李雙鵬，劉陸濱，范采蕭

(佳木斯大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

中藥提取出一種苯乙醇類化合物，將其命名為紅景天苷，與藥物作用密切相關(guān)[1]。MMP-2 的表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移及侵襲程度密切相關(guān)，是腫瘤惡性進(jìn)展的標(biāo)志[2，3]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)紅景天苷在肺纖維化過程中使MMP-2及TIMP1mRNA的表達(dá)和蛋白的合成受到抑制，紅景天苷能夠抑制MMP-2、TIMP-2mRNA和蛋白的表達(dá)，恢復(fù)二者的平衡從而延緩甚至抑制纖維化的進(jìn)程，保護(hù)中毒大鼠的肺組織[4]。在臨床實驗研究中已經(jīng)證實適宜濃度的紅景天苷能夠抑制MMP-1的表達(dá)[5]，因此，提出關(guān)于紅景天苷能通過調(diào)節(jié)牙源性MMPs活性的表達(dá)從而抑制牙本質(zhì)膠原纖維降解和牙本質(zhì)脫礦假設(shè)，來探究紅景天苷對脫礦牙本質(zhì)的影響，這對防治牙齒齲壞有著重要的意義。同時也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)紅景天苷對人重組的MMPs有抑制作用。但紅景天苷是否對牙本質(zhì)中由于酸蝕活化的基質(zhì)金屬蛋白酶有抑制作用尚無報道。本研究旨在探討紅景天苷對牙本質(zhì)中活化MMPs的影響，擬為紅景天苷應(yīng)用于臨床提高黏接效果提供理論依據(jù)。報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

紅景天苷(98%)，0.2%氯己定，去離子水，新鮮無齲磨牙，MMP-2活性比色法定量檢測試劑盒，磷酸，耐水砂紙，36%乙酸，磷酸二氫鉀，慢速切割機(jī)，液氮罐，高速渦輪機(jī)，臺式離心機(jī)，酶標(biāo)儀，恒溫箱，激光共聚焦顯微鏡，試管，濾紙，羅丹明。

1.2 實驗溶液及樣品的制備

1.2.1實驗溶液的配置

配置紅景天苷溶液：用去離子水配置10mmol/L紅景天苷母液，放于4℃冰箱中儲存，避光備用。在實驗中，使用去離子水稀釋母液，配置濃度分別為10、20、60、100、200、400μmmol/L的酸性脫礦液：使用去離子水，將36%乙酸和磷酸二氫鉀混合成液體，其中乙酸的所含濃度為50μmmol/L，磷酸二氫鉀的所含濃度為1.5μmmol/L，酸性脫礦液的pH值為4.5。配置中性緩沖液：將去離子水、4-羥乙基哌嗪乙磺酸和磷酸二氫鉀混合配置成液體，其中4-羥乙基哌嗪乙磺酸所含濃度為20μmmol/L，磷酸二氫鉀的所含濃度為1.5μmmol/L，中性緩沖液的pH值為7.0。

1.2.2 牙本質(zhì)片的制備

選取離體牙10顆，皆來自2020-09～2020-10佳木斯大學(xué)第二附屬醫(yī)院就診患者。所有標(biāo)本都是沒有齲壞的磨牙，患者因智齒周炎而需要拔除。獲取標(biāo)本后仔細(xì)清理，將所附著的牙周軟組織去除，同時要清理色素及牙結(jié)石，完成后清洗干凈備用。準(zhǔn)備冰箱，設(shè)置為-80℃，將制備好的標(biāo)本置于其中保存。將新鮮離體牙的牙根部用面團(tuán)期的自凝樹脂包埋，不包埋牙冠部分，造成與慢速切割機(jī)卡槽一樣的樣本，4℃生理鹽水事先準(zhǔn)備，將處理好的離體牙立即置于其中，進(jìn)行冷卻處理，然后放入慢速切割機(jī)的卡槽中，開啟慢速切割機(jī)，對牙齒進(jìn)行切割。方向與牙體長軸垂直，整個過程必須要在流水持續(xù)冷卻下完成，最終形成30片(200±20)μm牙本質(zhì)薄片。啟動高速旋輪機(jī)，磨除牙釉質(zhì)及淺層牙本質(zhì)，該過程要沿著釉牙本質(zhì)界面進(jìn)行。生理鹽水事先準(zhǔn)備完成，將磨好的切片置于其中， -20℃冷凍備用。

