李雪，李琢偉，李爽，姜欣彤，何思涵，5，劉俊梅，5*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林省農(nóng)研科技有限公司，吉林 長(zhǎng)春 130000；3.長(zhǎng)春職業(yè)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130033；4.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050；5.吉林省益爾生物有限公司，吉林 長(zhǎng)春 130022）

黑木耳（Auricularia auricula）是一類常見的食用真菌，屬擔(dān)子菌門、木耳科，是藥食同源體[1]。從營(yíng)養(yǎng)學(xué)角度分析，黑木耳富含多糖、蛋白質(zhì)和微量元素，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高[2-4]。黑木耳多糖（Auricularia auricula polysaccharide，AAP）作為一種重要的天然生物活性物質(zhì)，組成成分多樣、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有多種生物保護(hù)活性[5]。在抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抑菌、防輻射、抗病毒等方面有明顯作用[6-10]。AAP作為一種天然多糖，存在溶解性差、分子量大、生物活性較弱等特點(diǎn)。通過對(duì)多糖進(jìn)行磷酸化改性，在多糖殘基中引入磷酸基團(tuán)，可以有效地改善其生物活性[11-14]。但磷酸化改性后的多糖被人體吸收利用前，仍面臨被氧化問題，又因目前，人們集中于研究磷酸化黑木耳多糖的結(jié)構(gòu)和生物活性，對(duì)于如何提高磷酸化黑木耳多糖的穩(wěn)定性和利用效能的相關(guān)研究鮮見報(bào)道。脂質(zhì)體的成分與生物細(xì)胞膜成分極其相似，具有良好的生物相容性，對(duì)機(jī)體的刺激較低，脂質(zhì)體的靶向性和安全性可以達(dá)到準(zhǔn)確低毒的效果，更易被人體吸收[15-16]。脂質(zhì)體已經(jīng)成為很多生物醫(yī)藥載體的首選。目前，脂質(zhì)體在香菇、枸杞、黃芪多糖方面均有所應(yīng)用，能夠起到良好的緩釋和保護(hù)作用[17-18]。因此，本研究通過磷酸鹽化學(xué)修飾法，對(duì)AAP進(jìn)行磷酸化改性，以改善其生物活性，并制備磷酸化多糖脂質(zhì)體，探究磷酸化多糖和脂質(zhì)體的體外抗氧化能力，進(jìn)一步提高其穩(wěn)定性，為解決磷酸化多糖生物利用效能提供可行的理論依據(jù)。同時(shí)，磷酸化黑木耳多糖脂質(zhì)體可以提高磷酸化黑木耳多糖的生物活性和人體對(duì)磷酸化黑木耳多糖的利用效能，有效提高磷酸化黑木耳多糖的貯藏穩(wěn)定性，在食品、藥品和化妝品領(lǐng)域均具有廣闊的應(yīng)用前景。因此，本研究旨為提高磷酸化黑木耳多糖的穩(wěn)定性和生物利用效能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳子實(shí)體Aas1502：吉林省華鑫菌業(yè)科技有限責(zé)任公司；纖維素酶（食品級(jí)，5萬U/g）：上海索萊寶生物科技有限公司；硅片[厚度（650±10）μm，尺寸 5 mm×5 mm]：浙江立晶硅材料有限公司；無水乙醇、丙酮、氯仿、正丁醇、無水葡萄糖、苯酚、硫酸、硫酸鈉、磷酸二氫鉀、抗壞血酸、鉬酸銨、硝酸、過氧化氫、鹽酸、過硫酸鉀、大豆卵磷脂、氯化鈉、三氟乙酸、吡啶、溴化鉀、磷鎢酸（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三聚磷酸鈉、三偏磷酸鈉、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH）、2，2'-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽[2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]、膽固醇、吐溫 80、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（0.01 mol/L，pH7.2～7.4）、曲拉通 X-100（10%）：上海源葉生物科技有限公司；葡聚糖凝膠G-50：上海博美生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超微粉碎機(jī)（FW-100）：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；超聲波清洗器（KS-400VDB）：昆山潔力美超聲儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋（HW·SY11-K）：北京長(zhǎng)風(fēng)有限公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（3K15）：德國(guó)Sigma公司；pH計(jì)（ST2100/E）：美國(guó)奧豪斯儀器有限公司；電子天平（AP224W）：日本島津有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52）：上海亞榮有限公司；凍干機(jī)（AIpha 1-4LSC basic）：德國(guó)馬丁克里斯特凍干機(jī)有限公司；掃描電子顯微鏡（EM-30 Plus）：韓國(guó)COXEM有限公司；酶標(biāo)儀（PerkinElmer VICTOR Nivo）：美國(guó) PerkinElmer公司；透射電鏡（H-600）：株式會(huì)社日立制作所；激光粒度分析儀（Mastersizer-2000）：英國(guó)馬爾文儀器有限公司；電位分析儀（BeNano 180 Zeta）：丹東百特儀器有限公司；傅里葉紅外光譜儀（Great 10）：中科瑞捷（天津）科技有限公司；真空干燥箱（DZF-6034）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 AAP的提取

