秦文婕，黃一倬，羅 瀟，錢旭紅，楊有軍

（1.華東理工大學(xué)藥學(xué)院,上海 200237；2.華東師范大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院,上海 200241）

菁染料家族有許多成員，包括菁染料（Cyanine dyes）、半菁染料（Hemicyanine dyes）、噁桑醇染料（Oxonol dyes）、部花菁染料（Merocyanine dyes）和方酸染料（Squaraine dyes）等.其中，吲哚七甲川菁染料（Cy7）是一類典型的菁染料，由于其優(yōu)異的光物理性質(zhì)而得到了廣泛關(guān)注，并被用于生物醫(yī)學(xué)影像與生物傳感領(lǐng)域.隨著成像技術(shù)的逐漸完善以及合成方法的成熟，大量基于Cy7的分子探針被開(kāi)發(fā)出來(lái).2016年，Peng等［1］總結(jié)了2010～2015年間報(bào)道的近紅外熒光分子探針.2021年，Dai等［2］總結(jié)了具有應(yīng)用于腫瘤診斷潛力的菁染料，2022年，Ren等［3］綜述了關(guān)于發(fā)射波長(zhǎng)在1000 nm以上用于成像的探針的研究，總結(jié)了最近幾年菁染料在生物成像方面的進(jìn)展.

本課題組［4］曾總結(jié)了熒光分子探針的通用型傳感分子機(jī)制（圖1）.包括光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET）、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）、共軛骨架調(diào)節(jié)、推拉電子修飾以及外圍電荷調(diào)節(jié)幾類.

Fig.1 Classic molecular probe design strategies[4]

本文根據(jù)染料熒光調(diào)控分子機(jī)制，對(duì)基于吲哚七甲川花菁染料的分子探針進(jìn)行了綜合評(píng)述.

1 光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移

光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（Photoinduced electron Transfer，PET）包含a-PET與d-PET兩種類型（圖2）.在a-PET體系中，一個(gè)熒光染料與一個(gè)電子供體相連.該電子供體的HOMO軌道能級(jí)介于染料的HOMOLUMO能級(jí)間.染料受激發(fā)進(jìn)入激發(fā)態(tài)，電子供體HOMO軌道的一個(gè)電子轉(zhuǎn)移至染料單電子占據(jù)的原HOMO軌道，形成一個(gè)染料自由基陰離子和供體的自由基陽(yáng)離子.這一過(guò)程導(dǎo)致染料熒光猝滅.在d-PET體系中，一個(gè)熒光染料與一個(gè)電子受體相連.該電子受體的LUMO軌道能級(jí)介于染料的HOMOLUMO能級(jí)間.染料進(jìn)入激發(fā)態(tài)后，染料單電子占據(jù)的原LUMO軌道的電子轉(zhuǎn)移至受體的LUMO空軌道，同樣導(dǎo)致熒光猝滅.分析物可以通過(guò)與識(shí)別位點(diǎn)的相互作用阻斷PET過(guò)程來(lái)誘導(dǎo)熒光恢復(fù)，即PET的“On-off”模式.相反，PET的“Off-on”模式通過(guò)熒光猝滅實(shí)現(xiàn)目標(biāo)的檢測(cè)［1］.

Fig.2 Schematic illustration of the a-PET and d-PET mechanism

1.1 PET類金屬離子探針

金屬螯合配體上常含多個(gè)氮、氧、硫等原子，可通過(guò)PET機(jī)制猝滅染料熒光.配體和金屬離子配位后，PET效應(yīng)受到抑制，染料熒光得到恢復(fù).利用這一機(jī)制，可開(kāi)發(fā)PET類金屬離子探針.

1992年，Strekowski等［5］在Cy7共軛鏈骨架中心引入六元環(huán)（圖3），不僅大大提高了Cy7的穩(wěn)定性，也增加了可修飾位點(diǎn).基于該結(jié)構(gòu)骨架，1996年，他們合成出結(jié)構(gòu)1和2［6］，并在1998年報(bào)道了結(jié)構(gòu)1在金屬檢測(cè)方面的應(yīng)用［7］.鄰羥基羧基是Al3+和Be2+離子的選擇性受體，在菁染料苯環(huán)上引入鄰羥基羧基，以檢測(cè)Al3+和Be2+.由于電荷從配體轉(zhuǎn)移到金屬離子上，干擾了熒光團(tuán)的共振結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致1與高濃度Al3+和Be2+離子結(jié)合時(shí)發(fā)生熒光猝滅.之后通過(guò)在中間位置上修飾響應(yīng)基團(tuán)開(kāi)發(fā)出各種金屬離子的檢測(cè)器，如Ozmen等［8］在2000年報(bào)道的第一個(gè)Cy7類鈣離子選擇性探針，通過(guò)引入特異性配體1，2-雙（2-氨基苯氧基）-乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸四鈉鹽（BAPTA）螯合鈣離子，782 nm處的熒光強(qiáng)度可增加4倍；Tang等開(kāi)發(fā)出了結(jié)構(gòu)3～6分別用于檢測(cè)鋅離子［9］、汞離子［10］、亞鐵離子［11］和銅離子［12］，這些探針都可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像.隨著成像技術(shù)的發(fā)展成熟，不少探針已應(yīng)用于活體成像，如亞銅離子檢測(cè)器9［13］和Qian等［14］開(kāi)發(fā)的兩個(gè)發(fā)射波長(zhǎng)超650 nm的鎘熒光探針10和11.

Fig.3 Molecular structures of metal ion fluorescent probes 1—12 based on PET mechanism

2009年，Achilefu等［15］報(bào)道了結(jié)構(gòu)12，這是第一個(gè)放射性核素衰變與熒光團(tuán)結(jié)合的分子系統(tǒng)，證明了放射性核素衰變可以改變有機(jī)染料的熒光性質(zhì).這種通過(guò)放射性核素的衰變來(lái)監(jiān)測(cè)熒光增強(qiáng)的新方法有多種潛在的應(yīng)用前景，如觀測(cè)核素衰變速度.此外，將放射性核素衰變與熒光增強(qiáng)相結(jié)合，可以為放射性核光學(xué)多模態(tài)生物成像提供一種獨(dú)特的互補(bǔ)信號(hào)機(jī)制.

