劉奕明 孫銀平 鐘平玉 楊柏煒（福建醫(yī)科大學附屬龍巖第一醫(yī)院消化內科，龍巖 364000）

胃癌是威脅我國人民生命安全的消化道惡性腫瘤之一，每年全球胃癌的發(fā)病例數(shù)超過103萬例，且病死率在所有腫瘤中占據(jù)第三位，由于胃癌早期癥狀較為隱匿導致40%左右的患者確診時已發(fā)生轉移，治療后胃癌患者五年生存率<10%，因而抑制胃癌轉移是提高胃癌治療效果及改善患者預后的關鍵［1］。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是由前體mRNA通過剪切形成的閉合環(huán)狀RNA分子，其具有穩(wěn)定性與組織特異性，并可通過吸附微小RNA（miRNA）而參與翻譯蛋白等多種生物學過程從而參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。近年來，越來越多的研究表明circRNA可調控胃癌細胞增殖、侵襲等多種生物學行為，并可能作為胃癌治療的潛在靶點［2-4］。circ_0055625在結腸癌細胞中呈高表達，并可通過吸附miR-106b-5p而促進細胞增殖及轉移［5］。但circ_0055625在胃癌中的表達及其可能生物學功能尚未可知。通過靶基因預測網站預測顯示circ_0055625與miR-1225-3p存在結合位點，研究表明miR-1225-3p在非小細胞肺癌中呈低表達，上調其表達可抑制非小細胞肺癌細胞轉移［6］。但circ_0055625/miR-1225-3p軸在胃癌形成及轉移過程中的作用機制尚未可知。因此，本研究主要探討circ_0055625是否可通過靶向調控miR-1225-3p的表達從而影響胃癌細胞增殖及轉移，為胃癌的治療提供潛在靶點。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料收集2019年1月至2020年6月于福建醫(yī)科大學附屬龍巖第一醫(yī)院進行胃癌根治術的55例胃癌患者的癌組織及其癌旁組織（癌組織>5 cm范圍外正常組織）標本，于液氮中保存，其中 男35例，女20例，年 齡46~67歲，平 均 年 齡（53.68±7.49）歲。所有組織標本均經病理診斷確診。本研究經福建醫(yī)科大學附屬龍巖第一醫(yī)院倫理委員會批準。

1.1.2 試劑與儀器人胃癌細胞AGS購自湖南豐暉生物；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone；胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco；LipofectamineTM3000 Transfection Reagent、Trizol試劑、circ_0055625過表達載體（pcDNA-circ_0055625）及其對照空載體（pcDNA）購自美國Invitrogen；反轉錄試劑與qRTPCR試劑購自北京天根生化；circ_0055625小分子干擾RNA（si-circ_0055625）及其陰性對照（si-NC）、miR-1225-3p寡核苷酸模擬物（miR-1225-3p mimics）及陰性對照mimic NC序列（miR-NC）、miR-1225-3p特異性寡核苷酸抑制劑（anti-miR-1225-3p）及其陰性對照（anti-miR-NC）購自廣州銳博生物；MTT試劑、Matrigel基質膠購自北京索萊寶；Transwell小室購自美國Corning；兔抗人vimentin、YAP-1多克隆抗體購自沈陽萬類生物；兔抗人Snail多克隆抗體、二抗購自美國Abcam；蛋白質提取相關試劑與SDS凝膠電泳相關試劑購自上海碧云天生物；低溫離心機購自美國Thermo Fisher；EON型酶聯(lián)免疫檢測儀購自美國Bio-Tek；Nikon ECLIPSE Ti-S熒光倒置顯微鏡購自日本尼康；StepOnePlus實時熒光定量PCR儀購自美國ABI；DYY-6C型雙穩(wěn)定電泳儀購自北京六一生物。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉染及分組AGS細胞常規(guī)培養(yǎng)，按1×105個/孔的密度接種于直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中，待細胞生長融合度達到70%左右時用LipofectamineTM3000 Transfection Reagent進行轉染，每孔取4μg的si-NC、si-circ_0055625、miR-NC、miR-1225-3p mimics、si-circ_0055625與anti-miR-NC（共轉染）、si-circ_0055625與anti-miR-1225-3p（共轉染）分別進行轉染，轉染6 h后將培養(yǎng)基更換為含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別記為si-NC組、si-circ_0055625組、miR-NC組、miR-1225-3p組、si-circ_0055625+anti-miR-NC組、si-circ_0055625+anti-miR-1225-3p組。

1.2.2 qRT-PCR檢 測circ_0055625、miR-1225-3p的表達水平收集各組AGS細胞與癌旁組織、胃癌組織，采用Trizol法分別提取組織標本與細胞的總RNA，反轉錄合成cDNA。PCR擴增反應體系：SYBR Green Master Mix 10μl、正反向引物各0.8μl、cDNA 2μl、ddH2O補足體系至20μl；反應條件：95℃預變性2 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40次循環(huán)。circ_0055625以GAPDH為內參，miR-1225-3p以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

