譚冠 文朱朱 周文靜（河南省信陽職業(yè)技術學院，信陽 464000）

子宮肌瘤是育齡期婦女常見的良性腫瘤，其癥狀多樣，具有個體差異，臨床主要表現(xiàn)為月經(jīng)過多、陰道出血、習慣性流產(chǎn)、腹部壓迫等癥狀，好發(fā)于30~50歲的女性，在育齡期婦女中發(fā)病率達20%~30%，且呈逐年升高趨勢［1-2］。目前對子宮肌瘤的治療手段主要有藥物治療、手術治療與激素治療，但手術與激素會對患者造成創(chuàng)傷并產(chǎn)生副作用，因此尋找有效的治療藥物具有重要意義?？鄥A是從中藥苦參中提取的生物堿，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗病毒和抗腫瘤等多種藥理活性，研究表明苦參堿能顯著抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移，并促進腫瘤細胞凋亡和自噬［3］。Toll樣受體3（Toll-like receptor 3，TLR3）細胞外跨膜糖蛋白利用細胞信號轉導機制誘導免疫反應，在先天性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用［4］。磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-ki?nase，PI3K）是一種重要激酶，與蛋白激酶B（protein kinase B，Akt/PKB）組成信號轉導通路PI3K/Akt，在細胞增殖、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用［5］。研究表明，TLR3可通過PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)分枝桿菌RNA誘導IL-10產(chǎn)生［6］。因此，本研究通過探索苦參堿對TLR3和PI3K/Akt通路的影響，進一步探討苦參堿在抑制子宮肌瘤細胞增殖、遷移與侵襲中的具體機制。

1 材料與方法

1.1 材料RNA提取試劑、LipofectamineTM2000試劑盒購自美國Invitrogen公司；TLR3、PI3K、GADPH引物序列由上海生工生物工程有限公司設計合成；pcDNA3.1/TLR3表達質粒及空質粒由廣州銳博生物公司設計與合成；1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；BCA試劑盒、RIPA蛋白裂解液、ECL試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；細胞計數(shù)試劑盒（Cell Counting Kit 8，CCK-8）、Annexin VFITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；兔抗人TLR3、PI3K、p-Akt、MMP-2、MMP-9、β-actin單克隆抗體購自Abcam公司；山羊抗兔lgG購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 原代子宮肌瘤細胞的培養(yǎng)與鑒定選取2018年10月至2019年8月于信陽職業(yè)技術學院附屬醫(yī)院手術切除的10例子宮肌瘤標本，經(jīng)病理診斷為子宮肌瘤。選取其中1例標本，無菌條件下取肌瘤組織1 cm×1 cm×1 cm，參考文獻［7-8］方法鑒定子宮肌瘤細胞，倒置顯微鏡觀察細胞為小梭形，呈放射狀生長，采用α-actin抗體進行免疫細胞化學法染色鑒定為子宮平滑肌細胞，取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞分組及轉染將人子宮肌瘤細胞分為6組，分別為對照組（不做任何處理）、苦參堿低、中、高劑量組（分別用0.5、1.0、2.0 mg/ml苦參堿處理）、pcDNA3.1/TLR3質粒（TLR3）+高劑量苦參堿組（2.0 mg/ml苦參堿處理）、NC組（轉染空質粒+2.0 mg/ml苦參堿處理），按照Lipofectamine2000說明書將pcDNA3.1/TLR3質粒和TLR3-NC轉染子宮肌瘤細胞轉染6 h，熒光鑒定轉染成功后更換含2.0 mg/ml苦參堿的培養(yǎng)液繼續(xù)孵育24 h，每組設置6個復孔，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3 RT-qPCR檢測TLR3、PI3K mRNA水平使用RNA提取試劑盒提取1.2.2各組細胞總RNA，反轉 錄 合成為cDNA后，RT-qPCR檢 測TLR3、PI3K mRNA的相對表達量。以GADPH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分別計算TLR3、PI3K mRNA相對表達量。TLR3、PI3K、GADPH引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.4 細胞增殖實驗通過CCK-8法檢測1.2.2各組子宮肌瘤細胞增殖情況，按照試劑盒說明書操作，酶標儀測定吸光度值（A），實驗重復3次，細胞存活率（%）=（A實驗組/A空白對照組）×100%。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡取1.2.2各組細胞培養(yǎng)48 h后，用0.25%EDTA胰酶消化細胞，PBS沖洗后將細胞制成懸液，加入10μl Annexin VFITC和5μl PI混勻，避光孵育10 min，上流式細胞儀檢測。