1.2 PET類pH熒光探針

氮、氧原子的質(zhì)子化可大幅降低其供電子能力，進(jìn)而降低其作為PET電子供體的能力.因此利用含氮、氧原子基團(tuán)的質(zhì)子化和去質(zhì)子化可實(shí)現(xiàn)PET效應(yīng)的調(diào)控，從而開(kāi)發(fā)pH探針（圖4）.2007年，Tang等［16］合成了探針結(jié)構(gòu)13.該探針對(duì)pH=4.0～6.5范圍內(nèi)的H+變化有響應(yīng)，同時(shí)也可在10.5～11.8的pH范圍內(nèi)對(duì)H+作出響應(yīng).首次實(shí)現(xiàn)了在不同的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)下對(duì)不同pH范圍內(nèi)的H+進(jìn)行雙重測(cè)量.此外，它作為第一個(gè)用于細(xì)胞內(nèi)酸性pH成像的近紅外熒光探針，適用于研究?jī)?nèi)環(huán)境為酸性的細(xì)胞器，該探針也被成功用于活體成像.之后，該課題組［17］又開(kāi)發(fā)了一種對(duì)pH敏感的探針14，可對(duì)6.70～7.90范圍內(nèi)的微小pH波動(dòng)呈線性和快速響應(yīng).

2017年，Cai等［18］報(bào)道了一種具有光熱效應(yīng)的pH探針15，隨著pH值的增加（4.4～8.0）（圖4），探針吸收峰從637 nm轉(zhuǎn)移到792 nm，并且吸收強(qiáng)度增加，但熒光強(qiáng)度減弱.該探針不僅在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出高分辨率的光聲成像效果，也表現(xiàn)出有效的腫瘤光熱消融效果.2019年，Wu等［19］在花菁的中間碳上引入一個(gè)苯甲酰肼基團(tuán)，得到pH敏感的近紅外探針16，其在pH=7.0～9.0范圍內(nèi)熒光可增強(qiáng)10倍，該探針首次成功應(yīng)用在監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)基因糖尿病小鼠模型中急性傷口向慢性傷口發(fā)展過(guò)程中pH的變化.

Fig.4 Moleculars structure of pH fluorescent probes 13—16 based on PET mechanism(A),UV-Vis spectra and fluorescence spectra(Flu)of probe 15 in PBS,pH=4.4(B),UV-Vis spectra of probe 15 at various pH values in 20 mmol/L PBS buffer(C),emission spectra of probe 15 under increasing pH levels upon excitation at 637 nm(pH=4.4—8.0)(D)[18]

Fig.5 Molecular structures of ROS/N fluorescent probes 17—26 based on PET mechanism

1.3 PET類活性氧/氮熒光探針

多種對(duì)活性氧響應(yīng)的原子或基團(tuán)具有較高的電子云密度，可作為PET機(jī)制中的電子供體，如對(duì)一氧化氮響應(yīng)的鄰苯二胺，對(duì)活性氧響應(yīng)的鄰苯二酚、硫原子、硒原子等.與活性氧/氮（ROS/N）反應(yīng)之后，這些基團(tuán)變成吸電子基團(tuán)，PET效應(yīng)受阻，探針熒光恢復(fù).

2005年，Nagano等［20］通過(guò)引入鄰苯二胺作為一氧化氮（NO）響應(yīng)基團(tuán)得到了Turn-on型探針17和18（圖5），實(shí)現(xiàn)了對(duì)小鼠腎臟的體外NO成像.2011年，Tang等［21］利用組氨酸（His）咪唑環(huán)的1，4-環(huán)加成反應(yīng)，特異性清除1O2的性質(zhì)，合成了探針19以檢測(cè)1O2.探針可被1O2氧化，導(dǎo)致熒光恢復(fù).該探針能對(duì)1O2快速響應(yīng)且選擇性高，成功應(yīng)用于活細(xì)胞和組織中1O2的檢測(cè)和成像.該課題組［22］還利用硒（Se）在體內(nèi)參與氧化還原循環(huán)的性質(zhì)設(shè)計(jì)了ONOO-響應(yīng)的探針20，這是最早通過(guò)在Cy7骨架上引入硒原子以檢測(cè)ONOO-的探針.該探針可以被ONOO-氧化，被抗壞血酸（ASCH2）還原，氧化還原循環(huán)至少可以重復(fù)8次，氧化后的探針在770 nm處的熒光強(qiáng)度降低了5倍.他們還在RAW264.7細(xì)胞中成功實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞氧化還原周期的實(shí)時(shí)成像.類似的，Han等［23］也開(kāi)發(fā)了一種含硒的檢測(cè)ONOO-的探針21，該探針可被谷胱甘肽（GSH）還原，循環(huán)次數(shù)達(dá)5倍，熒光開(kāi)啟可增強(qiáng)23.3倍（圖5），量子產(chǎn)率從0.05增加到0.12.之后該課題組［24］又將碲（Te）引入到熒光團(tuán)22中，并將該探針成功應(yīng)用于細(xì)胞和小鼠ONOO-/GSH氧化還原穩(wěn)態(tài)變化的實(shí)時(shí)成像.該課題組在2012年還開(kāi)發(fā)了檢測(cè)過(guò)氧化氫（23）［25］和次溴酸（24，25）的探針［26］.探針23與過(guò)氧化氫反應(yīng)導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低，當(dāng)加入GSH到含有氧化型探針的PBS緩沖液中時(shí)，在10 min內(nèi)得到GSH偶聯(lián)物，熒光恢復(fù).該探針能夠在這些不同類型的細(xì)胞系中檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫和谷胱甘肽.探針24和25對(duì)次溴酸和抗壞血酸引起的氧化還原循環(huán)有響應(yīng)，他們利用這一性質(zhì)將探針成功應(yīng)用于連續(xù)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)次溴酸水平的變化.2016年，Chen等［27］設(shè)計(jì)并開(kāi)發(fā)了一種高選擇性和高靈敏度檢測(cè)次氯酸和髓過(guò)氧化物酶（MPO）的熒光探針26，其（甲基硫代）-苯胺基部分可被次氯酸氧化，使熒光開(kāi)啟.該探針可靶向線粒體，用于檢測(cè)生物樣品中次氯酸和MPO的活性.