采用超聲輔助纖維素酶法提取AAP。將黑木耳子實(shí)體粉碎至100目，按照50∶1（mL/g）的水料比將黑木耳粉與水混合，440 W超聲處理20 min。加入1.5%的纖維素酶，在pH4.8、50℃的條件下酶解180 min，將其置于沸水中水浴5 min，4 800 r/min離心20 min，濃縮上清液。4℃的條件下用3倍體積95%無水乙醇醇沉24 h，收集沉淀，凍干[19]。Sevage 法脫蛋白，收集水樣，再加入Sevage試劑（氯仿∶正丁醇=5∶1，體積比），重復(fù)3次。透析48 h，濃縮、凍干得AAP[20-21]。

1.3.2 AAP的磷酸化

參照鄭常領(lǐng)等[5]的方法，略作改進(jìn)，三聚磷酸鈉與三偏磷酸鈉質(zhì)量比為4∶3，與水混勻配制一定濃度的磷酸化試劑。在磷酸化試劑中加入AAP 1 g，硫酸鈉5 g，攪拌混勻，在pH值為8.8、溫度為94℃的條件下反應(yīng)5 h。醇沉24 h，凍干獲得磷酸化黑木耳多糖（phosphorylated Auricularia auricula polysaccharide，P-AAP）。

1.3.3 磷酸化修飾前后AAP的結(jié)構(gòu)分析

1.3.3.1 磷酸化修飾前后AAP掃描電鏡觀察

將AAP和P-AAP的粉末均勻涂在硅晶片上后噴金，使用電子顯微鏡進(jìn)行掃描，并在2 000×、5 000×倍數(shù)拍照[22]。

1.3.3.2 磷酸化修飾前后AAP的傅里葉紅外光譜分析

將多糖粉末和溴化鉀按質(zhì)量比1∶100碾碎、混勻，壓片完成后放入傅里葉紅外光譜儀在4 000 cm-1～400 cm-1處進(jìn)行紅外光譜掃描，掃描次數(shù)32次，分辨率4 cm-1[23]。

1.3.3.3 磷酸化修飾前后AAP的單糖組成分析

取AAP和P-AAP 10 mg分別與1 mL 4 mol/L三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）在 110℃水解 3 h，水解后于70℃真空干燥箱中干燥；將干燥后樣本與1 mL吡啶混合，用1 mL硅烷化試劑混勻溶解。70℃真空干燥箱中干燥，降至25℃，開始檢測(cè)。氣相色譜檢測(cè)程序：HP-5型石英毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；恒壓模式，0.14 MPa；程序升溫：50 ℃，保持 3 min；然后以10℃/min升至280℃，保持5 min；分流比10∶1，進(jìn)樣口溫度280℃，氮?dú)鉃檩d氣；火焰離子化檢測(cè)器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）的溫度 300℃，氮?dú)?、氫氣、空氣流速分別為25、30 mL/min和400 mL/min；進(jìn)樣體積 1 μL[24-25]。

1.3.4 磷酸化黑木耳多糖脂質(zhì)體的制備及結(jié)構(gòu)表征

將大豆卵磷脂和膽固醇按質(zhì)量比7∶1溶于16 mL乙醇中，形成有機(jī)相。將大豆卵磷脂與P-AAP按照質(zhì)量比26∶1溶于磷酸鹽緩沖液中，形成水相。利用超聲波清洗器將有機(jī)相和水相在0℃冰水中完全混合30 min，形成穩(wěn)定的油包水型乳狀液。將乳狀液置于圓底燒瓶中，在60℃條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)成凝膠。注射10 mL PBS水合30 min，用超聲波清洗器均質(zhì)20 min，得磷酸化黑木耳多糖脂質(zhì)體（phosphorylated Auricularia auricula polysaccharide liposome，P-AAPL）。最后分別用0.45 μm和0.22 μm微孔濾膜對(duì)P-AAPL進(jìn)行滅菌，4℃條件下保存，用于后續(xù)試驗(yàn)[26-27]。

