黃 瑩 葛汝祥 婁格格 滿 洲 姜能座 郭雅哲 朱曉鳴李晨昊 劉軒宇 陳新華

(1.福建農(nóng)林大學海洋學院, 福建省海洋生物技術(shù)重點實驗室, 福州 350002; 2.福建省測試技術(shù)研究所, 福州 350003;3.中國科學院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點實驗室, 武漢 430072)

隨著環(huán)保意識和健康認知的不斷提高, 綠色養(yǎng)殖成為新時代產(chǎn)業(yè)發(fā)展的前進方向, 而尋找多功能、無污染、無殘留的飼料添加劑是促進水產(chǎn)養(yǎng)殖可持續(xù)發(fā)展的必經(jīng)之路。輔酶Q10(Coenzyme Q10), 又稱泛醌, 是一種天然存在的脂溶性物質(zhì), 結(jié)構(gòu)與維生素K、維生素E和質(zhì)體醌相似, 其作為線粒體電子傳遞鏈(ETC)中的輔助因子參與細胞生物能量學, 對于ATP產(chǎn)生至關(guān)重要[1]。輔酶Q10主要來源為機體自身合成, 機體合成量會隨年齡增加而減少[2]。輔酶Q10合成量不足會導致機體組織出現(xiàn)線粒體功能障礙和氧化損傷, 對心肌、大腦等需能高的組織造成危害[3]。另外, 輔酶Q10的缺乏還會導致CoQ2、CoQ6等基因的變異, 肝臟、腎臟等器官受損引起多種疾病, 因此需要外源補充保證體內(nèi)輔酶Q10含量的穩(wěn)定[4]。由于輔酶Q10為脂溶性, 在被動物攝食后, 易透過細胞膜被完全吸收[5]。有研究表明, 高劑量的輔酶Q10添加也不會對動物產(chǎn)生明顯的毒性[6—8], 說明輔酶Q10是一種多功能、易吸收、安全性高的營養(yǎng)性添加劑。

輔酶Q10可清除自由基[9], 降血脂[10], 抗氧化[11],提高免疫力[12], 對肝腎具有保護作用[13], 并且可治療多種疾病[14], 提高動物存活率[15], 保證動物精子質(zhì)量[16]等功能。輔酶Q10自1957年Frederick Crane從牛心臟中分離得到后[17], 已在食品、醫(yī)藥和畜牧等領(lǐng)域有廣泛應用[18,19]。在小鼠攝食輔酶Q10后,脂肪組織中的脂質(zhì)氧化增多, 脂質(zhì)清除率提高, 減少了脂肪組織的重量[20]。用輔酶Q10可治療醋酸鉛引起的氧化應激, 大鼠皮質(zhì)組織中SOD、CAT和GSH-Px酶活性顯著提升, MDA含量顯著降低, 同時SOD和CAT的基因表達量顯著上調(diào)[21]。輔酶Q10能發(fā)揮保護缺血心肌的作用, 可有效改善冠心病患者的心功能[22]。高血壓患者接受輔酶Q10外源補充后, 其血壓水平明顯下降[23]。飼料中補充輔酶Q10后, 鵪鶉(Coturnix japonica)的日采食量、日增重和飼料轉(zhuǎn)化率都得到顯著提升[24]。輔酶Q10通過發(fā)揮其抗氧化特性, 可提高雄鹿精子質(zhì)量和胚胎的發(fā)育能力[25]。輔酶Q10能顯著改善動物生長性能和肉品質(zhì), 在飼料行業(yè)具有廣闊的應用前景[26]。

羅非魚又名非洲鯽魚, 是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類。自20世紀50年代引入我國后, 養(yǎng)殖產(chǎn)量和養(yǎng)殖水平得到大幅提升。目前, 中國已是羅非魚最大的生產(chǎn)國和消費國, 羅非魚養(yǎng)殖具有較好的前景[27]。吉富羅非魚是羅非魚經(jīng)遺傳性狀改良后的品種, 具有生長快、食性雜、易飼養(yǎng)和肉質(zhì)鮮美等優(yōu)點。目前關(guān)于輔酶Q10在水產(chǎn)動物上的研究鮮有報道。本實驗旨在研究長期攝食輔酶Q10對吉富羅非魚幼魚生長、體成分、抗氧化能力、肝臟抗氧化相關(guān)基因表達和抗病力等方面的影響, 為輔酶Q10應用于水產(chǎn)飼料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 養(yǎng)殖系統(tǒng)