1.4 PET類硫化物熒光探針

體內(nèi)的硫醇化合物［如半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）和GSH］在生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用.利用其親核性或還原性，可選擇性切斷探針?lè)肿拥腜ET電子供體結(jié)構(gòu)片段，用以開(kāi)發(fā)特異性檢測(cè)探針.如2012年，受Se—N鍵很容易被硫醇裂解的啟發(fā)，Wang等［28］引入強(qiáng)吸電子的2-硝基苯基硒烷和3-（三氟甲基）苯基硒烷作為電子受體（圖6），猝滅探針27和28的熒光，隨著GSH的加入，熒光強(qiáng)度（λem=750 nm）顯著增加.該探針在pH=4.0～8.6范圍內(nèi)對(duì)非蛋白硫醇和蛋白硫醇具有較高的反應(yīng)性，可用于檢測(cè)活細(xì)胞和組織中不同水平的硫醇.2013年，Tang等［29］開(kāi)發(fā)了另外一種含Se—N的檢測(cè)GSH的探針29，該探針的熒光可被過(guò)氧化氫恢復(fù)，這種循環(huán)至少可進(jìn)行4次.該探針還成功地應(yīng)用于監(jiān)測(cè)斑馬魚(yú)幼苗傷口邊緣過(guò)氧化氫的變化.之后Kim等［30］和Zhang等［31］分別報(bào)道了兩種生物硫醇檢測(cè)探針30和31，皆成功應(yīng)用于細(xì)胞成像.

Fig.6 Molecular structures of fluorescent probes 27—37 for thiols based on PET mechanism

2015年，Yoon等［32］報(bào)道了一種選擇性檢測(cè)GSH的熒光探針32.該探針與Zhang等［31］采用了完全相同的設(shè)計(jì)策略.但由于哌嗪環(huán)的椅形構(gòu)象和S—N鍵的距離與其它對(duì)硫醇缺乏選擇性的探針不同，且GSH和其它硫醇之間也存在結(jié)構(gòu)差異，該探針具有GSH選擇性.又如2018年，Lee等［33］開(kāi)發(fā)的探針33與GSH作用后在818 nm處發(fā)出強(qiáng)熒光，而Cys/Hcy只在807 nm處有弱熒光.同年，Yoon等［34］開(kāi)發(fā)了兩種新的基于花菁的熒光探針34和35.探針34含有兩個(gè)菁基團(tuán)，由對(duì)苯硫醚鍵連接.探針34相鄰的兩個(gè)花菁基團(tuán)自猝滅，GSH誘導(dǎo)的硫醚鍵斷裂可恢復(fù)探針34的熒光.探針35具有3，5-三氟甲基苯硫醇部分，該部分由于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移效應(yīng)導(dǎo)致熒光猝滅，同樣，GSH導(dǎo)致3，5-三氟甲基苯硫醇的硫醇斷裂，并恢復(fù)熒光，對(duì)其它GSH無(wú)響應(yīng).

利用不同生物硫醇與熒光團(tuán)反應(yīng)活性的不同，不少研究選擇合適的熒光團(tuán)修飾在花菁骨架上，構(gòu)建了雙通道檢測(cè)器，較單通道熒光探針更有利于消除自吸收的影響.2019年，Yuan等［35］設(shè)計(jì)并合成了一種雙通道熒光探針36，該探針由兩個(gè)熒光團(tuán)組成，可以很好地檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)源性GSH.同年，Yin等［36］引入萘酰亞胺到熒光團(tuán)中，得到可用于谷胱甘肽體內(nèi)成像的雙通道探針37.與GSH反應(yīng)后，形成親核取代產(chǎn)物和硫解產(chǎn)物，并分別進(jìn)行雙光子成像和近紅外成像.

2012年，Zhang等［37］受硫化鈉可以還原硝基的啟發(fā)，設(shè)計(jì)并合成了一種含有硝基的新型熒光探針38（圖7），用于細(xì)胞內(nèi)硫化氫檢測(cè).該探針在pH為4.2～8.2的范圍內(nèi)穩(wěn)定.在755和809 nm處分別表現(xiàn)出最大的吸收和發(fā)射.探針38與硫化氫反應(yīng)后熒光強(qiáng)度增加了12.7倍，量子產(chǎn)率從0.05增加到0.11.2017年，Li等［38］通過(guò)哌嗪?jiǎn)卧獙BD組裝到花菁骨架上開(kāi)發(fā)了一種新型探針39.由于硝基取代的苯并呋咱（NBD）部分和花菁骨架之間有效的PET過(guò)程，該探針在796 nm處顯示非常微弱的熒光，與H2S反應(yīng)后，PET過(guò)程受阻，熒光強(qiáng)度增加87倍，探針對(duì)硫化氫的檢測(cè)限為39.6 nmol/L.利用該探針還實(shí)現(xiàn)了在小鼠肝臟中的H2S成像.

Fig.7 Molecular structures of H2S fluorescent probes 38 and 39

1.5 PET類硝基還原酶熒光探針

硝基咪唑具有很強(qiáng)的親電性，可作為d-PET分子探針中的電子受體.腫瘤缺氧微環(huán)境導(dǎo)致硝基還原酶的活性提高，可實(shí)現(xiàn)硝基的選擇性還原，從而抑制d-PET效應(yīng)，恢復(fù)探針熒光.此類探針在檢測(cè)腫瘤缺氧環(huán)境中受到廣泛關(guān)注.2012年，Nagasawa等［39］報(bào)道了一種檢測(cè)腫瘤缺氧環(huán)境的探針40，這是首個(gè)用于觀察腫瘤缺氧狀態(tài)的熒光探針（圖8）.為了提高探針40的選擇性，在后續(xù)的報(bào)道中他們?cè)O(shè)計(jì)并合成了一種新的近紅外（NIR）熒光探針41，并用于生物體內(nèi)腫瘤缺氧環(huán)境成像［40］.同樣，Tang等［41］利用硝基咪唑的親電性得到了探針42，并將其成功應(yīng)用于研究腫瘤發(fā)展進(jìn)程與細(xì)胞內(nèi)缺氧水平之間的關(guān)系.另外，Li等［42］設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了一種含硝基苯的探針43，其硝基被還原后，電子重排可脫去酰胺部分，開(kāi)啟熒光.

