陳，林信武，鄭智祥

福建省老年醫(yī)院（福建省立醫(yī)院北院）麻醉科，福建福州 350003

糖尿病腎病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病常見的并發(fā)癥之一，主要發(fā)病原因是糖尿病病情長(zhǎng)期得不到很好的控制。體內(nèi)高血糖、高血壓水平會(huì)不斷損害腎臟血管，增加腎臟過濾血液的負(fù)荷，久而久之就會(huì)導(dǎo)致腎臟疾病。糖尿病腎病在早期主要是出現(xiàn)微量白蛋白尿，隨著疾病的進(jìn)展，蛋白尿會(huì)越來越多，并逐步發(fā)展到腎病綜合征的范圍，在后期甚至?xí)绊懩I功能，且很多患者在后期病情進(jìn)展非?？?，且可能會(huì)發(fā)展為尿毒癥。糖尿病腎病的發(fā)病率是逐漸升高的，這與糖尿病、腎病、高血壓等疾病的發(fā)生率逐年上升密切相關(guān)[1]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，七氟醚與二氧化氮吸附劑接觸后，能夠降解生成少量的化合物A[五氟異丙烯甲氟醚（PIFE，C4H2F60）]，此化合物對(duì)大鼠有劑量依賴性腎毒性，而經(jīng)過相關(guān)報(bào)道表明，七氟醚全身麻醉對(duì)人體腎功能并不會(huì)產(chǎn)生影響[2]?；诖?，本研究于2020年9月—2021年9月選取66只DN大鼠作為研究對(duì)象，分析吸入七氟醚全身麻醉后對(duì)腎足細(xì)胞的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究材料

七氟醚（日本）、鏈脲霉素（streptozocin, STZ）（上海懋康生物科技有限公司，產(chǎn)品編號(hào)：MS1601-100MG，規(guī)格：100 mg）；羅氏羅康全活力型血糖儀（德國(guó)）；UAL濃度測(cè)定用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）（美國(guó)）；Datex Ohmeda 7100型麻醉機(jī)及Datex Ohmeda S/5監(jiān)護(hù)儀（芬蘭）[3]；兔抗小鼠nephrin、podocin、α-SMA抗體，鼠抗小鼠desmin單抗（Abcam，英國(guó)）；Biotin-labeled山羊抗大鼠IgG，山羊抗大鼠二抗包被（英國(guó)）；PRO-PREPTM蛋白質(zhì)提取方案（韓國(guó)）；試劑盒（美國(guó)）；QuantiRect逆轉(zhuǎn)錄工具包使用試劑盒Qiagen[4]（優(yōu)寧維生物科技有限公司）；ABI棱鏡7700序列檢測(cè)應(yīng)用系統(tǒng)（賽默飛世爾科技有限公司）；PVDF微孔膜、SDS-PAGE電泳（均產(chǎn)自美國(guó)）[5]。

1.2 方法

1.2.1 制備糖尿病模型大鼠 選取Sprague-Dawley成年公大鼠（由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)：NO.211002300003081）66只，體質(zhì)量為200～260 g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，室內(nèi)溫度保持在22～25℃，相對(duì)濕度65%～70%，期間供給充足的飼料和水[6]。在大鼠腹腔內(nèi)注射53 mg/kg的STZ，注射完成后方可恢復(fù)正常飼養(yǎng)，72 h后在大鼠尾部取靜脈血檢測(cè)血糖，大鼠造模成功判定標(biāo)準(zhǔn)為血糖≥16.7 mmol/L。

1.2.2 分組及七氟醚吸入方法 糖尿病腎病大鼠模型以隨機(jī)方式分成每組均為33只的模型組和七氟醚組。另選取33只大鼠記為空白對(duì)照組。參照七氟醚的使用方法使七氟醚組大鼠吸入3.4%的七氟醚進(jìn)行全身麻醉，干預(yù)3 h，模型組及空白對(duì)照組大鼠同期吸入30%氧氣3 h[7]。

1.2.3 尿液UAL和血液生化參數(shù)的測(cè)定 大鼠尿白蛋白（urinary albumin, UAL）需每天測(cè)定，采用全自動(dòng)生化分析儀。同時(shí)，采集主動(dòng)脈的血液，用血糖監(jiān)測(cè)儀測(cè)量血糖（glucose, GLU），血標(biāo)本在-80℃環(huán)境下儲(chǔ)存。通過自動(dòng)生化分析儀采集血清中天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase, AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase, ALT）、肌酐（creatinine, CR）及尿素 氮（blood urea nitrogen, BUN）[8]。

1.2.4 腎組織的染色 收集實(shí)驗(yàn)大鼠的腎臟，并進(jìn)行離心清洗，待清洗完成后進(jìn)行稱重，清除腎表面皮質(zhì)，隨后凍結(jié)腎臟組織。根據(jù)腎盞將右腎均勻切割為2 mm厚的腎組織，用10%中性甲醛固定，石蠟包埋，之后切割成3 μm厚的樣本進(jìn)行蘇木精和伊紅染色（H&E）[9-11]。