養(yǎng)殖實驗在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行, 系統(tǒng)由12個體積相同的圓柱體PP缸(直徑80 cm, 桶高70 cm)組成, 水體體積為180 L/缸, 每缸水流速度為0.6 L/min。每天檢測2次氣溫和水溫, 每2周檢測水體溶氧和氨氮情況。實驗期間, 水溫為24—26℃, 保持水體中溶解氧含量在6 mg/L以上, 氨氮為0.2—0.4 mg/L, pH為6.8—7.0。光照周期12L﹕12D, 光照周期為每天8:00到20:00。

1.2 實驗飼料及實驗設計

實驗基礎(chǔ)飼料的原料組成和常規(guī)化學成分如表1所示。實驗基礎(chǔ)飼料添加不同水平輔酶Q10(0、40、80和120 mg/kg)配置成4種實驗飼料。以豆粕、雞肉粉、菜粕、棉粕和魚粉等為主要蛋白源, 以豆油為主要脂肪源。飼料原料由福建大昌生物科技實業(yè)有限公司提供。輔酶Q10購自美國Sigma公司。將輔酶Q10純品按設計量與豆油充分混合, 然后將含有不同含量輔酶Q10的大豆油添加到各組實驗飼料中混合均勻, 用飼料機制成直徑為2 mm的顆粒飼料, 在室溫下于陰暗處平鋪放置, 待干燥后儲存于–20℃冰箱。

表1 實驗基礎(chǔ)飼料配方及化學組成(g/kg干物質(zhì))Tab.1 Diet formulation and chemical composition of experimental diets (g/kg in dry matter)

1.3 實驗魚與飼養(yǎng)實驗

實驗吉富羅非魚幼魚來自福建省淡水水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖基地。正式實驗前挑選健康活潑、規(guī)格相近、體表無明顯損傷的吉富羅非魚幼魚暫養(yǎng)于室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中。用實驗基礎(chǔ)飼料暫養(yǎng)2周后, 挑選規(guī)格相近的312尾吉富羅非魚幼魚隨機投放到12個養(yǎng)殖缸中, 每養(yǎng)殖缸放養(yǎng)26尾。將這12個缸隨機分成4個實驗組, 每組再設置3個平行, 進行為期56d的養(yǎng)殖實驗。在暫養(yǎng)期間和實驗期間, 每天分別于8:00和16:00連續(xù)投喂1h達到表觀飽食(少量多次地循環(huán)投喂, 不留殘餌或極少殘餌)。實驗開始2周后, 每天于幼魚攝食2h后用虹吸管收集魚缸中新鮮的魚糞, 烘箱中60℃烘干, –20℃保存, 留作干物質(zhì)消化率分析用。每天記錄水溫、攝食情況和實驗魚死亡情況, 在養(yǎng)殖實驗結(jié)束后, 實驗魚饑餓24h后稱取每缸魚的終末體重。

1.4 實驗取樣

在養(yǎng)殖實驗結(jié)束后, 每缸分別取12尾魚用MS-222(購自美國Sigma公司)麻醉。麻醉后隨機取3尾魚, 使用注射器于尾靜脈采血, 于4℃下以3500 r/min離心10min, 取3尾魚血清混合成一個樣品于–80℃冰箱中保存, 用于血液指標的測定。在冰盤上解剖出肝臟, 3尾魚肝臟混合成1個樣品, 放入凍存管中經(jīng)液氮急凍, 稍后轉(zhuǎn)移到–80℃冰箱中保存, 用于肝臟抗氧化酶的測定。另取3尾魚稱取體重并測量體長, 解剖后稱取內(nèi)臟團和肝臟質(zhì)量, 用于計算肥滿度、臟體比和肝體比。再取3尾魚解剖出肝臟和腸道, 經(jīng)中性甲醛固定后進行HE染色, 制作切片, 絨毛密度按照Barducci 等[28]的方法計算每mm2的絨毛個數(shù)。剩余3尾魚, 解剖出肝臟后混合, 置于–80℃保存, 用于分析肝臟相關(guān)基因的表達。