1.3.4.1 P-AAPL的微觀形態(tài)觀察

取少量的P-AAPL水溶液稀釋2倍，置于覆蓋有碳膜的專用銅網(wǎng)上，再加上2%磷鎢酸進(jìn)行染色，待其干燥后利用透射電鏡進(jìn)行觀察[28]。

1.3.4.2 P-AAPL包封率的測(cè)定

采用改進(jìn)的微柱離心法測(cè)定P-AAPL包封率。用0.9%NaCl溶液將葡聚糖凝膠G-50溶脹5 h。將注射器芯桿去除，在活塞口處連接0.22 μm微孔濾膜。將溶脹后的葡聚糖凝膠G-50填充到2.5 mL注射器內(nèi)，裝入50 mL離心管中，1 500 r/min離心5 min用于除去多余鹽溶液。將400 μL脂質(zhì)體乳狀液緩慢加入凝膠床頂部，以1 500 r/min離心5 min，游離P-AAP吸附于葡聚糖凝膠G-50凝膠柱上，P-AAPL流入離心管，收集離心液。加入400 μL 0.9%NaCl洗脫剩余游離多糖，收集離心液[29]。用20 μL體積分?jǐn)?shù)為10%的曲拉通X-100溶解100 μL的脂質(zhì)體溶液，蒸餾水補(bǔ)至0.2 mL。同時(shí)，建立空白對(duì)照組。參照食用菌中粗多糖含量的測(cè)定方法測(cè)定吸光度，包封率計(jì)算公式如下[30]。

包封率/%=（Ap/At）×100

式中：Ap為包封 P-AAP 濃度，mg/mL；At為包封和游離P-AAP總濃度，mg/mL。

1.3.4.3 P-AAPL粒徑、Zeta電位、多分散指數(shù)測(cè)定

取0.2 mL P-AAPL溶液分散于超純水中，至總體積約為2 mL。使用激光粒度分析儀測(cè)定粒徑。采用Zeta電位儀測(cè)定Zeta電位、多分散指數(shù)[31]。

1.3.4.4 P-AAPL傅里葉紅外光譜分析

將P-AAPL粉末和溴化鉀按1∶100的質(zhì)量比碾碎、混勻，壓片完成后放入傅里葉紅外光譜儀在4 000 cm-1～400 cm-1處進(jìn)行紅外光譜掃描，掃描次數(shù)32次，分辨率4 cm-1[24]。

1.3.5 脂質(zhì)體包封前后多糖的靜態(tài)流變學(xué)試驗(yàn)

流變儀的基板選用直徑40 mm的平行板轉(zhuǎn)子，進(jìn)行流變?cè)囼?yàn)。將制備的不同濃度P-AAP和P-AAPL樣品水溶液靜置5 min。在（25.0±0.1）℃、剪切速度為100.0 s-1～0.1 s-1的范圍內(nèi)，探究表觀黏度隨剪切速度的變化[32]。試驗(yàn)平行測(cè)定3次。

1.3.6 脂質(zhì)體包封前后多糖的體外抗氧化能力測(cè)定

參照GB/T 39100—2020《多肽抗氧化性測(cè)定DPPH和ABTS法》中DPPH法進(jìn)行測(cè)定[33]。配制50.0 μg/mL的DPPH-乙醇溶液備用。準(zhǔn)備3組試管，分別編號(hào)為A組、B組、C組。將180 μL的DPPH-乙醇溶液和不同濃度的20 μL抗壞血酸溶液添加到A組試管中，作為試驗(yàn)組；分別吸取20 μL不同濃度抗壞血酸溶液和無水乙醇溶液180 μL添加到C組試管中，作為對(duì)照組；吸取180 μL的DPPH溶液和蒸餾水20 μL添加到B組試管中，作為空白組。避光30 min后，測(cè)定3組在517 nm 處的吸光度，記為 Aa、Ab、Ac[33]。

樣品測(cè)定：用 AAP、P-AAP、AAPL 和 P-AAPL 樣品溶液代替抗壞血酸溶液，其他操作同上。

DPPH 自由基清除率/%=[1-（Aa-Ac）/Ab]×100

1.4 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)平行測(cè)定3次。利用Origin軟件分析處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 AAP和P-AAP的結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 AAP和P-AAP的掃描電鏡觀察

利用掃描電子顯微鏡對(duì)磷酸化修飾前后AAP的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，結(jié)果見圖1。