Fig.8 Molecular structures of nitroreductase fluorescent probes 40—43 based on PET mechanism

光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移機(jī)制是一類經(jīng)典的熒光探針?lè)肿釉O(shè)計(jì)機(jī)制，可被用于設(shè)計(jì)基于Cy7染料骨架的熒光增強(qiáng)或減弱型分子探針，常用的檢測(cè)底物和識(shí)別基團(tuán)的構(gòu)效關(guān)系研究也已比較成熟.但由于基于PET機(jī)制的探針無(wú)法實(shí)現(xiàn)熒光的完全猝滅，使得探針本身總是帶有一定的背景熒光，因此，探針的檢測(cè)靈敏度還需進(jìn)一步提高.同時(shí)，由于Cy7吸收波長(zhǎng)在近紅外區(qū)間，HOMO-LOMO能級(jí)差小，不易通過(guò)分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移猝滅熒光，設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)新型的響應(yīng)基團(tuán)實(shí)現(xiàn)熒光猝滅也具有挑戰(zhàn)性.

2 共軛骨架的破壞與恢復(fù)

根據(jù)關(guān)于PET過(guò)程的Weller方程，Cy7染料母核的HOMO-LUMO間隙很小，激發(fā)光引入近紅外體系的能量太小，不易通過(guò)分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移猝滅熒光.因此，很難實(shí)現(xiàn)高效的PET猝滅熒光.為了進(jìn)一步提高分子探針的檢測(cè)靈敏度，開(kāi)發(fā)了基于Cy7共軛骨架破壞和恢復(fù)的分子探針，可實(shí)現(xiàn)熒光的完全開(kāi)啟或關(guān)閉，極大提高了檢測(cè)靈敏度.同時(shí)，共軛骨架的破壞與恢復(fù)必然伴隨紫外-可見(jiàn)吸收的顯著改變，可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)肉眼檢測(cè).

2.1 中位內(nèi)酯或內(nèi)酰胺化

在Cy7染料的中位引入內(nèi)酯或內(nèi)酰胺基團(tuán)，可實(shí)現(xiàn)染料共軛鏈的破壞，使得探針完全不發(fā)熒光（圖9）.受特定底物（如質(zhì)子和金屬離子等）激活，內(nèi)酯或內(nèi)酰胺開(kāi)環(huán)，染料共軛骨架恢復(fù)，發(fā)出熒光.相較于傳統(tǒng)的調(diào)節(jié)七甲川花菁熒光的PET機(jī)制［43］，這一利用螺環(huán)可逆開(kāi)關(guān)的策略可提高底物檢測(cè)的靈敏度.

Fig.9 Schematic diagram of Cy7-based fluorescent probe via spiro-cyclization

2015年，He等［44］提出螺旋化來(lái)開(kāi)啟熒光，設(shè)計(jì)合成了兩個(gè)Turn-on型熒光探針44和45，并用于活細(xì)胞的pH（圖10）和活體動(dòng)物的Hg2+成像.在該策略的啟發(fā)下，2017年，Citterio等［45］合成了46和47兩個(gè)探針?lè)肿?，分別對(duì)Hg2+和Zn2+/Cd2+進(jìn)行檢測(cè).

Fig.10 Molecular structures of several pH and metal ion probes 44—47 based on spiro-cyclization(A),pH-dependence of the fluorescence emission spectra of probe 44[10μmol/L,V(PBS)/V(DMF)=95∶5]upon excitation at 745 nm(B),representative fluorescence images of the mouse injected with probe 44 during LPS-mediated inflammatory response in vivo(C)[44]

2.2 給體-雙受體菁染料

2011年，Shabat等［46］報(bào)告了一種基于給體-雙受體（A-D-A）菁染料（QCy7）的新型探針設(shè)計(jì)平臺(tái)（圖11），將Cy7的染料共軛骨架中的一個(gè)單鍵和雙鍵嵌入苯環(huán)，QCy7含有一個(gè)受保護(hù)的作為潛在供體的官能團(tuán)和兩個(gè)帶正電荷的氮受體.在特定檢測(cè)底物的激活下，保護(hù)基團(tuán)離去，隨后發(fā)生分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移，生成醌，同時(shí)，恢復(fù)Cy7的推拉電子共軛體系，從而發(fā)射熒光.巧妙實(shí)現(xiàn)了菁染料的增強(qiáng)型紫外-可見(jiàn)和熒光檢測(cè).唯一遺憾的是，產(chǎn)物的吸收波長(zhǎng)相比Cy7類花菁染料有較明顯的藍(lán)移.

Fig.11 Schematic diagram of QCy7-type fluorescent probe

2.2.1 ROS 該類探針通過(guò)引入活性氧響應(yīng)基團(tuán)作為離去基團(tuán)，在與底物作用后，分子內(nèi)可以發(fā)生電荷重排，恢復(fù)D-π-A結(jié)構(gòu)，使熒光開(kāi)啟.基于該策略，Shabat等［46］率先設(shè)計(jì)了H2O2活化的QCy7熒光探針48（圖12），將H2O2觸發(fā)基團(tuán)苯基硼酸通過(guò)醚鍵連接到QCy7的磺化衍生物上.當(dāng)觸發(fā)裂解反應(yīng)保護(hù)基團(tuán)離去時(shí)，探針會(huì)形成一個(gè)去保護(hù)的酚類活性給體，通過(guò)一對(duì)π電子的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移，重建QCy7，形成了電子離域之間的推拉共軛體系，發(fā)射熒光.在H2O2存在下，探針48溶液逐漸恢復(fù)近紅外熒光，該探針還具有對(duì)外源性和內(nèi)源性H2O2的可視化能力.2016年，Tang等［47］通過(guò)構(gòu)造五元環(huán)保護(hù)雙羥基實(shí)現(xiàn)了pH和H2O2雙響應(yīng)的QCy7熒光探針49，實(shí)現(xiàn)了成像引導(dǎo)下的蛋白在腫瘤區(qū)域的傳遞.