1.5 樣品的測定

采用外源指示劑(Y2O3)測量干物質(zhì)消化率[29]。根據(jù)指示劑及干物質(zhì)在飼料和糞便中的含量變化,計算干物質(zhì)消化率。

實驗飼料和魚體的水分、粗蛋白、粗脂肪、灰分的測定參照文獻[30]的方法測定: 將樣品在105℃烘干至恒重, 通過失重法測定干物質(zhì), 從而計算出水分; 粗蛋白采用FOSS 定氮儀(2300 Kjeltec Analyzer Unit)測定; 粗脂肪采用索氏抽提儀(Soxtec system HT6, Tecator, Hoganas, Sweden)測定; 灰分在馬福爐中550℃燃燒3h, 失重法測定。

過氧化氫酶(CAT)、總超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)活性及丙二醛(MDA)、膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。

肝臟相關(guān)基因表達測定采用實時熒光定量PCR (qRT-PCR)反應體系。根據(jù)TRIzol法提取樣品的總RNA后, 再根據(jù)試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄過程中使用DNA酶去除基因組DNA, 引物的擴增效率在有效范圍(0, 1)之內(nèi)。因β-actin具有氨基酸序列的高度保守性, 能在不同組織中持續(xù)衡量地表達, 且表達量高, 故將其作為內(nèi)參基因用來計算基因的相對表達量[31]。以逆轉(zhuǎn)錄cDNA第一條鏈為模板, 然后β-actin與目的基因引物同時在不同反應孔內(nèi)進行qRT-PCR擴增?？偡磻w積為20 μL的反應體系如下: cDNA模板9 μL, 10 μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix, 10 μmol/L正/反定量引物各0.5 μL。每個時相做5個平行樣品, 每個樣品做4次重復。PCR反應條件: 95℃ 15s, 60℃ 1min,40個循環(huán)。本實驗所需特定引物(表2)均在NCBI(the National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫中設計[32]。經(jīng)驗證后使用特定引物組擴增選定的基因, 同時對每個基因的溶解曲線進行分析,溶解曲線均無雜峰, 證明引物設計符合實驗要求[33]。

表2 實驗所用引物Tab.2 Primers used in the experiment

根據(jù)儀器自動給出樣品的RQ值(2–ΔΔCt, ?Ct=樣品目的基因的Ct值–內(nèi)參基因β-actin Ct值, ΔΔCt=每一個樣品的?Ct值–基準樣品的?Ct值), 記錄下RQ值, 基因表達水平均用RQ平均值±標準誤(mean±SE)來表示。

1.6 攻毒實驗

所用的病原為嗜水氣單胞菌, 購自廣東省微生物菌種保藏中心(GIMCC)。將嗜水氣單胞菌接種在FWA培養(yǎng)基(蛋白胨5 g/L、牛肉膏2.5 g/L、酵母膏2.5 g/L、葡萄糖1 g/L、NaCl 15 g/L、MgSO40.05 g/L、K2HPO40.2 g/L和瓊脂15 g/L, pH 7.2—7.4)上, 30℃培養(yǎng)36h后, 用0.85%的無菌生理鹽水洗脫菌體, 菌液濃度為3×107cfu/mL。在56d的養(yǎng)殖試驗結(jié)束后,每缸隨機取10尾魚, 經(jīng)胸鰭基部注射0.3 mL嗜水氣單胞菌活菌懸液, 進行攻毒實驗, 分別記錄攻毒后1—10d的死亡情況, 計算累計存活率。

1.7 數(shù)據(jù)處理

利用下列公式計算特定生長率、攝食率和飼料效率:

特定生長率(SGR, %/d)=100×(LnWt–LnW0)/t

攝食率(FR, %BW/d)=100×I/[(Wt+W0)/2]/t

飼料效率(FE, %)=100×(Wt–W0)/I

干物質(zhì)消化率(DMD, %)=100×(1–B/B1)

肥滿度(CF, g/cm3)=100×(Wt/L3)

肝體比(HSI)=100%×(Wz/Wt)

臟體比(VSI)=100%×(Wv/Wt)