1.2.6 細胞劃痕實驗收集1.2.2各組對數(shù)生長期細胞，以1×106個/孔接種于6孔板，待各組子宮肌瘤細胞長滿80%后，用20μl移液器槍頭在6孔板垂直劃痕，D-hanks液洗去除飄落細胞，加入培養(yǎng)基培養(yǎng)36 h，隨機選擇3個×100視野，倒置顯微鏡拍照，測量劃痕距離，計算平均值。遷移率（%）=（0 h劃痕距離-36 h劃痕距離）/0 h劃痕距離×100%。

1.2.7 細胞侵襲實驗Transwell檢測各組細胞侵襲情況，培養(yǎng)基與基質膠按照體積比8∶1混勻后，以50μl/孔均勻鋪在Transwell小室上室，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后吸去培養(yǎng)液待用，小室上室加入200μl單細胞懸液，下室加入650μl含10%FBS的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后取出小室，棉簽拭去上室細胞后，PBS沖洗，0.5%結晶紫染色，倒置光學顯微鏡下觀察并拍照，計算穿膜細胞數(shù)。

1.2.8 Western blot檢測TLR3、PI3K、p-Akt、MMP-2、MMP-9蛋白表達收集1.2.2各組細胞，加入細胞裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE電泳后將凝膠上的蛋白轉至PVDF膜，以5%的BSA室溫封閉2 h，加入一抗TLR3、PI3K、p-Akt、MMP-2、MMP-9和β-actin（1∶1 000），4℃孵育過夜，HRP標記的羊抗小鼠IgG與羊抗兔IgG（1∶5 000）室溫孵育30 min，滴加ECL發(fā)光試劑，暗室曝光顯影，分析條帶灰度。

1.3 統(tǒng)計學方法以統(tǒng)計學軟件SPSS22.0分析實驗數(shù)據(jù)，計量資料以±s描述，多組間比較使用單因素方差分析，進一步兩組間比較行SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 原代子宮肌瘤細胞的培養(yǎng)與鑒定HE染色顯示，子宮肌瘤組織可見炎癥細胞浸潤，細胞呈圓形或橢圓形，核仁明顯，免疫組化顯示α-actin抗體呈陽性（圖1）。細胞生長曲線顯示擴增出的原代子宮肌瘤細胞增殖能力良好。

圖1 原發(fā)性子宮肌瘤的培養(yǎng)與鑒定Fig.1 Culture and identification of primary uterine fibroids

2.2 苦參堿對子宮肌瘤細胞增殖與凋亡的影響

與對照組相比，苦參堿低、中、高劑量組子宮肌瘤細胞存活率降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與苦參堿高劑量組相比，TLR3+苦參堿高劑量組子宮肌瘤細胞存活率升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），TLR3-NC+苦參堿高劑量組子宮肌瘤細胞存活率差異無統(tǒng)計學意義（圖2A，P>0.05）。與對照組相比，苦參低、中、高劑量組子宮肌瘤細胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與苦參堿高劑量組相比，TLR3+苦參堿高劑量組子宮肌瘤細胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），TLR3-NC+苦參堿高劑量組子宮肌瘤細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05，圖2B、C）。

圖2 苦參堿對子宮肌瘤細胞增殖和凋亡的影響Fig.2 Effects of matrine on proliferation and apoptosis of uterine leiomyoma cells

2.3 苦參堿對子宮肌瘤細胞遷移、侵襲能力的影響與對照組相比，苦參堿低、中、高劑量組子宮肌瘤細胞遷移率降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與苦參堿高劑量組相比，TLR3+苦參堿高劑量組子宮肌瘤細胞遷移率升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），TLR3-NC+苦參堿高劑量組子宮肌瘤細胞遷移率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05，圖3A、C）。Transwell結果顯示，與對照組相比，各藥物干預組細胞侵襲率降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與苦參堿高劑量組相比，TLR3+苦參堿高劑量組子宮肌瘤細胞侵襲率升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），TLR3-NC+苦參堿高劑量組子宮肌瘤細胞侵襲率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05，圖3B、D）。

圖3 苦參堿對子宮肌瘤細胞遷移、侵襲的影響Fig.3 Effects of matrine on migration and invasion of uterine leiomyoma cells

2.4 苦參堿對子宮肌瘤細胞部分基因表達的影響與對照組相比，苦參堿低、中、高劑量組TLR3 mRNA與PI3K mRNA水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與苦參堿高劑量組相比，TLR3+苦參堿高劑量組TLR3 mRNA與PI3K mRNA水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），TLR3-NC+苦參堿高劑量組TLR3 mRNA與PI3K mRNA水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05，圖4A）。與對照組相比，苦參堿低、中、高劑量組TLR3、PI3K、p-Akt、MMP-2、MMP-9蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與苦參堿高劑量組相比，TLR3+苦參堿高劑量組TLR3、PI3K、p-Akt、MMP-2、MMP-9蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），TLR3-NC+苦參堿高劑量組子宮肌瘤細胞蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05，圖4B、C）。

