2O, 購自上海國藥控股有限公司。通過一定比例將CdCl2·2.5H2O和蒸餾水混合配制為原液, 保存待用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

組織表達(dá)實(shí)驗(yàn)魚的養(yǎng)殖及樣本的收集采購的翹嘴鱖用12h光照/12h黑暗的LD光制馴養(yǎng)兩周, 待翹嘴鱖狀態(tài)穩(wěn)定, 禁食24h后, 選取規(guī)格一致、健康的翹嘴鱖6尾(雌雄魚比例1﹕1)進(jìn)行取樣。用100 mg/L MS-222(3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸)對魚進(jìn)行麻醉, 然后放置在冰上解剖, 快速取其腸道(中腸)、肝臟、腦、腎臟、脾臟、心臟、鰓和肌肉(背肌上的白肌)8個(gè)組織, 置入無RNA酶EP管中, 液氮速凍后, 放入–80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

鎘脅迫實(shí)驗(yàn)魚的養(yǎng)殖及樣本的收集采購的翹嘴鱖分為正常組和脅迫組兩個(gè)處理組, 隨機(jī)放入6個(gè)50 cm×50 cm×90 cm的室內(nèi)玻璃缸中, 用12h光照/12h黑暗的LD光制馴養(yǎng)兩周, 在馴養(yǎng)結(jié)束后, 進(jìn)行時(shí)期兩周的鎘脅迫養(yǎng)殖。在此期間, 每天提供持續(xù)通氣, 保證溶氧充足。每天早上9:00和下午5:00飽食投取餌料魚2次、0.5h后清理剩余餌料魚和糞便、用已曝氣去氯的自來水換取缸中30%的水。鎘脅迫組換的水中要溶入適量的CdCl2原液,經(jīng)稀釋后加入缸中, 保持水體中的Cd濃度在20 μg Cd/L。用pH測定計(jì)分別測定缸中pH, 使pH維持在7.2—7.4、水溫(24±1)℃。兩周脅迫結(jié)束, 翹嘴鱖禁食24h后開始取樣。取樣時(shí)間節(jié)點(diǎn)分別是06:30(ZT0)、09:30(ZT3)、12:30(ZT6)、15:30(ZT9)、18:30(ZT12)、21:30(ZT15)、24:30(ZT18)、次日03:00(ZT21)和次日06:30(ZT24), ZT0表示每天光照開始的時(shí)間。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選取3尾魚, 用100 mg/L MS-222對魚進(jìn)行麻醉, 然后放置在冰上解剖, 快速取腦組織, 置入無RNA酶EP管中, 液氮速凍后, 放入–80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

總RNA的提取以及cDNA的合成冷凍的組織樣品放入已加研磨珠和1 mL RNAios Plus的無酶EP管中, 使用高速勻漿儀勻漿。后續(xù)步驟參照TaKaRa的RNAiso Plus說明書進(jìn)行。為驗(yàn)證總RNA濃度和純度, 采用超微量核酸蛋白分析儀對其進(jìn)行測定?？俁NA的完整性通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測, 當(dāng)28s與18s條帶亮度為2﹕1且條帶清晰可見時(shí), 表明提取的RNA具有較高的完整性。取1 μg的總RNA采用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。合成的單鏈cDNA收集保存至–80℃供后續(xù)分析。

引物合成及序列分析采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)qPCR引物, 并送擎科生物有限公司合成(表1)。采用Megalign v7.1.0軟件對翹嘴鱖mtf-1與其他物種的同源性進(jìn)行分析。使用bioedit v7.2.5默認(rèn)設(shè)置的ClustalW程序進(jìn)行多序列比對, 再通過GeneDocv6中文版進(jìn)行優(yōu)化編輯, 得到序列比對結(jié)果。使用JASPER 2022(https://jaspar.genereg.net)轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測數(shù)據(jù)庫對翹嘴鱖mtf-1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 kb區(qū)域進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測。

表1 定量引物Tab.1 Quantitative primers

實(shí)時(shí)熒光定量PCR通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測基因表達(dá)量。在RT-qPCR分析中, 每個(gè)樣品檢測3個(gè)技術(shù)重復(fù)。RT-qPCR的反應(yīng)總體系一共為25 μL, 反應(yīng)成分為SYBR Premix ExTaqTMⅡ 12.5 μL, cDNA 1 μL, 上下游引物各為1 μL,ddH2O 9.5 μL。qPCR條件為: 95℃預(yù)變形1min;95℃變性5s; 58℃退火、延伸30s; 39個(gè)循環(huán); 溶解溫度在65—95℃。組織表達(dá)實(shí)驗(yàn)以rpl-13為內(nèi)參,節(jié)律分析實(shí)驗(yàn)以β-actin為內(nèi)參。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