攻毒后累計存活率(%)=100×Xt/X0

式中,W0為平均初始體重(g),Wt為平均終末體重(g),t為實驗時長(d),I為攝食量(g),B為飼料中Y2O3含量,B1為糞便中Y2O3含量,L為平均終末體長(cm),Wz為平均終末肝胰臟質(zhì)量(g),Wv為平均終末內(nèi)臟團質(zhì)量(g),X0為開始攻毒時實驗魚的尾數(shù),Xt為攻毒t時間后實驗魚的存活尾數(shù)。實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準誤(mean±SE)表示, 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。實驗結(jié)果經(jīng)一元方差分析(Oneway ANOVA)后, 用Duncan’s 進行多重比較, 當P<0.05時, 為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 飼料中輔酶Q10水平對吉富羅非魚幼魚生長性能的影響

在整個實驗過程中, 各實驗組的吉富羅非魚幼魚均未表現(xiàn)出行為異常。由表3所示, 不同水平輔酶Q10對吉富羅非魚幼魚初始體重(IBW)、終末體重(FBW)、存活率(SR)、攝食率(FR)、特定生長率(SGR)、飼料效率(FE)、肥滿度(CF)、肝體比(HSI)和臟體比(VSI)均無顯著影響(P>0.05), 120 mg/kg輔酶Q10組終末體重、特定生長率和飼料效率在各組中均為最高。當輔酶Q10添加量為120 mg/kg時,吉富羅非魚幼魚的干物質(zhì)消化率顯著升高(P<0.05)。

表3 飼料輔酶Q10含量對吉富羅非魚幼魚生長、飼料利用及體指標的影響(平均值±標準誤)*Tab.3 Effects of dietary CoQ10 on growth performance, feed utilization and physical indexes of juvenile GIFT tilapia (mean±SE)*

2.2 飼料中輔酶Q10對吉富羅非魚幼魚體成分的影響

如表4所示, 各實驗組間吉富羅非魚幼魚去內(nèi)臟全魚的水分、干物質(zhì)、粗蛋白和灰分含量無顯著差異(P>0.05), 當輔酶Q10添加量為120 mg/kg時,去內(nèi)臟全魚的粗脂肪含量顯著低于對照組(P<0.05)。各組間吉富羅非魚幼魚內(nèi)臟團的水分、干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪和灰分含量均無顯著差異(P>0.05)。

表4 飼料輔酶Q10含量對吉富羅非魚幼魚體成分含量的影響(平均值±標準誤)Tab.4 Effect of dietary CoQ10 on body composition of juvenile GIFT tilapia (mean±SE)

2.3 飼料中輔酶Q10水平對吉富羅非魚幼魚抗氧化指標的影響

由表5所示, 40 mg/kg輔酶Q10組吉富羅非魚幼魚血清過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)活性均顯著高于對照組(P<0.05), 總超氧化物歧化酶(SOD)與對照組無顯著差異(P>0.05)。80 mg/kg輔酶Q10組吉富羅非魚幼魚血清CAT和GSH-Px均顯著高于對照組(P<0.05), SOD和GST均與對照組無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比, 120 mg/kg輔酶Q10組吉富羅非魚幼魚血清CAT、SOD和GSH-Px活性顯著升高(P<0.05), GST活性無顯著差異(P>0.05)。120 mg/kg輔酶Q10組吉富羅非魚幼魚血清中膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量顯著低于對照組, 其他各組TC和TG與對照組均無顯著差異(P>0.05)。

表5 飼料輔酶Q10含量對吉富羅非魚幼魚血清抗氧化指標以及血清膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量的影響(平均值±標準誤)Tab.5 Effect of dietary CoQ10 on serum antioxidant indexes, total cholesterol (TC) and triglyceride (TG) of juvenile GIFT tilapia(mean±SE)

如表6所示, 40 mg/kg輔酶Q10組吉富羅非魚幼魚肝臟的過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性均顯著高于對照組(P<0.05), 總超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)和丙二醛含量(MDA)均與對照組無顯著性差異(P>0.05)。與對照組相比, 80和120 mg/kg輔酶Q10組吉富羅非魚幼魚肝臟CAT、SOD、GSH-Px、GST活性均顯著升高(P<0.05), MDA含量均顯著降低(P<0.05)。

表6 飼料輔酶Q10含量對吉富羅非魚幼魚肝臟抗氧化指標的影響(平均值±標準誤)Tab.6 Effect of dietary CoQ10 on liver antioxidant indexes of juvenile GIFT tilapia (mean±SE)