1.2.5 RNA隔離和RT-PCR方法 以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, CAPDH）作為內(nèi)部參數(shù)，采用RT-PCR方法測(cè)定腎皮質(zhì)nephrin、podocin、α-SMA和desmin mRNAs。試劑盒分離RNA。12 μl反應(yīng)（100 ng cDNA、0.5 μl gene-specific正向與反向引物、7.5 μl QuantiTect逆轉(zhuǎn)錄工具包）。循環(huán)條件：初始模板在95℃變性4 min，并保持95℃持續(xù)20 s轉(zhuǎn)變40周，調(diào)整至55℃并降火40 s，在持續(xù)升溫達(dá)75℃時(shí)持續(xù)40 s。每個(gè)樣本分為3份，分別進(jìn)行熒光檢測(cè)內(nèi)部參數(shù)。GAPDH數(shù)量正?；螅匆欢ū壤刂苖RNA的平均結(jié)果繪制設(shè)計(jì)成圖表[12-13]。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型組和七氟醚組血液生化指標(biāo)比較

模型組UAL、GLU、BUN、CR、AST、ALT水平低于七氟醚組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 模型組和七氟醚組DN大鼠血液生化指標(biāo)比較 (±s)

表1 模型組和七氟醚組DN大鼠血液生化指標(biāo)比較 (±s)

組別七氟醚組（n=33）模型組（n=33）t值P值UAL（mg/24 h）5.12±0.25 3.41±0.15 33.693＜0.001 GLU（mmol/L）11.22±1.37 8.53±0.96 9.237＜0.001 BUN（mmol/L）10.08±0.96 9.25±0.83 3.757＜0.001 CR（μmol/L）70.23±9.18 63.15±5.12 3.869＜0.001 AST（U/L）58.38±6.38 48.33±5.69 6.753＜0.001 ALT（U/L）61.83±6.25 52.77±4.32 6.850＜0.001

2.2 3組腎組織H&E染色后病理變化觀察

腎組織經(jīng)H&E染色后，通過光學(xué)顯微鏡觀察腎組織病理變化，其中空白對(duì)照組腎臟組織未出現(xiàn)變化；模型組出現(xiàn)管變形及不完整的腎小球，同時(shí)腎小球體積增加，表明早期DN大鼠經(jīng)七氟烷預(yù)處理后，采集的腎組織均有病理變化。見圖1。

圖1 DN早期大鼠腎組織H&E染色的病理變化（鏡下放大100倍）

2.3 RT-PCR法檢測(cè)模型組和七氟醚組腎皮質(zhì)相關(guān)指標(biāo)的定性表達(dá)

根據(jù)凝膠電泳條帶提示，七氟醚組的nephrin和podocin明顯減少，而α-SMA和desmin明顯增多。七氟醚組與模型組相比，nephrin和podocin明顯減少，而α-SMA和desmin明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 RT-PCR法檢測(cè)各指標(biāo)的mRNA定性結(jié)果

2.4 Western blotting法檢測(cè)模型組和七氟醚組相關(guān)指標(biāo)的定量表達(dá)

七氟醚組與模型組對(duì)比，nephrin和podocin明顯增多，而α-SMA和desmin明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），研究過程中仍觀察出七氟醚組的協(xié)同效應(yīng)，同時(shí)結(jié)果與mRNA表達(dá)均一致，表明早期DN大鼠經(jīng)七氟烷預(yù)處理后采集的標(biāo)本中，腎足細(xì)胞各指標(biāo)表達(dá)均有變化。見圖3。

圖3 western blotting法檢測(cè)各指標(biāo)的mRNA定量結(jié)果

3 討論

當(dāng)前我國(guó)經(jīng)濟(jì)不斷發(fā)展，人民生活方式出現(xiàn)較大轉(zhuǎn)變，不良生活習(xí)慣導(dǎo)致我國(guó)糖尿病發(fā)病率不斷上升。胰島素分泌異常是導(dǎo)致糖尿病的主要原因，患者臨床表現(xiàn)為血糖升高，機(jī)體長(zhǎng)期處于高血糖水平，同時(shí)會(huì)出現(xiàn)脂質(zhì)代謝異常等不良情況。糖尿病患者若不及時(shí)治療會(huì)使病情加重而引發(fā)多種并發(fā)癥[14]。臨床通過控制患者血糖水平治療糖尿病，其凝血和抗凝血檢測(cè)有明顯改變，要盡早實(shí)施處理，否則會(huì)加重病情。因此要選擇有效的診斷方式，對(duì)患者病情實(shí)施診斷，對(duì)治療患者疾病具有重要意義。腎內(nèi)科中最為常見的一種疾病便是腎病綜合征，該疾病的病程比較長(zhǎng)，極易與糖尿病、高血壓和心血管等疾病產(chǎn)生關(guān)聯(lián)性作用，且此疾病的發(fā)癥類型較多、危害性較大，為患者生活質(zhì)量帶來嚴(yán)重不良影響。據(jù)相關(guān)實(shí)踐報(bào)道表明，糖尿病腎病與患者血糖、血脂、血壓水平有很大關(guān)聯(lián)，而且患者在治療期間極易產(chǎn)生相關(guān)并發(fā)癥，所以加強(qiáng)對(duì)患者的治療十分重要。