圖1 AAP和P-AAP的掃描電鏡Fig.1 Scanning electron microscopy images of AAP and P-AAP

由圖1A、圖1B可看出，AAP表面較光滑、平整，碎片較少，質(zhì)地較為緊密，結(jié)構(gòu)清晰。如圖1C、圖1D所示，P-AAP結(jié)構(gòu)呈碎片化，表面粗糙?？梢夾AP經(jīng)過磷酸化修飾后結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。進(jìn)一步驗(yàn)證了P-AAP制備成功。

2.1.2 AAP和P-AAP的傅里葉紅外光譜分析

紅外光譜法是研究糖類化合物結(jié)構(gòu)的一種有效方法，不同的紅外吸收頻率反映了其特征的化學(xué)鍵和功能基團(tuán)。通過對(duì)其紅外光譜的分析，可以確定糖類中含有的官能團(tuán)種類和部分結(jié)構(gòu)[34]。AAP和P-AAP在4 000 cm-1～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的紅外光譜見圖2。

圖2 AAP和P-AAP的紅外光譜Fig.2 Infrared spectra of AAP and P-AAP

由圖2可知，磷酸化前后多糖的峰型沒有明顯的變化，表明修飾后多糖的主要結(jié)構(gòu)未改變。磷酸化前AAP在3 495 cm-1處出現(xiàn)分子間氫鍵O-H吸收峰，在3 056 cm-1和1 413 cm-1出現(xiàn)C-H吸收峰，這是多糖的典型吸收峰[35]。兩個(gè)圖譜的主要差別在1 300 cm-1～900 cm-1處。P-AAP在1 220、1 128 cm-1處出現(xiàn)典型的P=O鍵吸收峰，在901 cm-1處出現(xiàn)P-O-C鍵的吸收峰，表明有磷酸基團(tuán)的接入[36]。

2.1.3 AAP和P-AAP的單糖組成分析

確定多糖的單糖組成是研究多糖結(jié)構(gòu)的重要基礎(chǔ)，多糖的生物活性與其單糖組成密不可分，因此采用氣相色譜法對(duì)AAP和P-AAP的單糖組成及含量進(jìn)行測(cè)定。磷酸化修飾前后AAP的單糖組成分析見圖3。

圖3 氣相色譜Fig.3 Gas chromatograms

以13種常見的單糖作為標(biāo)準(zhǔn)品（圖3A），對(duì)比分析單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的峰值保留時(shí)間，并用峰表面積比求出摩爾比（圖3B和圖3C）。如圖3B、圖3C所示，對(duì)比磷酸化修飾前后AAP的摩爾比發(fā)現(xiàn)AAP經(jīng)過磷酸化修飾后，單糖組成種類并未發(fā)生明顯變化，主要由半乳糖醛酸、葡萄糖、果糖、甘露糖和木糖組成，摩爾比由9.2∶8.3∶6.4∶1.6∶1.3變?yōu)?.5∶7.5∶2.6∶0.8∶0.8。AAP經(jīng)過磷酸化修飾后，單糖的峰面積有所降低，可能是由于多糖分子與磷酸基團(tuán)結(jié)合造成，并進(jìn)一步驗(yàn)證了P-AAP制備成功。

2.2 P-AAPL的結(jié)構(gòu)表征分析

2.2.1 P-AAPL的透射電鏡觀察

使用透射電子顯微鏡對(duì)脂質(zhì)體的表觀狀態(tài)進(jìn)行觀察，用于評(píng)價(jià)脂質(zhì)體的微觀形態(tài)特性。P-AAPL的透射電鏡圖見圖4。

圖4 P-AAPL的透射電鏡圖Fig.4 Transmission electron micrograph of P-AAPL

如圖4所示，P-AAPL微粒形態(tài)完整接近球形，分布均勻、形狀大小均一。

2.2.2 P-AAPL的穩(wěn)定性分析

脂質(zhì)體的穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)脂質(zhì)體質(zhì)量的重要因素，脂質(zhì)體的穩(wěn)定性通常由包封率、粒徑、Zeta電位和多分散指數(shù)決定。P-AAPL粒徑和電位分布見圖5。