2.4 飼料中輔酶Q10對吉富羅非魚幼魚肝臟和腸道組織學的影響

如圖1所示, 對照組吉富羅非魚幼魚肝臟組織學切片顯示出肝臟組織的正常組織學特征。可以觀察到正常的肝實質(zhì), 肝細胞形成索狀結(jié)構(gòu)。且細胞間界限分明, 大多數(shù)肝細胞只有一個細胞核, 細胞核位于細胞中央, 近似圓形, 邊緣清晰, 胞質(zhì)豐富。各輔酶Q10組的肝臟結(jié)構(gòu)均未出現(xiàn)異常, 肝細胞排列緊密, 大小和排列方式均與對照組相似。

圖1 輔酶Q10含量對吉富羅非魚幼魚肝臟組織學的影響(HE,標尺為50 μm)Fig.1 Liver of juvenile GIFT tilapia fed with diets containing CoQ10 (HE, Bar=50 μm)

如圖2所示, 各實驗組吉富羅非魚幼魚腸道組織學切片顯示出腸道組織的正常組織學特征。從內(nèi)到外由黏膜層、黏膜下層、肌層和外膜四層結(jié)構(gòu)構(gòu)成。腸道組織完整, 肌層緊實, 黏膜層腸絨毛柱狀上皮細胞完整且緊密排列, 表面可觀察到紋狀緣, 杯狀細胞均勻分布。120 mg/kg輔酶Q10組腸道組織結(jié)構(gòu)正常, 腸絨毛相較于對照組排列更加緊密。由表7所知, 120 mg/kg輔酶Q10組吉富羅非魚腸道的絨毛長度、絨毛密度和肌層厚度均顯著高于對照組(P<0.05)。

表7 飼料輔酶Q10含量對吉富羅非魚幼魚腸道結(jié)構(gòu)的影響(平均值±標準誤)Tab.7 Effects of dietary CoQ10 on intestinal structure of juvenile GIFT tilapia (mean±SE)

圖2 輔酶Q10含量對吉富羅非魚幼魚腸道組織學的影響(HE,標尺為50 μm)Fig.2 Intestinal histology of juvenile GIFT tilapia fed with diets containing CoQ10 (HE, Bar=50 μm)

2.5 飼料中輔酶Q10水平對吉富羅非魚幼魚肝臟相關(guān)基因表達的影響

如圖3所示, 120 mg/kg輔酶Q10組的sod、cat、gsh-px和gst基因表達量最高, 且顯著高于其他各組(P<0.05)。80和120 mg/kg輔酶Q10組的免疫球蛋白M(igm)基因表達量顯著高于對照組(P<0.05)。各輔酶Q10組的il-1β和il-8基因表達量均顯著低于對照組(P<0.05)。

圖3 輔酶Q10含量對吉富羅非魚幼魚肝臟相關(guān)基因表達的影響Fig.3 Effect of dietary CoQ10 on the expression of liver-related genes in juvenile GIFT tilapia

2.6 飼料中輔酶Q10水平對吉富羅非魚幼魚抗病力的影響

如圖4所示, 每天記錄一次所有組吉富羅非魚幼魚的累計存活率。注射嗜水氣單胞菌8d后, 所有組存活率達到穩(wěn)定狀態(tài)。80和120 mg/kg輔酶Q10組的累計存活率分別為70.00%和80.00%, 均顯著高于對照組和40 mg/kg輔酶Q10組(P<0.05), 其10d累計存活率均為46.67%。

圖4 輔酶Q10含量對嗜水氣單胞菌攻毒后吉富羅非魚幼魚存活率的影響Fig.4 Effects of dietary CoQ10 on survival rate of juvenile GIFT tilapia challenged with Aeromonas hydrophila