從功能的角度來看，DN屬于嚴(yán)重的綜合征，其臨床特征在于腎小球病變及DM、UAL排泄增加。根據(jù)過往研究分析得出[15]，DN蛋白尿水平與分子結(jié)構(gòu)變化有顯著相關(guān)性，同時(shí)nephrin、podocin、α-SMA和desmin存在異常表達(dá)。徐鋒等[16]發(fā)現(xiàn)腎小球足細(xì)胞上存在膜蛋白，在維持膜完整性方面有顯著作用。相關(guān)部門研究表明nephin與DN在分布與表達(dá)方面存在相關(guān)性。Podocin是由腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和支持細(xì)胞合成，是一個(gè)主要帶負(fù)電荷的腎小球蛋白，可以固定在腎小球足細(xì)胞頂膜，由于很多陰性變化并不粘附于其他物質(zhì)，通常被認(rèn)為是重要的正常分子，用以保持濾膜和足突細(xì)胞的標(biāo)記[17]。α-SMA屬于肌纖細(xì)胞蛋白，研究發(fā)現(xiàn)其主要表達(dá)在正常腎血管平滑肌細(xì)胞中，若出現(xiàn)在系膜、腎小管上皮細(xì)胞和其他固有細(xì)胞中，則表明上皮間充質(zhì)病變發(fā)生轉(zhuǎn)變。

有研究表明，可采用腹腔注射STZ液的方式建立糖尿病模型大鼠[18]。本研究故采用腹腔注射STZ液53 mg/kg建立糖尿病模型大鼠，24 h后取尾靜脈血，檢測(cè)血糖濃度，血糖濃度≥16.7 mmol/L時(shí)，表明模型大鼠造模成功。造模成功后3 d內(nèi)，大鼠逐漸出現(xiàn)不良反應(yīng)，隨著高血糖持續(xù)升高，其臨床病癥與糖尿病癥狀相符，符合糖尿病病理特征。有研究表明，腹腔注射STZ液造模成功后，大鼠的腎足功能明顯下降，其GLU濃度明顯降低[19]。本研究基于此，對(duì)STZ液誘導(dǎo)糖尿病腎病造模成功后進(jìn)行飼養(yǎng)的大鼠給予吸入七氟醚麻醉干預(yù)，然后評(píng)價(jià)nephrin、pdodin、α-SMA和desmin定性和定量的表達(dá)。根據(jù)本研究結(jié)果顯示，兩組大鼠24 h內(nèi)進(jìn)行GLU濃度結(jié)果的測(cè)定，七氟醚組的大鼠各項(xiàng)生化指標(biāo)較模型組明顯提高（P＜0.05），說明七氟醚對(duì)于糖尿病腎病的GLU濃度有著一定的影響。

糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制為長(zhǎng)期高血糖造成腎臟動(dòng)脈硬化，腎小球損傷造成蛋白尿，晚期可以造成腎功能不全[20]。治療時(shí)，首先要控制好血糖，同時(shí)血壓血脂等與動(dòng)脈硬化有關(guān)的因素也要有效進(jìn)行控制。本研究表明，腎組織經(jīng)H&E染色后，通過光學(xué)顯微鏡觀察腎組織病理變化，其中空白對(duì)照組腎臟組織未出現(xiàn)變化；模型組出現(xiàn)管變形及不完整的腎小球，同時(shí)腎小球體積增加。RT-PCR法檢測(cè)下，七氟醚組大鼠的α-SMA和desmin增多，而nephrin和podocin顯著減少，而七氟醚組與模型組相比，nephrin和podocin明顯減少，而α-SMA和desmin明顯增多（P＜0.05）。Western blotting法檢測(cè)下，七氟醚組與模型組對(duì)比，nephrin和podocin明顯增多，而α-SMA和desmin明顯減少（P＜0.05），但能夠觀察到七氟醚組的協(xié)同效應(yīng)，但這些結(jié)果與mRNA表達(dá)均一致，表明七氟醚對(duì)大鼠蛋白中的mRNA產(chǎn)生影響。

綜上所述，吸入七氟醚后模型大鼠蛋白中的mRNA明顯升高，而這種影響與nephrin、podocin、α-SMA和desmin有關(guān)。