所有數(shù)據(jù)以mean±SE表示。熒光定量PCR采用2–??Ct方法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 利用單因素方差分析(Oneway ANOVA)和Tukey’s multiple comparisons test比較不同組織之間的差異,P<0.05水平下差異顯著。翹嘴鱖腦組織mtf-1基因的晝夜節(jié)律通過SPSS 20.0獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析后, 采用matlab 7.0通過函數(shù)方程式f(t)=M+Acos(t/12-φ)對定量數(shù)據(jù)進(jìn)行余弦擬合。方程中f(t)給定時(shí)間內(nèi)基因表達(dá)水平; M為平均值; A為振蕩振幅;φ為峰值相位, 即最高振幅所在時(shí)間點(diǎn)換算出的角度。當(dāng)不同時(shí)間點(diǎn)基因表達(dá)量單因素方差分析顯著性差異P<0.05和余弦擬合P<0.3時(shí), 則視該基因具有晝夜節(jié)律性[20,21]。

2 結(jié)果

2.1 mtf-1基因氨基酸序列比對及同源性分析

翹嘴鱖mtf-1cDNA全長為2758 bp, 由816個(gè)氨基酸組成。氨基酸比對結(jié)果表明, 翹嘴鱖mtf-1具有一個(gè)典型的DNA結(jié)合域和一個(gè)反式激活域(包括:酸性、脯氨酸和絲氨酸/蘇氨酸豐富區(qū)域), 以及核定位信號(NLS)和核輸出信號(NES) (圖1), 其中DNA結(jié)合域高度保守, 反式激活域區(qū)域高度可變。mtf-1氨基酸序列同源性分析表明, 翹嘴鱖mtf-1與其他物種具有較高的序列同源性, 其中與斑馬魚mtf-1基因同源性為77.1%, 與人類mtf-1基因同源性為56.8%, 表明在進(jìn)化中不同物種mtf-1趨向保守。

2.2 mtf-1上游轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測

對翹嘴鱖mtf-1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 kb序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測分析, 鑒定得到多個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(圖2), 如核心時(shí)鐘基因類視黃醇相關(guān)孤兒受體β(RORβ)、MAF蛋白家族中的MAFF和MAFG、鋅指轉(zhuǎn)錄因子Klf4以及多種鋅指蛋白結(jié)合位點(diǎn)等, 但翹嘴鱖mtf-1基因啟動(dòng)子區(qū)域并未找到金屬響應(yīng)元件(MRE)。

圖2 翹嘴鱖mtf-1基因5′上游2 kb區(qū)域預(yù)測的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的示意圖.Fig.2 Schematic representation of predicted putative transcription factor binding motifs in the 2 kb region upstream of the 5′-upstream of the Siniperca chuatsi mtf-1 gene.

2.3 mtf-1基因的組織表達(dá)

為了研究翹嘴鱖mtf-1基因在不同組織中的表達(dá)水平, 對8個(gè)不同組織(心、肝、脾、腎、鰓、腸、腦和白肌)的cDNA進(jìn)行半定量PCR(RTPCR)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR ( RT-qPCR ) 檢測(圖3),翹嘴鱖mtf-1在所檢測的組織中均有表達(dá), 其在腦組織中表達(dá)量最高, 其次是腎臟以及心臟組織, 在腸道、鰓、肌肉和肝臟中低表達(dá), 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析和半定量PCR兩種不同檢測方法, 檢測結(jié)果相似。

圖3 mtf-1在翹嘴鱖不同組織的表達(dá)水平Fig.3 Expression levels of mtf-1 in different tissues of Siniperca chuatsi

2.4 mtf-1基因在腦的晝夜節(jié)律表達(dá)分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量對翹嘴鱖腦組織中mtf-1基因24h晝夜節(jié)律表達(dá)進(jìn)行分析, 并使用matlab分析其晝夜節(jié)律性, 結(jié)果表明mtf-1基因在正常組的翹嘴鱖腦中表現(xiàn)出晝低夜高的表達(dá)趨勢, 其表達(dá)峰值對應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)為ZT=12.65(黃昏時(shí)期; 表2), 鎘脅迫后,mtf-1基因呈現(xiàn)持續(xù)低表達(dá), 晝夜表達(dá)差異不顯著,且在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量均低于對照組(圖4), 表明重金鎘抑制了翹嘴鱖腦組織mtf-1基因表達(dá), 并導(dǎo)致翹嘴鱖mtf-1表達(dá)由晝低夜高變?yōu)闀円钩掷m(xù)低表達(dá)。

圖4 鎘脅迫對翹嘴鱖腦組織mtf-1基因的節(jié)律表達(dá)Fig.4 The effect of cadmium on rhythmic expression of mtf-1 gene in the brain of Siniperca chuatsi

表2 翹嘴鱖腦mtf-1基因的節(jié)律性參數(shù)Tab.2 Rhythmical parameters of mtf-1 gene in brain of Siniperca chuatsi