Fig.12 Molecular structures of ROS/N probes 48—54 based on QCy7

Fig.13 Molecular structures of metal ion probes 55—57 based on QCy7

之后，基于類似的思路，通過(guò)改變熒光團(tuán)上對(duì)活性物質(zhì)響應(yīng)的觸發(fā)位點(diǎn)，領(lǐng)域內(nèi)開(kāi)發(fā)了一系列探針用于檢測(cè)不同種類的活性氧.如Tang等［48］在骨架上引入可以選擇性識(shí)別臭氧（O3）的基團(tuán)（3-丁烯基），開(kāi)發(fā)了探針50，首次實(shí)現(xiàn)了抑郁小鼠大腦中臭氧的成像.Zhang等［49］引入烯丙基醚作為觸發(fā)位點(diǎn)，開(kāi)發(fā)了檢測(cè)一氧化碳（CO）的比例型熒光探針51.Wang等［50］開(kāi)發(fā)的親水性熒光探針52和53，其熒光可被次氯酸（HClO）開(kāi)啟，是快速、敏感地檢測(cè)內(nèi)源性和外源性HClO的潛在工具.他們選擇保護(hù)基團(tuán)N，N-二甲基硫代氨基甲酸酯（DMTC）作為響應(yīng)基團(tuán)，通過(guò)降低π-電子共軛來(lái)猝滅熒光.在次氯酸的存在下，DMTC裂解離去，釋放染料并恢復(fù)熒光信號(hào).2018年，Ma等［51］報(bào)道了首個(gè)敏感型的羥基自由基探針54，當(dāng)探針與羥基自由基反應(yīng)時(shí)，在653 nm處的熒光增強(qiáng)倍數(shù)約為122倍，被成功應(yīng)用于監(jiān)測(cè)鐵自氧化過(guò)程中微量羥基自由基的產(chǎn)生.

2.2.2 金屬離子 2015年，Govindaraju等［52］報(bào)道了一種亞銅離子探針55，選擇三（4-吡啶基）胺作為亞銅離子響應(yīng)基團(tuán)（圖13），在探針與亞銅離子絡(luò)合后，探針55熒光開(kāi)啟.該探針被成功用于生物液體中的Cu+池的近紅外熒光檢測(cè)和體內(nèi)成像應(yīng)用.2019年，Hu等［53］合成了一種近紅外的Pd2+探針56，該探針在Pd2+的存在下表現(xiàn)出明顯的熒光增強(qiáng)，檢測(cè)限低至0.52μmol/L.該探針熒光強(qiáng)度的變化可能是因?yàn)镻d2+誘導(dǎo)的丙炔醚鍵裂解，使探針56在光照射下，轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酮結(jié)構(gòu)，發(fā)射出熒光.該探針可用于含鈀催化劑Pd2+的成像.2019年，Tang等［54］報(bào)道了一種新的近紅外熒光探針57，F(xiàn)e2+將與探針57中的N4O配體結(jié)合，并在O2存在下導(dǎo)致C—O鍵斷裂，從而恢復(fù)QCy7共軛結(jié)構(gòu)發(fā)出熒光.它可以對(duì)在藥物誘導(dǎo)的肝損傷中的Fe2+進(jìn)行成像.

2.2.3 硫化物 2013年，Govindaraju等［55］開(kāi)發(fā)了一種水溶性的檢測(cè)氧化型谷胱甘肽（GSSG）和GSH氧化還原過(guò)程的探針58（圖14），其發(fā)射波長(zhǎng)為700 nm.該分子探針很容易與硫醇，特別是GSH發(fā)生反應(yīng)，對(duì)pH穩(wěn)定.可用于監(jiān)測(cè)谷胱甘肽還原酶的活性，并作為評(píng)估氧化應(yīng)激水平的工具.2019年，Chen等［56］設(shè)計(jì)并合成了兩種近紅外熒光探針59和60，用于實(shí)時(shí)成像和評(píng)估線粒體GSH在活細(xì)胞和體內(nèi)的保護(hù)作用.探針59與GSH反應(yīng)后在728 nm處表現(xiàn)出熒光“開(kāi)啟”，被成功應(yīng)用于小鼠GSH成像.

Fig.14 Molecular structures of thiols probes 58—63 based on QCy7

Fig.15 Molecular structures of thiols probes 64—71 based on QCy7

2019年，Zhao等［57］開(kāi)發(fā)了用于檢測(cè)硫化氫的熒光探針61和62.水溶性熒光探針61在沒(méi)有有機(jī)溶劑或表面活性劑的幫助下與硫化氫反應(yīng)，熒光增強(qiáng)了115倍，檢測(cè)限為11 nmol/L.細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)表明，探針61具有細(xì)胞滲透性，能夠敏感地檢測(cè)溶酶體中的硫化氫.2020年，Yuan等［58］設(shè)計(jì)合成了探針63并用于檢測(cè)H2S.隨著H2S含量的增加，以394 nm為中心的最大吸收峰逐漸減小，在480和610 nm處的吸收峰逐漸增加.結(jié)果表明，該探針的熒光強(qiáng)度在715 nm處顯著提高了25倍，其量子產(chǎn)率為0.107.這兩個(gè)探針均成功應(yīng)用于小鼠體內(nèi)硫化氫的檢測(cè).

2.2.4 酶 2013年，Tung等［59］報(bào)道了一種熒光探針64（圖15），用于檢測(cè)溶液中的β-Gal酶活性，在680 nm處有110倍的熒光開(kāi)啟；將其乙?；蟮玫教结?5，可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像.與溶液中檢測(cè)酶活性不同，由于生物硫醇的作用，酶水解得到的產(chǎn)物不同，QCy7的核心結(jié)構(gòu)被破壞，在560 nm（λex=530 nm）左右發(fā)射熒光.同年，Lepenies等［60］報(bào)道了類似結(jié)構(gòu)的探針66并用于檢測(cè)細(xì)菌.

2013年，Zhang等［61］設(shè)計(jì)并合成了一種檢測(cè)硝基還原酶（NTR）活性的探針67.在與NTR反應(yīng)后，硝基芐基部分的硝基被還原為氨基，在708 nm處熒光開(kāi)啟.該氧化還原誘導(dǎo)的NIR熒光探針已成功應(yīng)用于生理?xiàng)l件下高選擇性的NTR活性檢測(cè).2016年，Hecht等［62］開(kāi)發(fā)了類似的線粒體靶向的NTR探針68，并成功用于細(xì)胞成像.