1.2.3 實驗分組

實驗組：紅景天苷，濃度梯度分別為10、20、60、100、200、400μmmol/L；陽性對照組：0.2%氯己定；陰性對照組：去離子水。

1.3 實驗方法

1.3.1 基質(zhì)金屬蛋白酶的提取

將制備的(200±20)μm厚的30個牙本質(zhì)片放在凍存管中，冷凍在液氮罐里6h，將冷凍的牙本質(zhì)片取出后用研缽快速研磨呈粉末狀。從粉末中用電子秤稱量出重量為1g的牙本質(zhì)粉，并將其放入到試管中。將5mL的10%的磷酸溶液加入到試管中，并在4℃冰箱冷藏的環(huán)境中脫礦6h。4℃臺式離心機(jī)準(zhǔn)備完成，將上述樣品置于其中進(jìn)行離心，3000r/min,2min，分層后去上清。準(zhǔn)備100mmol/L Tris-Hcl液體，將其加入到上述試管當(dāng)中，共需要5mL，再次進(jìn)行離心處理，時間與上述相同，去上清。該過程反復(fù)進(jìn)行，共需要3次，完成后洗滌。準(zhǔn)備十二烷基硫酸鈉，將其加入到試管當(dāng)中，共需要5mL，進(jìn)行離心處理，4℃12000r/min,20min，去上清，所余為脫礦牙本質(zhì)中的MMPs。

1.3.2 基質(zhì)金屬蛋白酶抑制率

對提取物進(jìn)行測試，確定其中的酶活性。依體液MMP-2活性比色法定量檢測試劑盒指示，測定提取液中的酶活性大小。從96孔板中選取5個實驗待測孔，并標(biāo)記好分組，移取84μL緩沖液，10μL反應(yīng)液和1μL底物液到相對應(yīng)的5個實驗孔中。恒溫箱準(zhǔn)備完成，溫度設(shè)置為37℃，將孔板置于其中進(jìn)行孵育，共用時3min，再分別加入30μL待測樣品，在405mm波長下，用酶標(biāo)儀中進(jìn)行實驗，同時計時，選取不同時間點的讀數(shù)，分別為第0、15min，記錄最終的結(jié)果。在此基礎(chǔ)上計算提取物酶活性，整個過程要按照試劑盒說明書完成。

各實驗分組酶活性檢測：準(zhǔn)備緩沖液，將其移入到96孔板當(dāng)中，共需要84μL，該過程嚴(yán)格按照檢測試劑盒說明書完成，同時還需要加入反應(yīng)液，共10μL，另外再加1μL底物液，再取MMPs提取液，加入30μL，上述所有物質(zhì)都加入到陰性對照組當(dāng)中。另外在陽性對照組和實驗組中加入84μL緩沖液，其余物質(zhì)也與之前相同，然后分別移取10μL去離子水，10μL的0.2%氯己定，以及不同濃度紅景天苷各10μL，將其加入到實驗組，陰性對照組，陽性對照組中，每組實驗反復(fù)重復(fù)5次，立即放入到酶標(biāo)儀中讀數(shù)，酶標(biāo)儀波長為405nm,然后將96孔板放進(jìn)37℃恒溫箱里，15min后將96孔板放入酶標(biāo)儀中測定吸光度讀數(shù)。記錄第0、15min結(jié)果，按照試劑盒公式[(完全活性讀數(shù)-空背景對照讀數(shù))-(抑制劑樣品活性讀數(shù)-樣本背景讀數(shù))]/(完全活性讀數(shù)-空背景對照讀數(shù))=實際抑制百分率，進(jìn)行計算提取物酶活性抑制率。