1.2.3 MTT檢測細胞增殖取各組AGS細胞按照3 000個/孔接種于96孔板，于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)12 h后，每孔分別加入MTT溶液20μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h，3 000 r/min離心5 min后棄上清，每孔分別加入150μl DMSO，室溫避光孵育5 min，應用酶標儀檢測各孔光密度值（OD）。細胞存活率（%）=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.2.4克隆形成實驗取各組AGS細胞懸液接種于6孔板（500個/孔），于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)12 d（0肉眼可見克隆），每2 d更換1次培養(yǎng)基，終止培養(yǎng)后用4%多聚甲醛固定30 min，1%結晶紫染色液染色20 min，計算克隆形成數(shù)。

1.2.5 劃痕實驗將各組AGS細胞按照1×104個/孔接種于6孔板，待細胞生長融合度達到90%時用10μl移液槍的槍頭在6孔板的中間劃線，PBS沖洗劃掉的細胞后再加入2 ml含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液，此時記為0 h，于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h后在相同位置拍照并應用Image J軟件計算細胞劃痕距離，計算劃痕愈合率（%）=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.6 Transwell實驗檢測細胞侵襲用不含血清的DMEM培養(yǎng)基按照1∶5的比例稀釋Matrigel基質膠，將其加入小室的上室（30μl/孔）后于培養(yǎng)箱內孵育3 h，然后加入各組AGS細胞（2×104個/ml）400μl，小室的上室，下室中加入600μl含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)48 h后取出小室，PBS洗滌細胞后用4%多聚甲醛固定20 min，0.05%結晶紫染色液染色20 min，PBS洗滌后晾干，于倒置顯微鏡下計數(shù)細胞。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因檢測circ_0055625與miR-1225-3p的靶向關系Circular RNA Interactome預測顯示circ_0055625與miR-1225-3p存在結合位點，用點突變試劑盒將結合位點進行突變，分別構建含有結合位點與突變位點的熒光素酶報告基因載體（野生型載體WT-circ_0055625、突變型載體MUT-circ_0055625），利用LipofectamineTM3000 Trans?fection Reagent試劑盒分別將WT-circ_0055625、MUT-circ_0055625與miR-NC或miR-1225-3p mimics共轉染至AGS細胞，將其置于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h后收集細胞并檢測熒光素酶活性。分別將si-NC、si-circ_0055625、pcDNA、pcDNA-circ_0055625轉染至AGS細胞24 h后收集細胞并采用qRT-PCR實驗檢測miR-1225-3p的表達量。

1.2.8 Western blot檢測Snail、Vimentin、YAP-1蛋白表達收集各組AGS細胞后加入蛋白裂解液提取細胞總蛋白，取40μg蛋白樣品進行10%SDSPAGE電泳分離蛋白，用210 mA恒流的方式將分離的蛋白凝膠轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入Snail（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、YAP-1（1∶1 000）一抗與內參GAPDH抗體（1∶3 000）稀釋液，4℃孵育過夜后TBST洗膜，加入二抗稀釋液（1∶5 000）37℃孵育1 h后TBST洗膜，電化學發(fā)光液顯影，應用Image J軟件分析各條帶灰度值，以目的蛋白與內參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析采用SPSS21.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，Pearson法進行相關性分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 circ_0055625與miR-1225-3p在胃癌組織及癌旁組織中的表達與癌旁組織比較，胃癌組織中circ_0055625的表達量升高（P<0.05），miR-1225-3p的表達量降低（P<0.05），見表1。Pearson法分析胃癌組織中circ_0055625與miR-1225-3p表達量的相關性，結果顯示circ_0055625與miR-1225-3p呈負相關（r=-0.881 6，P<0.001），見圖1。

圖1 胃癌組織中circ_0055625與miR-1225-3p表達量的相關性分析Fig.1 Correlation analysis of circ_0055625 and miR-1225-3p expression in gastric cancer tissues

表1 circ_0055625與miR-1225-3p在胃癌組織及癌旁組織中的表達量（±s，n=55）Tab.1 Expression of circ_0055625 and miR-1225-3p in gastric cancer tissues and adjacent tissues（±s，n=55）

表1 circ_0055625與miR-1225-3p在胃癌組織及癌旁組織中的表達量（±s，n=55）Tab.1 Expression of circ_0055625 and miR-1225-3p in gastric cancer tissues and adjacent tissues（±s，n=55）

Note：Compared with adjacent tissues，1）P<0.05.