圖5 P-AAPL粒徑和電位分布Fig.5 Particle size and potential distribution of P-AAPL

如圖5A所示，P-AAPL粒徑主要集中在50.75 nm～396.06 nm范圍內(nèi)，平均粒徑為（122.42±1.41）nm。研究表明，脂質(zhì)體粒徑越小，越容易穿過小腸上皮細(xì)胞，能更好地被吸收[22]。如圖5B所示，P-AAPL電位主要分布在-61.74mV～-32.04mV范圍內(nèi)，其絕對(duì)值大于30mV，表明P-AAPL穩(wěn)定性較好，能穩(wěn)定地分散于水相中，脂質(zhì)體的Zeta電位絕對(duì)值越大越能增加顆粒之間的排斥力，使脂質(zhì)體的穩(wěn)定性得到明顯改善。另外脂質(zhì)體的多分散指數(shù)也是評(píng)價(jià)脂質(zhì)體是否穩(wěn)定和分布均勻的一項(xiàng)重要指標(biāo)，數(shù)值越小，其分布均勻性也越高，PAAPL的多分散指數(shù)為0.298±0.035。包封率反映了芯材被壁材包封的程度，包封率越高，脂質(zhì)體對(duì)芯材的包封效果越好，磷酸化黑木耳多糖脂質(zhì)體包封率為83.26%。

2.2.3 P-AAPL的傅里葉變換紅外光譜分析

傅里葉變換紅外光譜見圖6。

圖6 傅里葉變換紅外光譜Fig.6 Fourier transform infrared spectrum

由圖 6 可知，P-AAPL 在波數(shù)為 3495、3056、1629、1 413、1 128、900 cm-1處與 P-AAP 的紅外光譜上的峰值較為接近。其中3 495 cm-1由糖分子內(nèi)或分子間氫鍵O-H伸縮振動(dòng)引起，3 056 cm-1和1 413 cm-1則是由C-H伸縮振動(dòng)引起的。1 629 cm-1為C=O伸縮振動(dòng)引起的吸收峰。1 128 cm-1和901 cm-1分別是P=O鍵和P-O-C鍵引起的吸收峰[5]。因此，可初步判斷該物質(zhì)是糖類化合物。P-AAPL與磷酸化P-AAP相比，在波數(shù)2 854、1 741、1 232、530 cm-1處出現(xiàn)峰值，可判斷該化合物由脂類化合物組成。2 854 cm-1是雙分子層內(nèi)部非極性CH2特征基團(tuán)的吸收峰，1 741 cm-1和1 232 cm-1代表大豆卵磷脂雙分子層的外部極性基團(tuán)C=O和P=O的特征吸收峰。此外P-AAPL還在波數(shù)為530 cm-1處出現(xiàn)明顯的膽固醇的特征吸收峰。脂類官能團(tuán)的出現(xiàn)對(duì)于多糖被脂類壁材包封有著重要意義。

2.3 不同濃度P-AAP和P-AAPL溶液的靜態(tài)流變學(xué)結(jié)果

流變特性能夠評(píng)估流體的力學(xué)性能，黏度能夠影響流體的感官品質(zhì)，它是用來評(píng)估流體品質(zhì)的一個(gè)重要因素，代表了流體內(nèi)部結(jié)構(gòu)被破壞的難易程度[22]。脂質(zhì)體具有與細(xì)胞膜相類似的磷脂雙分層結(jié)構(gòu)，具有一定的流動(dòng)性。本研究以表觀黏度為因變量，以剪切速率為自變量，探究不同濃度P-AAP和P-AAPL溶液的靜態(tài)流變學(xué)結(jié)果。不同濃度P-AAP和P-AAPL溶液的表觀黏度與剪切速率的關(guān)系曲線見圖7。

圖7 不同濃度P-AAP和P-AAPL溶液的表觀黏度與剪切速率的關(guān)系Fig.7 Relationship between apparent viscosity and shear rate of P-AAP and P-AAPL solutions at different concentrations

如圖7A所示，不同濃度P-AAP表現(xiàn)出剪切稀釋的假塑性流體現(xiàn)象。當(dāng)P-AAP為2.5 mg/mL時(shí)，隨著剪切速率的不斷升高，P-AAP的表觀黏度從467.21 mPa·s下降到 187.78 mPa·s。當(dāng)P-AAP為 0.5 mg/mL時(shí)，隨著剪切速率的不斷升高，P-AAP的表觀黏度從61.43 mPa·s下降到8.23 mPa·s。在一定的剪切速率下，隨著P-AAP濃度的升高，多糖溶液的表觀黏度增加，剪切稀化現(xiàn)象也愈來愈明顯。剪切速率為10 s-1，當(dāng)PAAP 濃度為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL 時(shí)，表觀黏度分別為 53.90、122.35、214.85、285.23、410.32 mPa·s。

