李睿琦 張新星 高志嶺 廖文華 劉春敬

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,河北省農(nóng)田生態(tài)環(huán)境重點實驗室,河北 保定 071000)

反硝化作用是推動自然界中氮素循環(huán)的重要環(huán)節(jié),既可用于治理水體污染[1],減少環(huán)境中的硝酸鹽累積,又可能造成農(nóng)田氮肥的流失[2]。反硝化作用產(chǎn)生的N2O是一種重要的溫室氣體,對臭氧層有破壞作用[3-4],其作用機(jī)制及所涉及酶和微生物的研究越來越引起廣泛重視。隨著對根系分泌物-微生物-土壤氮循環(huán)研究的深入了解,發(fā)現(xiàn)某些植物根系分泌物或代謝產(chǎn)物具有抑制土壤硝化及反硝化過程的作用[5-6]?；诖?研究者將從自然界中植物根系分泌的或從植物組織中提取的對硝化或反硝化作用有特定抑制效果的化合物命名為“生物硝化抑制劑(BNI)”和“生物反硝化抑制劑(BDI)”。

生物抑制劑的研究起初大多集中在土壤硝化過程方面[7-9],少數(shù)早期研究者雖然提出一些植物具有較低的反硝化能力[10],通常認(rèn)為是非生物因素導(dǎo)致這種結(jié)果[11]。近年來,隨著一些學(xué)者對原產(chǎn)于東亞的入侵植物Fallopiaspp.的進(jìn)一步研究,本應(yīng)非常適合在低肥力土壤中生長的植物,并能大幅度提高土壤肥力、增加氮累積量的富集植物[12-15],其入侵土壤的反硝化潛勢卻出現(xiàn)降低的趨勢,但影響反硝化的非生物因素卻沒有發(fā)生變化[16]。研究人員從Fallopiaspp.根系提取物中發(fā)現(xiàn)B型原花青素(PC)可以通過誘導(dǎo)酶的構(gòu)象變化,特異性地抑制與膜結(jié)合的硝酸還原酶活性,并首次提出了BDI的概念[17-21]。PC的應(yīng)用雖然可以提高氮素利用率、降低環(huán)境效應(yīng),但由于其價格較高,并不適用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

苯甲酸廣泛存在于植物組織及其根際分泌物中,研究發(fā)現(xiàn)牧場中牛的尿斑成分會影響溫室氣體N2O的排放,3.9 mmol/L的馬尿酸可明顯抑制土壤N2O的排放,并推測其原因是水解產(chǎn)物苯甲酸對反硝化過程的抑制導(dǎo)致的[22-24],但尚未得到證實。因此,本研究通過選取來源于土壤中性能不同的反硝化細(xì)菌為研究對象,探索土壤反硝化細(xì)菌對苯甲酸濃度變化的響應(yīng),為深入理解植物與土壤微生物交互作用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌種：銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(ATCC13985),脫氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)(ATCC19367)。

供試藥品：苯甲酸(純度99.5%)。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,氯化鈉10 g/L。

LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加入15 g/L瓊脂粉。

DM培養(yǎng)基：硝酸鉀0.72 g/L,磷酸二氫鉀1.0 g/L,七水合硫酸鎂0.2 g/L,六水合丁二酸鈉2.8 g/L,pH=7.0。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 不同濃度苯甲酸對反硝化細(xì)菌氮素轉(zhuǎn)化的影響

(1) 設(shè)置4個苯甲酸摩爾濃度,分別為1、2、3、4 mmol/L,以不加苯甲酸為空白對照,編號分別為B1、B2、B3、B4、CK,所有處理重復(fù)3次。

(2) 菌株的培養(yǎng)：試驗選取了土壤中常見的兩種不同屬的反硝化細(xì)菌：脫氮副球菌和缺乏N2O還原酶活性的反硝化細(xì)菌——銅綠假單胞菌。試驗期間,首先對兩種細(xì)菌進(jìn)行活化,將2 mL含有20%(體積分?jǐn)?shù))甘油的銅綠假單胞菌和脫氮副球菌菌液接種至25 mL LB液體培養(yǎng)基中,在搖床上(30 ℃、160 r/min)培養(yǎng)24 h,在其對數(shù)生長期時轉(zhuǎn)接至LB固體培養(yǎng)基上,30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h;在對數(shù)生長期時挑取單菌落接種至100 mL LB液體培養(yǎng)基中,恒溫振蕩24 h,將100 mL菌液離心后(3 500 r/min,10 min),將菌體用0.9%(體積分?jǐn)?shù))的生理鹽水沖洗3次,重新懸浮于200 mL 0.9%的生理鹽水中,放入搖床培養(yǎng)2 h后,將菌液離心(3 500 r/min,10 min),懸浮于DM培養(yǎng)基中,并調(diào)整培養(yǎng)液在波長600 nm處的吸光值(OD600)等于0.2待用。