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子mtf-1協(xié)調(diào)MTs基因的表達(dá), 對于降低重金屬對機(jī)體的毒性作用有重要意義。翹嘴鱖mtf-1由816個(gè)氨基酸組成, 只有1個(gè)mtf-1亞型, 與絕大多數(shù)哺乳類和魚類只有1個(gè)mtf-1亞型一致, 但在大西洋鮭和鯉中發(fā)現(xiàn)2個(gè)以上mtf-1亞型, 這可能是由于鯉科魚類和鮭科魚類特有的全基因組倍增所導(dǎo)致[23,24]。翹嘴鱖mtf-1序列包含1個(gè)DNA結(jié)合域和3個(gè)不同的激活域(富含酸性氨基酸的區(qū)域、接著是富含脯氨酸的區(qū)域以及富含絲氨酸/蘇氨酸的區(qū)域), 此外還有核定位信號(NLS)和核輸出信號(NES), 與哺乳類mtf-1基因功能域結(jié)構(gòu)高度一致。序列同源性分析發(fā)現(xiàn)翹嘴鱖mtf-1氨基酸序列與斑馬魚mtf-1基因同源性為77.1%, 與人類mtf-1基因同源性為56.8%, 雖然翹嘴鱖mtf-1序列與哺乳動(dòng)物mtf-1序列保守性不高, 但其DNA結(jié)合區(qū)域卻與哺乳類mtf-1基因DNA結(jié)合域高度相似, 說明翹嘴鱖mtf-1基因可能與哺乳類mtf-1基因調(diào)控相似的靶基因表達(dá)。

組織表達(dá)分析表明翹嘴鱖mtf-1在所檢測的各個(gè)組織均有表達(dá), 其中在腦、腎臟及心臟中具有較高表達(dá)。鯉中的研究也發(fā)現(xiàn)mtf-1基因在腦組織中最高表達(dá)[12], 與本研究結(jié)論相似。研究表明mtf-1對中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織的發(fā)育是不可缺少的[25], 此外,小鼠中的研究發(fā)現(xiàn)mtf-1還對小鼠胚胎肝臟的正常發(fā)育和功能尤為重要[26,27], 表明mtf-1在機(jī)體發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。我們對翹嘴鱖mtf-1的5′上游區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測, 在翹嘴鱖mtf-1啟動(dòng)子上鑒定到多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子靶向位點(diǎn), 包括鋅指蛋白ZNF136、ZNF384、ZNF143、RORβ、MAFF、MAFG和SPIC等。類視黃醇相關(guān)孤兒受體β(RORβ)核心生物鐘基因, 在生物的晝夜節(jié)律維持中發(fā)揮著重要的作用[28]。鋅指蛋白(ZNFs)是蛋白質(zhì)中含量最豐富的一類, 它涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA修復(fù)、細(xì)胞遷移等眾多過程[29]。研究表明, 在黃顙魚和鮑等物種mtf-1啟動(dòng)子上存在MRE位點(diǎn)[1,30], 表明mtf-1存在自調(diào)節(jié), 但在翹嘴鱖啟動(dòng)子上并沒有發(fā)現(xiàn)MRE位點(diǎn), 說明mtf-1自調(diào)節(jié)在魚類中并不是普遍存在。

晝夜節(jié)律支配著大多數(shù)物種的休息/活動(dòng)周期,并影響生物體代謝水平與周期變化[31]。大量研究表明, 重金屬鎘通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激進(jìn)而導(dǎo)致器官損傷, 代謝紊亂等毒性效應(yīng)[32,33]。近期, 越來越多的研究也表明包括鎘在內(nèi)的重金屬具有很強(qiáng)的內(nèi)分泌毒性效應(yīng), 會(huì)通過影響腦垂體褪黑素等激素的分泌, 進(jìn)而導(dǎo)致生物晝夜節(jié)律發(fā)生紊亂[34,35]。魚類中的研究表明腦組織是水體重金屬鎘的重要毒性靶器官[36], 但關(guān)于重金屬鎘對魚類晝夜節(jié)律影響的相關(guān)研究還較少。本研究發(fā)現(xiàn)水體鎘脅迫導(dǎo)致翹嘴鱖腦組織mtf-1基因晝夜節(jié)律發(fā)生紊亂, 正常組mtf-1基因在翹嘴鱖腦組織中呈現(xiàn)晝低夜高的表達(dá)趨勢,峰值對應(yīng)區(qū)時(shí)ZT 12.65h, 在鎘脅迫下,mtf-1基因相比正常組持續(xù)低表達(dá), 基因表達(dá)峰值提前至 ZT 3.71h, 同時(shí)增幅減弱, 晝夜表達(dá)差異不顯著。研究發(fā)現(xiàn), 物質(zhì)代謝和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)等都受生物節(jié)律調(diào)控,如肝臟中發(fā)現(xiàn)100多個(gè)代謝相關(guān)的基因呈現(xiàn)晝夜節(jié)律性變化, 擾亂生物節(jié)律則會(huì)導(dǎo)致代謝紊亂, 細(xì)胞損傷[37,38]。mtf-1作為重要的重金屬解毒反應(yīng)調(diào)控基因, 其腦組織基因表達(dá)晝夜節(jié)律紊亂將對鎘毒性效應(yīng)具有較大的促進(jìn)作用。本研究也表明水體鎘脅迫對魚類腦組織具有晝夜節(jié)律毒性效應(yīng)。