2018年，Chen等［63］合成了一種由熒光團(tuán)QCy7和堿性磷酸酶（ALP）識(shí)別基團(tuán)磷酸單酯組成的熒光探針69.探針69主要分布在線粒體，可用于量化ALP在8種不同細(xì)胞系中的表達(dá)水平.由于其較高的成像分辨率和深層組織穿透能力，可以區(qū)分腫瘤小鼠和正常裸鼠體內(nèi)ALP的表達(dá)水平，具有應(yīng)用于研究ALP在疾病診斷中的功能的潛力.

2022年，Su等［64］報(bào)道了兩個(gè)選擇性檢測(cè)和可視化NAD（P）H醌脫氫酶（NQO）的探針70和71.通過(guò)引入兩個(gè)親水磺酸基，熒光強(qiáng)度得到顯著提高.探針71已被應(yīng)用于活細(xì)胞內(nèi)源性NQO的高對(duì)比度成像，并進(jìn)一步用于體內(nèi)無(wú)創(chuàng)成像.

2.2.5 其它 2016年，Devaraj等［65］還開(kāi)發(fā)了一種苯基乙烯基醚的QCy7探針72，用于RNA分析（圖16）.經(jīng)四嗪驅(qū)動(dòng)的生物正交反應(yīng)脫保護(hù)后，觀察到的熒光比探針72增加了70倍.受益于兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)之間的空間鄰近性，生物分子（如mRNA）可以有效地加速微摩爾水平的反應(yīng).通過(guò)制備探針72和四嗪-磺酸基-活性酯（NHS）偶聯(lián)物，可用于在體外和CHO細(xì)胞中檢測(cè)目標(biāo)RNA.2021年，F(xiàn)eng等［66］報(bào)道了一種近紅外熒光探針73，它可以有效地檢測(cè)活細(xì)胞和小鼠體內(nèi)的CORM-3（CO供體）.與CORM-3反應(yīng)后，在600 nm處熒光信號(hào)降低，743 nm處產(chǎn)生的熒光信號(hào)增加，可對(duì)CORM-3進(jìn)行比率檢測(cè).

Fig.16 Molecular structures of RNA or CO probes 72 and 73 based on QCy7

2.3 氧化破壞/恢復(fù)共軛鏈

2.3.1 氧化恢復(fù)共軛鏈 利用Cy7染料骨架的氧化恢復(fù)，可以實(shí)現(xiàn)無(wú)背景Turn-on型熒光探針的開(kāi)發(fā)，目前，基于此類巧妙設(shè)計(jì)機(jī)制的探針還很有限.2008年，Tang等［67］開(kāi)發(fā)了一種用于觀察活細(xì)胞中的脂質(zhì)氫過(guò)氧化物（ROOH）的選擇性探針74（圖17），氧化磷原子引起碳磷鍵斷裂，同時(shí)恢復(fù)Cy7染料骨架.該探針的最大吸收和最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)分別為747和770 nm，在pH=7.4～7.8范圍內(nèi)穩(wěn)定.探針與過(guò)氧亞油酸甲酯（MeLOOH）反應(yīng)后，熒光量子產(chǎn)率由0.058增加到0.64，熒光強(qiáng)度與MeLOOH的濃度成正比，可用于ROOH的定量檢測(cè).

Fig.17 Molecular structure of ROOH probe 74

2.3.2 氧化破壞共軛鏈 強(qiáng)氧化性物質(zhì)（如HClO和過(guò)氧亞硝酸根等）可以氧化花菁共軛鏈的雙鍵生成環(huán)氧化物，或進(jìn)一步發(fā)生碳碳鍵斷裂生成烯醛結(jié)構(gòu)，破壞Cy7的推拉電子體系從而猝滅熒光（圖18）.基于這一氧化破壞共軛鏈機(jī)制，研究者開(kāi)發(fā)了不少活性氧熒光探針.

Fig.18 Detection mechanism of Cy7 conjugation disruption by ROS

2013年，Han等［68］開(kāi)發(fā)的HOCl比率型（I566/I780）探針75～79，分別在600～800 nm之間有最大吸收峰，與HOCl作用后，在560 nm處出現(xiàn)新的吸收峰.探針75具有大的Stokes位移，它被成功地應(yīng)用于活細(xì)胞的次氯酸成像.之后Wang等［69，70］陸續(xù)報(bào)道了兩種檢測(cè)HOCl的探針80和81并成功用于細(xì)胞成像（圖19）.

Fig.19 Molecular structures of hypochlorous acid fluorescent probes 75—81

2018年，Dong等［71］設(shè)計(jì)并合成了一系列基于Cy7的熒光比率探針來(lái)檢測(cè)肺中的次氯酸（圖20）.他們發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)鏈和氨基都是探針實(shí)現(xiàn)肺靶向作用的重要部分，具有長(zhǎng)疏水性脂鏈和親水性氨基的探針82在小鼠肺中有較高的積累，探針85在脾臟中的攝取量高于其它器官，具有短脂鏈的探針87在肝臟中分布較高，與吲哚菁綠（ICG）相似.因此，選擇了探針82進(jìn)行活體實(shí)驗(yàn)，并證明了探針82能夠在小鼠肺中捕獲脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的次氯酸.這些發(fā)現(xiàn)可用于設(shè)計(jì)新的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)HClO探針.