Groups Adjacent tissues Gastric cancer tissues t P circ_0055625 1.00±0.11 3.46±0.621）28.973 0.000 miR-1225-3p 1.00±0.18 0.36±0.091）23.585 0.000

2.2 干擾circ_0055625表達對AGS細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的影響與si-NC組比較，si-circ_0055625組細胞存活率降低（P<0.05），克隆形成數(shù)和侵襲細胞數(shù)減少（P<0.05），劃痕愈合率降低（P<0.05），Snail、Vimentin、YAP-1蛋白水平降低（P<0.05），見圖2、表2。

表2 干擾circ_0055625表達對AGS細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of interference with expression of circ_0055625 on proliferation，clone formation，migration and invasion of AGS cells（±s，n=9）

表2 干擾circ_0055625表達對AGS細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的影響（±s，n=9）Tab.2 Effect of interference with expression of circ_0055625 on proliferation，clone formation，migration and invasion of AGS cells（±s，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P<0.05.

Groups si-NC si-circ_0055625 t P circ_0055625 1.00±0.04 0.28±0.051）33.734 0.000 Cell survival rate（%）99.69±3.87 35.73±4.611）31.879 0.000 Number of clones formed 114.44±10.75 45.33±8.721）14.978 0.000 Scratch healing rate（%）56.06±2.86 25.88±5.501）14.605 0.000 Number of invasion cells 137.67±7.83 55.11±6.571）24.232 0.000

圖2 干擾circ_0055625表達對AGS細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的影響Fig.2 Effect of interference with expression of circ_0055625 on proliferation，clone formation，migra?tion and invasion of AGS cells

2.3 雙熒光素酶報告實驗與qRT-PCR實驗驗證circ_0055625與miR-1225-3p的靶向調控關系Cir?cular RNA Interactome預 測 顯 示circ_0055625與miR-1225-3p存在結合位點，見圖3A。上調miR-1225-3p表達可降低野生型載體WT-circ_0055625的熒光素酶活性（P<0.05），而對突變型載體MUTcirc_0055625的熒光素酶活性無顯著影響，見圖3B。與si-NC組比較，si-circ_0055625組miR-1225-3p的表達量升高（P<0.05）；與pcDNA組比較，pcDNAcirc_0055625組miR-1225-3p的 表 達 量 降 低（P<0.05），見圖3C。

圖3 circ_0055625與miR-1225-3p的靶向調控作用Fig.3 Targeted regulatory effects of circ_0055625 and miR-1225-3p

2.4 上調miR-1225-3p表達對AGS細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的影響與miR-NC組比較，miR-1225-3p組細胞存活率降低（P<0.05），克隆形成數(shù)和侵襲細胞數(shù)減少（P<0.05），劃痕愈合率降低（P<0.05），Snail、Vimentin、YAP-1蛋白水平降低（P<0.05），見圖4、表3。

表3 上調miR-1225-3p表達對AGS細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of up-regulation of miR-1225-3p expression on proliferation，clone formation，migration and invasion of AGS cells（±s，n=9）

表3 上調miR-1225-3p表達對AGS細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的影響（±s，n=9）Tab.3 Effect of up-regulation of miR-1225-3p expression on proliferation，clone formation，migration and invasion of AGS cells（±s，n=9）

Note：Compared with the miR-NC group，1）P<0.05.

Groups miR-NC miR-1225-3p t P miR-1225-3p 1.00±0.05 3.12±0.081）67.416 0.000 Cell survival rate（%）99.64±3.26 57.62±4.091）24.309 0.000 Number of clones formed 113.33±11.75 52.67±9.381）12.104 0.000 Scratch healing rate（%）56.13±4.67 23.54±3.661）16.478 0.000 Number of invasion cells 136.22±8.89 70.67±4.851）19.419 0.000

圖4 上調miR-1225-3p表達對AGS細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的影響Fig.4 Effect of up-regulation of miR-1225-3p expression on proliferation，clone formation，migration and invasion of AGS cells

2.5 抑制miR-1225-3p表達部分逆轉干擾circ_0055625表達對AGS細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的抑制作用與si-circ_0055625+anti-miR-NC組比較，si-circ_0055625+anti-miR-1225-3p組細胞存活率升高（P<0.05），克隆形成數(shù)和侵襲細胞數(shù)增多（P<0.05），劃痕愈合率升高（P<0.05），Snail、Vimentin、YAP-1蛋白水平升高（P<0.05），見表4、圖5。

表4 抑制miR-1225-3p表達部分逆轉干擾circ_0055625表達對AGS細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的抑制作用（±s，n=9）Tab.4 Inhibition of miR-1225-3p expression partially reversed inhibitory effects of interference with circ_0055625 expres?sion on AGS cell proliferation，clone formation，migration and invasion（±s，n=9）

表4 抑制miR-1225-3p表達部分逆轉干擾circ_0055625表達對AGS細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的抑制作用（±s，n=9）Tab.4 Inhibition of miR-1225-3p expression partially reversed inhibitory effects of interference with circ_0055625 expres?sion on AGS cell proliferation，clone formation，migration and invasion（±s，n=9）

Note：Compared with si-circ_0055625+anti-miR-NC group，1）P<0.05.