1.2.2 單一碳源苯甲酸對反硝化細(xì)菌的影響

(1) 設(shè)置4個苯甲酸摩爾濃度,分別為1、2、3、4 mmol/L。

(2) 菌株的培養(yǎng)：同1.2.1中的步驟,其中將DM培養(yǎng)基中的碳源六水合丁二酸鈉去除。

(3) 將不同濃度的苯甲酸與菌液等體積加入?yún)捬跗恐?每隔12 h抽取2 mL氣體樣品用于N2O含量的測定。測定72 h后的菌液中苯甲酸的含量。

1.3 測定方法及計算

采用SPSS 20.0和Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行作圖和統(tǒng)計分析,采用單因素方差分析(LSD)、鄧肯多重比較對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一碳源苯甲酸對反硝化細(xì)菌的影響

為了驗證銅綠假單胞菌和脫氮副球菌是否具有轉(zhuǎn)化和利用苯甲酸作為碳源的能力,設(shè)置了用苯甲酸作為單一碳源的試驗,結(jié)果見圖1。由圖1可見,與初始時刻菌液中苯甲酸濃度相比,72 h時兩個反硝化細(xì)菌的菌液中苯甲酸含量均無顯著變化,兩種細(xì)菌均沒有分解苯甲酸。試驗過程中OD600無顯著提高,72 h內(nèi)無N2O明顯排放,表明苯甲酸不能被兩種細(xì)菌所分解,即在后續(xù)細(xì)菌培養(yǎng)試驗中苯甲酸不會作為碳源被細(xì)菌利用。

2.2 不同濃度苯甲酸對反硝化細(xì)菌OD600的影響

如圖2(a)所示,CK、B1、B2、B3處理的銅綠假單胞菌OD600在6 h之后開始不同程度的增長,其中CK處理的銅綠假單胞菌數(shù)量增長得最為迅速,在18 h時已經(jīng)到達(dá)峰值;B1處理下的銅綠假單胞菌在試驗期間一直處于上升趨勢,在72 h時到達(dá)峰值,且與CK處理的峰值相比差異不顯著;B2、B3處理下銅綠假單胞菌的OD600增長緩慢,在72 h到達(dá)峰值,而B4處理下的銅綠假單胞菌OD600無明顯增長。

如圖2(b)所示,CK、B1、B2處理的脫氮副球菌OD600在前18 h內(nèi)迅速增長,之后趨于平穩(wěn),分別達(dá)到最大值為0.326、0.329、0.300,B1、B2處理的OD600最大值與CK相比并無顯著差異,表明1、2 mmol/L的苯甲酸對脫氮副球菌生長并無明顯抑制效果,僅在前18 h抑制其生長速率;B3處理的OD600在30 h時開始上升,42 h時到達(dá)峰值0.208,在試驗結(jié)束時OD600降至0.147,顯著低于CK;B4處理的OD600一直保持初始值,并無明顯變化,說明高濃度的苯甲酸可有效抑制脫氮副球菌的生長,且濃度越高抑制效果越好。

2.3 不同濃度苯甲酸對反硝化細(xì)菌氮素轉(zhuǎn)化的影響

2.3.1 N2O動態(tài)變化

如圖3(a)所示,CK、B1、B2、B3處理下的N2O質(zhì)量濃度在前50 h均有不同程度上升,之后趨于穩(wěn)定,于72 h時達(dá)到最高值,分別為2 259.27、3 667.47、2 901.53、1 588.06 mg/m3。B4處理在前50 h未檢測到N2O的排放,在72 h時N2O質(zhì)量濃度達(dá)到最高值僅為166.69 mg/m3。B1、B2與CK相比,兩者均顯著促進(jìn)了反硝化過程中N2O的排放,72 h時N2O累積排放質(zhì)量濃度較CK分別增加了62.3%、28.4%;與之相反,B3、B4則均顯著抑制了反硝化過程中N2O的排放,72 h內(nèi)N2O累積排放質(zhì)量濃度較CK分別降低了29.7%、92.6%,其中B4幾乎完全抑制了銅綠假單胞菌的反硝化過程。由此可知,苯甲酸對銅綠假單胞菌反硝化作用表現(xiàn)出低濃度促進(jìn)、高濃度抑制N2O產(chǎn)生的特征。