1.3.3 牙本質(zhì)試件脫礦程度

將已處理完成的15個牙本質(zhì)塊備用，將其等分為3組。去離子水，紅景天苷，氯己定每組分別5個樣本。各組溶液準(zhǔn)備完成，將分組后的試件放入其中，進(jìn)行pH循環(huán)處理。不同組的處理液有所不同，可將相應(yīng)的牙本質(zhì)塊放置其中處置10min，(陰性對照組：去離子水組；陽性對照組:0.2%氯己定；實驗組：紅景天苷400μmol/L)中處置10min，取出后進(jìn)行沖洗，需要使用去離子水，共用時1min，再用濾潮紙吸干牙本質(zhì)試件上的水分，然后將其放入裝有5mL酸性脫礦液的試管中進(jìn)行脫礦1h，然后用去離子水沖洗1min，再用濾潮紙吸干牙本質(zhì)試件上的水分，將其放入裝有5mL中性緩沖液的試管中，緩沖液的pH為7.0，pH循環(huán)，一日二次，共10d。酸性脫礦液和中性緩沖液需要放至于恒溫?fù)u床中，37℃條件下慢速進(jìn)行，不做pH循環(huán)時，可準(zhǔn)備中性緩沖液，將上述試件置于其中，于37℃恒溫箱中放置，中性緩沖液和處理液需要定時更換，一般間隔時間不超過24h，需要遵循現(xiàn)配現(xiàn)用的原則。使用激光共聚焦顯微鏡在529nm下觀察各個牙本質(zhì)試件的形狀和染色深度，計算出每組牙本質(zhì)試件的平均脫礦深度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 紅景天苷對基質(zhì)金屬蛋白酶活性的抑制率

見表1。

表1 各組樣品對基質(zhì)金屬蛋白酶酶活性抑制率

2.2 紅景天苷對脫礦牙本質(zhì)的影響

激光共聚焦顯微鏡3D圖像1.400μmol/L紅景天苷的染色寬度深度低于去離子水組，各組樣本脫礦深度見表2。紅景天苷脫礦深度與陰性對照組對比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但與陽性對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組樣本脫礦深度

3 討論

齲病是一種常見的牙齒疾病，多種因素可以導(dǎo)致其發(fā)生，細(xì)菌相對常見，它可以對底物進(jìn)行分解，導(dǎo)致酸性物質(zhì)生成，從而使局部pH值下降，使得牙本質(zhì)齲壞部位病變進(jìn)一步加重。由于局部呈現(xiàn)酸性，可以溶解羥基磷灰石，導(dǎo)致膠原纖維暴露。當(dāng)齲壞部位的pH處于2.5～3時，MMPs前體發(fā)生變化，由失活狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，唾液本身可以起到一定的稀釋作用，因此可以調(diào)節(jié)局部的酸堿度變化，使其由酸性變成中性，于是激活的基質(zhì)金屬蛋白酶就水解了牙本質(zhì)有機(jī)質(zhì)。實驗中所用的pH循環(huán)模型已被眾多實驗[6～8]所證實。本研究需要確定不同濃度紅景天苷對MMP-2的抑制作用，整個過程需要使用酶標(biāo)儀完成，結(jié)果顯示400μmol/L時結(jié)果與陽性對照組相當(dāng)，因此將該濃度紅景天苷組作為實驗組，確定其耐脫礦能力， 0.2%氯己定為陽性對照組，陰性對照組是去離子水組。使用羅丹明B染料染色后，酸性脫礦液使牙本質(zhì)脫礦，羅丹明B依靠其強(qiáng)大的滲透能力，滲入各個孔隙中。這也說明了脫礦程度越深，染色條帶越寬。從染色條帶對比情況來看，顏色較淺的是紅景天干和陽性對照組，并且整體相對較窄，顏色較深的為陰性對照組，寬度相對較寬一些。提示400μmol/L紅景天苷對于牙本質(zhì)脫礦具有影響，可以有效抑制其過程。對各試件熒光強(qiáng)度進(jìn)行觀察，該過程需要使用激光共聚焦顯微鏡[9]，根據(jù)結(jié)果確定牙本質(zhì)脫礦程度，具有操作簡捷、反應(yīng)快等特點，掃描后可以得到清楚的三維圖像，能夠更直觀的了解牙本質(zhì)脫礦程度。從最終的脫礦程度對比情況來看，400μmol/L紅景天苷組相對較小，與陰性對照組有所差異，由此可見其能夠有效抑制牙本質(zhì)脫礦，使最終的深度有所變淺，寬度變窄。