Groups si-circ_0055625+anti-miR-NC si-circ_0055625+anti-miR-1225-3p t P miR-1225-3p 1.00±0.05 0.41±0.041）27.643 0.000 Cell survival rate（%）35.85±4.97 79.94±5.451）17.933 0.000 Number of clones formed 45.33±2.24 85.11±8.101）14.200 0.000 Scratch healing rate（%）25.28±3.07 47.02±3.221）14.660 0.000 Number of invasion cells 55.11±6.05 93.78±6.281）13.304 0.000

圖5 抑制miR-1225-3p表達部分逆轉干擾circ_0055625表達對AGS細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的抑制作用Fig.5 Inhibition of miR-1225-3p expression partially reversed inhibitory effect of interference with circ_0055625 expression on proliferation，clone forma?tion，migration and invasion of AGS cells

3 討論

circRNA廣泛存在于真核細胞中，其主要是由外顯子與內含子構成的一種共價閉合環(huán)狀RNA分子，其在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中可發(fā)揮重要調控作用，同時circRNA分子富含miRNA的結合位點，并可在細胞中發(fā)揮miRNA海綿的作用，circRNA_100782、circRNA_100876在胃癌細胞中表達上調，并可發(fā)揮miRNA海綿的作用而調控其靶基因表達從而促進胃癌細胞增殖及轉移［7-8］。circRNA_0005075、circ_0000190、circ_0004872、circRHOBTB3

在胃癌細胞中表達下調，并可通過調節(jié)miRNA/靶mRNA表達而抑制胃癌細胞增殖、遷移及侵襲從而抑制胃癌進展［9-12］。

circ_0055625在結腸癌患者血清中表達上調且與化療耐藥性有關［13］。但circ_0055625在胃癌中的表達及其可能作用機制尚未見報道。本研究結果顯示，胃癌組織中circ_0055625的表達量高于癌旁組織，通過體外細胞實驗證實，siRNA靶向干擾circ_0055625表達后胃癌細胞存活率降低且克隆形成數(shù)減少，提示干擾circ_0055625表達可抑制胃癌細胞增殖及克隆形成。YAP-1屬于Hippo/YAP通路的關鍵蛋白，上皮-間質轉化是腫瘤細胞遷移及侵襲的重要環(huán)節(jié)，其可通過將上皮細胞重構后促使細胞失去黏合連接進而導致細胞轉移，YAP-1表達上調可促進轉錄因子Snail表達進而上調Vimentin的表達［14-15］。本研究結果顯示，干擾circ_0055625表達后胃癌細胞侵襲細胞數(shù)減少且劃痕愈合率降低，并可抑制Snail、Vimentin、YAP-1蛋白表達，提示干擾circ_0055625表達后可抑制胃癌細胞遷移及侵襲。

circ_0055625與胃癌細胞生物學功能的相關性研究尚未見報道，本研究通過在線靶基因預測顯示circ_0055625與miR-1225-3p存在結合位點，并檢測到胃癌組織中miR-1225-3p的表達量低于癌旁組織，且胃癌組織中circ_0055625與miR-1225-3p表達量呈負相關，提示circ_0055625可能通過靶向結合miR-1225-3p而負向調控其表達進而參與胃癌發(fā)生發(fā)展過程。研究表明miR-1225-3p在骨肉瘤中表達量降低，circ_0016347通過調節(jié)miR-1225-3p/KCNH1表達而促進骨肉瘤進展［16］。miR-1225-3p在膽道癌、結直腸癌中表達下調，并可能作為腫瘤早期診斷及評估患者預后的潛在標記物［17-18］。本研究通過雙熒光素酶報告實驗與qRT-PCR實驗證實circ_0055625可靶向調控miR-1225-3p的表達，上調miR-1225-3p表達可抑制胃癌細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲，而抑制其表達可拮抗干擾circ_0055625表達對胃癌細胞增殖及轉移的抑制作用。提示circ_0055625可通過靶向結合miR-1225-3p而抑制其表達從而促進胃癌細胞增殖及轉移。

綜上所述，胃癌組織中circ_0055625表達上調，而miR-1225-3p的表達下調，二者存在負相關關系且存在靶向結合作用，干擾circ_0055625表達可通過上調miR-1225-3p表達而抑制胃癌細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲，可為進一步揭示胃癌的發(fā)病機制奠定實驗基礎，還可為胃癌的治療提供潛在靶點。但circ_0055625序列上富含多個miRNA結合位點，其是否可通過調控其他miRNA表達而參與胃癌發(fā)生、發(fā)展過程尚需進一步探究。