3 討論

3.1 飼料中輔酶Q10水平對吉富羅非魚幼魚生長性能的影響

日糧中補充輔酶Q10對肉雞采食量、體重增加和飼料轉(zhuǎn)化率均無顯著的影響[34,35]。但也有研究發(fā)現(xiàn), 飼料中補充輔酶Q10能提高動物的生長性能[36],例如顯著增加了21日齡肉雞的平均體重[37]。飼糧中補充輔酶Q10后, 鵪鶉的終末體重、累計采食量和飼料效率顯著增加[24,38]。飼料中補充40 mg/kg輔酶Q10, 顯著提高了非洲鯰(Clarias gariepinus)的終末體重和特定生長率[39]。生長性能提升的原因可能是輔酶Q10具有一定的抗炎特性, 能顯著降低機體應激狀態(tài)造成的損傷[40]。但在本實驗中, 不同輔酶Q10水平對終末體重、特定生長率、攝食率和飼料效率均無顯著影響, 但隨著輔酶Q10含量的增加終末體重、特定生長率和飼料效率有上升的趨勢,120 mg/kg輔酶Q10組終末體重、特定生長率和飼料效率均為最高, 比對照組分別提高了2.32%、3.03%和4.44%。研究結(jié)果不同可能是受物種、年齡、飼料組成和實驗條件等因素的影響。肥滿度能反映魚類生長狀況, 其大小與溫度、飼料和繁殖等密切相關(guān)[41]。肝體比可反映實驗期間肝臟功能的好壞,而臟體比可用來衡量動物攝入能量的分配情況[42]。飼喂輔酶Q10顯著降低了非洲鯰的肝體比, 但對肥滿度無顯著影響[39]。在本實驗中, 不同輔酶Q10水平對肥滿度、肝體比和臟體比均無顯著影響, 該結(jié)果與El Basuini等[43]的報道相似。

3.2 飼料中輔酶Q10水平對吉富羅非魚幼魚體成分的影響

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是重要的脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)因子, 在AMPK磷酸化后會刺激分解代謝途徑, 減少膽固醇、脂肪酸和甘油三酯的合成[44]。過氧化物酶體增值物激活受體(PPAR)是脂質(zhì)代謝中的轉(zhuǎn)錄因子, 在脂代謝和脂肪酸氧化中起重要作用[45]。輔酶Q10能通過介導AMPK途徑誘導PPAR的表達,從而減少脂肪的合成[44]。研究表明, 肉雞肝臟中PPAR-α基因的表達隨輔酶Q10補充水平的升高而線性增加, 脂肪酸氧化增多, 肉雞腹部脂肪和血脂降低[46]。羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)是膽固醇合成的限速酶, 輔酶Q10能顯著降低HMGR活性從而抑制膽固醇的生成[47]。日糧中補充20 mg/kg輔酶Q10, 肉雞肝臟中HMGR活性顯著降低, 血清中膽固醇顯著降低[35]。小鼠在攝食輔酶Q10后, 脂肪組織中的脂質(zhì)氧化增多, 脂質(zhì)清除率提高, 降低了脂肪組織的重量[20]。血清TC和TG含量可反映機體脂質(zhì)代謝情況, TC和TG含量過高可引起動物肝功能損傷[48]。日糧補充輔酶Q10, 肉雞血液中TC和TG含量顯著降低[49]。飼料中添加輔酶Q10, 水牛(Bubalus bubalis)犢牛的血清總脂質(zhì)和TG均顯著降低[50]。家兔攝食含輔酶Q10的飼糧, 血清TC和TG均顯著降低[51]。在本實驗中, 當輔酶Q10添加量為120 mg/kg時, 顯著降低了吉富羅非魚幼魚血清TC、TG及去內(nèi)臟全魚的粗脂肪含量, 但對水分、粗蛋白和灰分均無顯著影響。