Fig.20 Molecular structures of hypochlorous acid fluorescent probes 82—87

2019年，Li等［72］開(kāi)發(fā)了可用于水介質(zhì)次氯酸鹽（測(cè)試體系pH=4）的選擇性檢測(cè)器探針88（圖21）.其可與次氯酸根通過(guò)氧化裂解反應(yīng)破壞共軛鏈.2020年，Yi等［73］開(kāi)發(fā)了一種檢測(cè)HClO的雙光子吸收，三通道（560/650/780 nm）比率型探針89.尼羅紅部分對(duì)HClO不敏感，可作為內(nèi)標(biāo).當(dāng)HClO/ClO-濃度小于20μmol/L時(shí)，3個(gè)熒光峰（560/650/780 nm）均呈下降趨勢(shì)，特別是在780 nm處的熒光幾乎完全猝滅.進(jìn)一步增加HClO/ClO-濃度，在560 nm處的發(fā)射迅速下降，但在650 nm處同時(shí)觀察到約10倍的熒光增強(qiáng).因此，利用探針89的兩個(gè)不同熒光峰（I560/I650和I650/I780）之間熒光強(qiáng)度的比值變化來(lái)實(shí)現(xiàn)HClO/ClO-濃度的準(zhǔn)確定量（圖21）.探針89首次實(shí)現(xiàn)了在活體動(dòng)物中對(duì)HClO/ClO-濃度進(jìn)行比率檢測(cè).

Fig.21 Molecular structures of hypochlorous acid fluorescent probes 88 and 89

2021年，Xing等［74］設(shè)計(jì)了一種獨(dú)特的雙波長(zhǎng)近紅外探針90（圖22），用于同時(shí)監(jiān)測(cè)活性氧和活性氮的體內(nèi)外變化，并成功應(yīng)用于監(jiān)測(cè)活細(xì)胞和活小鼠細(xì)菌感染過(guò)程中氧化和亞硝化應(yīng)激過(guò)程.其檢測(cè)機(jī)制為探針的Cy5部分被超氧陰離子自由基或羥基自由基氧化恢復(fù)菁染料推拉電子體系，在660 nm處開(kāi)啟熒光.而過(guò)氧亞硝酸鹽或次氯酸鹽（ONOO-，ClO-）誘導(dǎo)的Cy7結(jié)構(gòu)被氧化降解導(dǎo)致800 nm處的熒光降低.可通過(guò)不同波長(zhǎng)處熒光變化來(lái)分析細(xì)菌感染過(guò)程中自由基種類的變化.

Fig.22 Molecular structure and sensing mechanism of ROS probe 90

基于Cy7共軛骨架破壞和恢復(fù)的分子探針設(shè)計(jì)策略，可以實(shí)現(xiàn)熒光的完全開(kāi)啟或關(guān)閉.通過(guò)消除探針本身的背景干擾，可以明顯提高探針的檢測(cè)靈敏度，在生物應(yīng)用中表現(xiàn)出較大的優(yōu)勢(shì).在這一策略中被廣泛使用的方法主要是基于QCy7的骨架恢復(fù)和基于ROS的骨架破壞，而其它方法的檢測(cè)底物還較少，有望通過(guò)分子機(jī)制的創(chuàng)新進(jìn)行進(jìn)一步拓展.

3 連接在染料共軛鏈上外圍基團(tuán)吸電子和供電子能力的調(diào)控

1992年，Patonay等［75］開(kāi)發(fā)了在共軛鏈引入一個(gè)剛性氯環(huán)己烯環(huán)的七甲基菁染料，可增加光穩(wěn)定性，提高熒光量子產(chǎn)率，這種結(jié)構(gòu)也為染料在中心環(huán)上的化學(xué)取代提供了一個(gè)反應(yīng)位點(diǎn).近年來(lái)，通過(guò)中心位置的親核取代反應(yīng)獲得了許多作為生物傳感器和熒光探針的七甲基菁染料.2005年，Peng等［76］發(fā)現(xiàn)一種新的花菁類染料91（圖23），在七甲基花菁骨架中間位置引入氨基烷基，由于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)，染料具有更大的斯托克斯位移和更強(qiáng)的熒光，更適合用作熒光探針.2006年，該團(tuán)隊(duì)［77］報(bào)道的3H-吲哚的N取代對(duì)染料的光穩(wěn)定性有很大的影響，在3H-吲哚環(huán)N原子上引入芐基可獲得更高的光穩(wěn)定性；引入給電子基團(tuán)比吸電子基團(tuán)有利于獲得更大的光漂白抗性探針92～95.

Fig.23 Molecular structures of modified Cy7 skeletons 91—95

在此結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)出一系列花菁類染料，通過(guò)改變花菁染料骨架中間位置的取代基團(tuán)，來(lái)改變發(fā)射波長(zhǎng)，用于傳感.在近紅外染料中，胺取代的Cy7通過(guò)修飾具有明確受體的氨基，導(dǎo)致分子內(nèi)部電荷轉(zhuǎn)移，被證明是設(shè)計(jì)近紅外探針的理想選擇，這種類型花菁的光物理性質(zhì)高度依賴于骨架中位共軛外圍基團(tuán)的電子密度.

3.1 金屬離子

2002年，Patonay等［78］選擇冠醚為鋰離子（Li+）響應(yīng)基團(tuán)得到傳感器96（JCM-15C5）（圖24）.探針在乙腈中的發(fā)射波長(zhǎng)為799 nm.在乙腈溶液中溶劑化的Li+與冠醚腔體相適配，供電子能力降低，發(fā)生熒光猝滅.JCM-15C5可用于痕量金屬的測(cè)定.2006年，Nagano等［79］報(bào)道了首例鋅離子（Zn2+）比例型探針97（DIPCY），胺取代的Cy7作為近紅外熒光團(tuán)，二-（2-吡啶甲基）胺（DPEN）部分作為金屬螯合劑.與金屬離子配位后，DPEN基團(tuán)的電子密度降低，降低了胺在熒光團(tuán)中的給電子能力.隨著Zn2+濃度的升高，DIPCY在非離子兩性（HEPES）緩沖液中的吸收峰紅移44 nm（627～671 nm），并在760 nm處熒光增強(qiáng)，但過(guò)量的Co2+和Cu2+對(duì)Zn2+的檢測(cè)有一定的干擾.利用相似的機(jī)理，2008年，Liu等［80］在花菁骨架上引入Hg2+螯合劑二硫二氧單雜大環(huán)得到Hg2+比率型探針98，其在777 nm處的熒光可被Hg2+猝滅.