如圖7B所示，不同濃度P-AAPL表現(xiàn)出剪切稀釋的假塑性流體現(xiàn)象。當(dāng)P-AAPL濃度為2.5 mg/mL時(shí)，隨著剪切速率的不斷升高，P-AAPL的表觀黏度從561.23 mPa·s下降到 414.25 mPa·s。當(dāng) P-AAPL 為0.5 mg/mL時(shí)，隨著剪切速率的不斷升高，P-AAPL的表觀黏度從224.58 mPa·s下降到157.12 mPa·s。在一定的剪切速率下，隨著P-AAPL濃度的升高，多糖溶液的表觀黏度增加，剪切稀化現(xiàn)象也愈來愈明顯。剪切速率為 10 s-1，當(dāng) P-AAPL 濃度為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/mL 時(shí)，黏度分別為213.11、280.25、401.55、465.84、538.96 mPa·s。在相同的剪切速率下，磷酸化黑木耳多糖脂質(zhì)體表觀黏度明顯高于磷酸化黑木耳多糖，可能是由于脂質(zhì)體和多糖間的氫鍵數(shù)量增加，脂質(zhì)體和多糖的氫鍵較黑木耳多糖間的氫鍵難斷裂[37]。

2.4 脂質(zhì)體包封前后多糖的DPPH自由基的清除能力測(cè)定

DPPH自由基的清除能力是判斷抗氧化能力的重要指標(biāo)，主要是通過DPPH自由基的孤對(duì)電子與單電子配對(duì)，使自身的紫色變?yōu)辄S色，且在517 nm的波長(zhǎng)處顯示出最大吸收峰，清除能力越強(qiáng)，吸光度越小[33]。本研究以DPPH自由基的清除能力為因變量，探究脂質(zhì)體包封前后多糖的體外抗氧化能力。脂質(zhì)體包封前后多糖的DPPH自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果見圖8。

圖8 DPPH自由基清除能力的測(cè)定Fig.8 DPPH free radical scavenging ability

由圖8可知，在多糖濃度為6 mg/mL～10 mg/mL時(shí)，P-AAP的DPPH自由基清除率明顯高于AAP，且脂質(zhì)體包封后的多糖始終低于包封前多糖的DPPH自由基清除率。當(dāng)多糖濃度為8 mg/mL時(shí)，AAP、P-AAP、AAPL和P-AAPL的DPPH自由基清除率分別為34.94%、52.41%、28.78%和42.98%，此時(shí)AAP較AAPL的DPPH自由基清除率高6.16%，P-AAP較P-AAPL的DPPH自由基清除率高9.43%。分析可能是因?yàn)橹|(zhì)體的磷脂雙分子層包裹了多糖，為避免多糖被空氣氧化，所以包封后多糖的DPPH自由基清除能力下降[22]。

3 結(jié)論

磷酸化修飾前后AAP單糖組成主要由半乳糖醛酸、葡萄糖、果糖、甘露糖和木糖組成，磷酸化修飾前后黑木耳多糖摩爾比由9.2∶8.3∶6.4∶1.6∶1.3變?yōu)?.5∶7.5∶2.6∶0.8∶0.8。傅里葉紅外光譜結(jié)果表明有磷酸基團(tuán)的接入。掃描電鏡顯示磷酸化修飾后AAP的結(jié)構(gòu)遭到破壞。P-AAPL包封率為83.26%，平均粒徑為（122.42±1.41）nm，電位主要分布在-61.74 mV～-32.04 mV范圍內(nèi)，多分散指數(shù)為0.298±0.035。傅里葉變換紅外光譜結(jié)果表明，脂質(zhì)體與P-AAP之間無新的化學(xué)鍵產(chǎn)生。P-AAP和P-AAPL都表現(xiàn)出典型的非牛頓行為和明顯的剪切稀化現(xiàn)象，均為假塑性流體。在多糖濃度為6 mg/mL～10 mg/mL時(shí)，P-AAP的DPPH自由基清除率明顯高于AAP，且脂質(zhì)體包封后的多糖始終低于包封前多糖的DPPH自由基清除率。當(dāng)多糖濃度為8 mg/mL時(shí)，AAP較AAPL的DPPH自由基清除率高6.16%，P-AAP較P-AAPL的DPPH自由基清除率高9.43%。以上結(jié)果表明，磷酸化修飾能夠提高AAP的體外抗氧化能力且脂質(zhì)體的包封可以有效防止P-AAP的氧化。