3.3 飼料中輔酶Q10水平對吉富羅非魚幼魚抗氧化指標的影響

動物體抗氧化系統(tǒng)由一系列抗氧化酶組成。機體長期處于不良條件下會產(chǎn)生大量氧自由基, 自由基發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應轉(zhuǎn)化為MDA。CAT能協(xié)同SOD將體內(nèi)多余活性氧自由基轉(zhuǎn)化為水, GST也可以與GSH-Px互作清除自由基[43]。輔酶Q10在機體以其還原態(tài)形式發(fā)揮抗氧化作用。還原型輔酶Q10的異戊二烯側(cè)鏈能夠滲入飽和脂肪酸的膜脂類雙層, 保護細胞膜的磷脂和低密度脂蛋白, 減少自由基對脂質(zhì)、蛋白質(zhì)的損傷并清除體內(nèi)多種氧化誘導劑誘導產(chǎn)生的自由基[52,53]。輔酶Q10能顯著提高SOD和GSH-Px的活性, 有效降低人體血清MDA的含量, 說明輔酶Q10對人體具有抗氧化作用[54]。水牛犢牛在斷奶期間補充輔酶Q10后, 血清中SOD和CAT酶活性顯著升高[50]。飼料中添加20 mg/kg的輔酶Q10能顯著增加育肥豬背長肌SOD酶活性,MDA含量顯著降低[18]。飼喂40 mg/kg輔酶Q10能顯著改善冷應激下鵪鶉的抗氧化狀態(tài)(TAS), 顯著增加SOD活性和降低MDA含量[38]。輔酶Q10能減輕肉雞氧化應激損傷, 肝臟線粒體內(nèi)T-SOD活性升高以及MDA含量顯著降低[55]。魚類的血液指標是反映魚體健康狀況的重要參數(shù), 血液中抗氧化酶活性反映了清除機體自由基和活性氧的能力[56]。非洲鯰在攝食輔酶Q10后, 血清SOD、CAT、GSHPx酶活性顯著升高, 血清MDA含量顯著降低[39]。在本實驗中, 隨著飼料中輔酶Q10添加量增加, 各輔酶Q10組吉富羅非魚幼魚血清和肝臟CAT和GSHPx活性均顯著升高。當添加量為80或120 mg/kg時,吉富羅非魚幼魚SOD和GST活性均顯著高于對照組, 且MDA含量顯著下降。說明添加輔酶Q10可顯著提高吉富羅非魚幼魚的抗氧化能力。

3.4 飼料中輔酶Q10水平對吉富羅非魚幼魚肝臟和腸道組織學的影響

肝臟是魚類最重要的代謝器官, 具有消化、解毒和代謝等多種功能。肝臟的結(jié)構(gòu)狀態(tài)可以直接反映魚類肝臟的健康狀況[57]。泛醇是輔酶Q10的雙電子還原產(chǎn)物, 在線粒體中起抗氧化劑的作用。大鼠和狗服用200 mg/kg及以上泛醇, 肝細胞有細小空泡形成，但研究認為該變化是對輔酶Q10吸收的適應性反應, 不會引起細胞毒性變化[58]。大鼠口服2000 mg/kg輔酶Q10 28d后, 肝臟重量和組織學結(jié)構(gòu)與對照組無顯著差異變化[8]。小鼠每日口服0.56、1.13和2.25 g/kg的輔酶Q10, 肝臟谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性不受輔酶Q10添加水平的影響, 輔酶Q10不會造成肝損傷[7]。非洲鯰攝食含40 mg/kg輔酶Q10的日糧后, 肝組織切片均顯示出正常的肝臟結(jié)構(gòu), 并且肝臟的AST、ALT和堿性磷酸酶(ALP)活性顯著降低[39]。本研究結(jié)果顯示, 各輔酶Q10組吉富羅非魚幼魚肝組織結(jié)構(gòu)與對照組對比無顯著變化, 細胞間界限分明, 排列緊密。結(jié)合肝臟抗氧化酶活性升高和丙二醛(MDA)含量的減少, 說明輔酶Q10可減少肝臟的氧化損傷, 有助于肝臟組織的健康。

腸道是魚類消化與吸收營養(yǎng)的主要器官, 由漿膜層、肌層、黏膜下層和黏膜層組成[59]。腸絨毛是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要部位, 其形態(tài)結(jié)構(gòu)直接反映魚類消化吸收能力。飼料添加劑的使用能夠促進魚類腸道發(fā)育和維持腸道健康。在本實驗中,飼料中添加120 mg/kg輔酶Q10顯著增加吉富羅非魚幼魚腸道絨毛長度和絨毛密度。腸絨毛表面積的增加, 更有利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。飼料中補充其他添加劑也有類似效果, 例如在歐洲海鱸(Dicentrarchus labrax)飼料中添加0.2%微囊丁酸鈉后, 顯著提高了絨毛長度和絨毛密度, 有利于腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整和穩(wěn)固[60]。飼料中添加肉桂醛能顯著提高鰻鱺(Anguilla japonica)腸道的絨毛數(shù)量和長度, 從結(jié)構(gòu)上改善了腸道的消化與吸收功能[61]。飼料中添加丁酸鈉顯著提高了黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)前腸和后腸的絨毛長度, 促進了腸道發(fā)育和維持腸道健康[62]。腸道的蠕動依靠腸道肌肉的收縮作用,而肌層的厚度能一定程度促進腸道蠕動, 有利于腸道內(nèi)物質(zhì)運輸[63]。本實驗結(jié)果顯示, 120 mg/kg輔酶Q10組吉富羅非魚幼魚腸道肌層厚度顯著增加,可能提高了其對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收效率。類似的研究顯示, 1500 mg/kg的枸杞多糖能有效提高尼羅羅非魚前腸的肌層厚度, 促進食物在下游消化道的消化吸收[64]。結(jié)合本研究干物質(zhì)消化率的升高,說明輔酶Q10對吉富羅非魚幼魚腸道消化和吸收能力可能有一定程度的改善, 且添加量為120 mg/kg時具有明顯的效果。