如圖3(b)所示,CK處理下的N2O質(zhì)量濃度在前42 h內(nèi)一直呈上升趨勢,之后趨于穩(wěn)定。B1、B2處理下的N2O質(zhì)量濃度在72 h內(nèi)亦呈上升趨勢,但顯著低于CK處理,B3、B4處理則未檢測到顯著的N2O排放。由此可知,苯甲酸可顯著抑制脫氮副球菌反硝化作用產(chǎn)生的N2O排放,且影響強度隨著濃度增加而逐漸增強。

圖1 72 h菌液中苯甲酸摩爾濃度Fig.1 The molar concentration of benzoic acid in the bacteria liquid at 72 h

圖2 不同濃度苯甲酸對細(xì)菌OD600的影響Fig.2 Effects of different concentrations of benzoic acid on bacteria OD600

圖4 不同濃度苯甲酸對的影響Fig.4 Effects of different concentrations of benzoic acid on

圖5 不同濃度苯甲酸對的影響Fig.5 Effects of different concentrations of benzoic acid on

2.4 不同濃度苯甲酸下反硝化細(xì)菌pH的動態(tài)變化

由圖6可知,銅綠假單胞菌和脫氮副球菌菌液的初始pH均隨著苯甲酸濃度的升高而逐漸降低,從6.5左右下降至5.5左右。由圖6(a)還可以發(fā)現(xiàn),盡管不同處理的銅綠假單胞菌菌液pH均隨著時間逐漸升高,但B2、B3和B4處理的pH遠(yuǎn)低于CK和B1處理,尤其是B4處理的pH在試驗期間變化甚微,始終保持在5.5左右。根據(jù)圖6(b),B1、B2處理的pH與CK的動態(tài)特征基本一致,而B3和B4處理的pH遠(yuǎn)低于上述3個處理。由此可知,添加苯甲酸引起的菌液pH的變化可能也是影響反硝化過程的因素之一。

2.5 不同濃度苯甲酸對反硝化細(xì)菌關(guān)鍵酶活性的影響

本研究測定了72 h時不同處理的NR和NiR,以進(jìn)一步分析添加苯甲酸對兩種菌液反硝化過程的影響。由圖7可知,銅綠假單胞菌菌液CK的NR要顯著高于脫氮副球菌菌液CK,其NiR活性也顯著低于脫氮副球菌菌液,表明前者的反硝化效率可能要高于后者。

圖6 不同濃度苯甲酸對菌液pH的影響Fig.6 Effect of different concentration benzoic acid on pH of bacterial solution

注：不同小寫字母間表示差異顯著,相同小寫字母間表示差異不顯著。圖7 72 h時不同濃度苯甲酸對細(xì)菌NR、NiR的影響Fig.7 Effects of different concentrations of benzoic acid on bacterial NR and NiR at 72 h

3 討 論

研究表明,土壤中能降解苯甲酸的反硝化微生物種類較多[26],外源可溶性碳的添加可能間接增強土壤微生物反硝化作用,從而促進(jìn)土壤N2O排放[27-30],而本試驗證實選取的兩種反硝化細(xì)菌在厭氧條件下均不能分解苯甲酸,因此在試驗中苯甲酸不會作為碳源來干擾細(xì)菌的反硝化過程。

本研究中,銅綠假單胞菌和脫氮副球菌的OD600均隨著苯甲酸的增加、菌液pH下降而下降。這與前人研究結(jié)果一致,即苯甲酸抑菌效果與pH密切相關(guān),這是由于苯甲酸的抑菌作用主要是以酸化細(xì)胞體內(nèi)儲堿的方式使細(xì)胞的呼吸酶系失去活性[31-32]。

綜上,銅綠假單胞菌和脫氮副球菌反硝化過程不僅對苯甲酸添加量的響應(yīng)存在明顯差異,且其主要受制環(huán)節(jié)上也存在一定程度的不同,因此還需要開展更多的研究,進(jìn)一步探討苯甲酸對其他類型反硝化細(xì)菌的氮轉(zhuǎn)化過程的影響,摸索其抑制反硝化過程的主要條件,為苯甲酸的田間應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

4 結(jié) 論

(1) 不同苯甲酸濃度均可抑制脫氮副球菌的N2O生成,但僅高濃度苯甲酸抑制了銅綠假單胞菌的N2O生成。

(2) 苯甲酸對銅綠假單胞菌的生長和反硝化過程影響具有低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的特征,而對脫氮副球菌的生長和反硝化過程均為抑制作用。