圖4 各組細胞相關基因mRNA和蛋白表達水平Fig.4 mRNA and protein expression levels of cell related genes in each group

3 討論

子宮肌瘤是女性生殖系統(tǒng)常見腫瘤，目前對于子宮肌瘤的根治尚無有效藥物，手術為治療子宮肌瘤的主要手段，對育齡期女性而言，藥物治療為首選。子宮肌瘤的發(fā)病與其細胞增殖、侵襲等相關，因此尋找可有效抑制子宮肌瘤細胞增殖、遷移與侵襲的藥物對子宮肌瘤的治療具有重要意義［9-10］。

苦參堿被廣泛應用于抗腫瘤領域研究，主要通過抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲與轉移誘導腫瘤細胞凋亡。YANG等［11］研究表明，苦參堿可劑量和時間依賴性地抑制非小細胞肺癌細胞的增殖活性，苦參堿可阻斷PAX2表達，從而干擾上皮-間質轉化信號通路，從而抑制非小細胞肺癌細胞在體外的遷移和侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)，使用苦參堿處理子宮肌瘤細胞后，細胞增殖活性、遷移與侵襲能力降低，凋亡率增高，表明苦參堿能夠抑制子宮肌瘤細胞的增殖、遷移、侵襲，促進細胞凋亡，然而其具體機制尚不明確。PI3K/Akt信號通路是存在于多種細胞內(nèi)的一條重要信號通路，在調(diào)控腫瘤細胞增殖、侵襲等方面發(fā)揮功能，與腫瘤的發(fā)生、轉移、侵襲、化療耐藥等密切相關［12］?？滦∑降龋?3］研究表明，前列腺素E2（PGE2）/前列腺素E2受體（PGE2-R）通過介導P13K/Akt信號途徑參與調(diào)控子宮肌瘤發(fā)病，表明P13K/Akt信號通路與子宮肌瘤發(fā)生有關。研究表明，苦參堿可通過P13K/Akt信號通路抑制細胞增殖，調(diào)節(jié)細胞耐藥性［14］。PENG等［15］研究表明，苦參堿可通過PI3K/Akt/UPA途徑顯著抑制胃癌細胞的增殖和轉移。本研究結果顯示，苦參堿處理子宮肌瘤細胞后，細胞P13K、Akt mRNA及蛋白水平降低，表明苦參堿可下調(diào)P13K/Akt信號通路，抑制細胞的增殖、遷移與侵襲。

TLR3是TLR家族的重要成員之一，是識別病毒和哺乳動物細胞雙鏈RNA（dsRNA）的受體。TLR3與其配體結合后，可啟動信號轉導功能誘導炎癥細胞因子釋放，參與非特異性免疫反應［16］。研究表明，TLR3的表達與肝癌細胞的增殖、凋亡和血管再生有關［17］。本研究結果顯示，苦參堿處理子宮肌瘤細胞后，細胞TLR3 mRNA及蛋白表達水平降低，表明苦參堿可抑制TLR3表達。研究證實，TLR3通過PI3K/Akt通路發(fā)揮其功能，其在CD34（+）細胞、巨核細胞和血小板中表達，TLR3激動劑可激活NF-κB、PI3K/Akt通路［18］。FAN等［19］研究表明，TLR3在體內(nèi)外實驗中均能抑制乳腺癌細胞增殖，其介導的增殖抑制是通過下調(diào)EGFR/PI3K/Akt通路引起的。本研究結果顯示，與苦參堿高劑量組相比，使用TLR3轉染細胞后，子宮肌瘤細胞的TLR3、PI3K、p-Akt表達均升高，而TLR3-NC+苦參堿高劑量組TLR3、PI3K、p-Akt表達變化不顯著，提示苦參堿可能通過抑制TLR3表達來下調(diào)PI3K/Akt通路，從而抑制子宮肌瘤細胞的增殖、遷移與侵襲。

綜上所述，苦參堿通過抑制TLR3表達下調(diào)PI3K/Akt通路，抑制子宮肌瘤細胞的增殖、侵襲和遷移，為臨床治療子宮肌瘤提供了新的方向。但其具體機制尚不明確，本課題組將聯(lián)合動物模型對苦參堿的作用機制做進一步研究。