3.5 飼料中輔酶Q10水平對吉富羅非魚幼魚肝臟相關(guān)基因表達的影響

40 mg/kg輔酶Q10顯著增加了大鼠線粒體錳超氧化物歧化酶(MnSOD)基因的表達, 且肝臟SOD、CAT和GSH-Px酶活性顯著升高[65]。飼料中添加40 mg/kg輔酶Q10, 使肉雞肝臟CAT基因被高度表達[15]。白細胞介素(Interleukin,il)是一種促炎細胞因子, 在介導T淋巴細胞和B細胞的活化、增殖和分化過程中有重要作用[66]。輔酶Q10能抑制il-1、il-6等多種促炎細胞因子的表達[67,68]。NF-κB通路可以被活性氧激活, 而輔酶Q10可以通過抑制NF-κB從而下調(diào)促炎細胞因子的表達[69,70]。大鼠涂抹輔酶Q10藥膏后, 與炎癥有關(guān)的HO-1、il-1β、tnf-α和NF-κB的基因表達顯著下調(diào)[71]。用輔酶Q10治療氧化損傷的大鼠, 大鼠肝臟中促炎細胞因子il-6下降至正常水平[72]。免疫球蛋白M(igm)在特異性免疫中起著識別和清除潛在病原體的重要作用, 其含量水平可反映魚類免疫功能強弱[73]。在本實驗中, 120 mg/kg輔酶Q10上調(diào)了sod、cat、gsh-px、gst和igm基因的表達, 而不同水平輔酶Q10組均下調(diào)了il-8和il-1β基因的表達。這說明當添加量為120 mg/kg時, 機體抗氧化防御系統(tǒng)明顯增強。輔酶Q10還能作用于機體免疫系統(tǒng), 減少炎癥因子的表達量, 提高機體的免疫力[12]。

3.6 飼料中輔酶Q10水平對吉富羅非魚幼魚抗病力的影響

輔酶Q10的添加可刺激體內(nèi)抗體水平的提高,增加巨噬細胞和T淋巴細胞的數(shù)量和功能, 從而提高機體免疫水平[14]。輔酶Q10減輕了氟化物污染引起的貧血和組織學變化, 提高了非洲鯰對溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)的抗病力[39]。奶薊草和輔酶 Q10的聯(lián)用可調(diào)節(jié)氧化應激反應和腦鎳含量來減輕氯化鎳引起的尼羅羅非魚神經(jīng)行為障礙[74]。輔酶Q10減少了大鼠神經(jīng)缺陷和組織損傷, 增強了抗病力[75]。嗜水氣單胞菌我國流行最為廣泛的一種典型人-畜-水生動物共患的病原菌, 廣泛分布于淡水、海洋和河口等水生環(huán)境[76]。魚類感染嗜水氣單胞菌后易出現(xiàn)出血病, 主要表現(xiàn)為頭部、腹部等部位充血, 漂浮于水面等現(xiàn)象, 致死率極高[77]。在本實驗中, 80和120 mg/kg輔酶Q10組吉富羅非魚幼魚嗜水氣單胞菌侵染后的累計存活率顯著高于對照組。輔酶Q10充分發(fā)揮了免疫防御作用, 可能與其提升了機體抗氧化酶活性和抗氧化相關(guān)基因的表達有關(guān), 進而提高了魚體抗病力。

4 結(jié)論

飼料中添加輔酶Q10≤120 mg/kg對吉富羅非魚幼魚存活、生長、飼料利用及組織結(jié)構(gòu)均無不良影響。飼喂120 mg/kg輔酶Q10能顯著提高吉富羅非魚幼魚的消化率、抗氧化能力、肝臟抗氧化相關(guān)基因的表達和對嗜水氣單胞菌的抗病力, 降低血脂和去內(nèi)臟全魚的脂肪含量。