Fig.24 Molecular structures of probes 97 and 98 for metal ions detection

除Hg2+外，甲基汞離子（MeHg+）也因其高毒性而成為備受關(guān)注的檢測(cè)對(duì)象.Guo等［81］合成了3個(gè)Hg2+和MeHg+的比值傳感器，分別為探針99～101（圖25）.這些傳感器對(duì)Hg2+和MeHg+均顯示出雙激發(fā)（A810nm/A670nm）和雙發(fā)射（F830nm/F780nm）的比例響應(yīng).這種變化是由Hg2+和MeHg+促進(jìn)環(huán)化過(guò)程引起的.取代基（仲胺、咪唑啉、叔胺）的給電子能力下降，大大降低了分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移過(guò)程的效率，吸收光譜和發(fā)射光譜出現(xiàn)了較大的紅移.2013年，Li等［82］將硫脲亞基與Cy7結(jié)合得到探針102，在MeHg+的作用下，探針?lè)肿影l(fā)生環(huán)化反應(yīng)，吸收光譜發(fā)生紅移.

Fig.25 Molecular structure of probes 99—102 for detecting metal ions

3.2 硫化物

在Cy7骨架中間位置共價(jià)連接硫化物響應(yīng)基團(tuán)，硫化物與響應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)后，花菁染料中位的N/O共價(jià)連接的熒光調(diào)節(jié)劑通過(guò)分子內(nèi)或分子間親核反應(yīng)離去，從而改變外圍基團(tuán)的供電子能力，來(lái)改變發(fā)射波長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞或體內(nèi)成像.

Fig.26 Molecular structure of sulfide cation fluorescent probe 103

2011年，Cao等［83］基于過(guò)渡金屬置換策略構(gòu)建了首個(gè)硫化物陰離子近紅外熒光傳感器103（圖26）.傳感系統(tǒng)由菁染料、哌嗪連接劑、8-氨基喹啉配體和Cu2+組成.銅離子可以使游離的探針在pH=7.0的HEPES緩沖液/乙醇溶液（25 mmol/L，體積比=6∶4）中吸收光譜發(fā)生明顯紅移（78 nm），同時(shí)近紅外染料探針103的熒光幾乎可以被Cu2+完全猝滅，在Cu2+與硫化物陰離子形成穩(wěn)定的配合物后，染料探針103被釋放，794 nm處熒光開(kāi)啟，觀察到高達(dá)27倍的熒光增強(qiáng).該傳感器在乙醇水溶液中具有大的近紅外熒光開(kāi)啟信號(hào)、高靈敏度和高選擇性.過(guò)渡金屬基置換策略為目標(biāo)陰離子檢測(cè)探針的開(kāi)發(fā)開(kāi)辟了一條新的途徑.

2016年，Chen等［84］開(kāi)發(fā)了Cy7骨架和氨基甲酸酯連接鏈的Cy-Dise探針104（圖27）.由于半胱氨酸氫過(guò)硫化物Cys-SSH具有低pKa特性，在中性pH條件下能夠形成親核陰離子，進(jìn)攻Cy-Dise的Se—Se鍵，導(dǎo)致氮的脫保護(hù)和發(fā)射波長(zhǎng)的藍(lán)移（797～749 nm）.Cy-Dise中半乳糖基團(tuán)的存在使其能夠靶向肝臟，用于BALB/c小鼠的深部組織比率成像.對(duì)Spraque-Dawley（SD）大鼠（Walker-256腫瘤的正常和異種移植物模型）的檢查進(jìn)一步表明了探針在肝臟中檢測(cè)Cys-SSH的潛在應(yīng)用.

Fig.27 Sensing mechanism of probe 104 for Cys-SSH(A),dose dependent fluorescent emission spectra of probe 104 response to Gys-SSH(left:λex=730 nm;right:λex=614 nm)(B)[84]

他們基于這個(gè)思路，開(kāi)發(fā)了一系列檢測(cè)硫化物的分子探針，實(shí)現(xiàn)了在體硫化物成像（圖28）.之后基于類似的思路，通過(guò)改變熒光調(diào)節(jié)劑，開(kāi)發(fā)了探針105～107，利用2，4-二硝基苯磺酰（DNBS）［85］、疊氮基［86］、三氟甲磺酰胺［87］修飾花菁骨架中間位置，實(shí)現(xiàn)了超氧陰離子和多硫化氫的成像.

Fig.28 Molecular structure of sulfide fluorescent probes 105—107

除硫化物外，其它小分子（如神經(jīng)毒劑）的檢測(cè)也可以利用該機(jī)制.Hu等［88］報(bào)告了一種用于檢測(cè)神經(jīng)毒劑的探針108（圖29）.加入神經(jīng)毒劑模擬模型二乙氧基氯磷酸鹽（DCP）后，吸收峰紅移（615～784 nm），溶液顏色由藍(lán)色變?yōu)榫G色.Chen等［89］利用類似的傳感機(jī)制開(kāi)發(fā)了一種單胺氧化酶成像探針109.該探針具有氨丙基氨基甲酸酯連接物，可以選擇性地檢測(cè)單胺氧化酶，導(dǎo)致750/803 nm熒光比值變化.該探針可用于評(píng)估MAO-B在小鼠衰老模型中對(duì)氧化應(yīng)激的貢獻(xiàn).2018年，該團(tuán)隊(duì)［89］開(kāi)發(fā)了一種花青素探針Mito-Cy-Sec（110），利用丙烯酰胺部分對(duì)硒半胱氨酸進(jìn)行成像.Zhou等［90］報(bào)道了一種基于控制熒光開(kāi)關(guān)機(jī)制的磷酸鹽離子近紅外化學(xué)傳感器111.

Fig.29 Molecular structures of small biomolecule detection probes 108—111

3.3 ROS

根據(jù)上述機(jī)制也可以開(kāi)發(fā)用于活性氧檢測(cè)的探針.2013年，Jiang等［91］基于氨基甲酸酯化學(xué)特異性裂解構(gòu)建近紅外比例熒光探針CyNB（112）用于H2O2的檢測(cè)（圖30）.一個(gè)吸電子的氨基甲酸酯基團(tuán)修飾Cy7的胺取代基，可以有效地降低胺的電子密度，用特定的分析物觸發(fā)氨基甲酸酯基團(tuán)裂解過(guò)程，釋放CyNB的近紅外染料，從而獲得顯著的比率熒光信號(hào).

Fig.30 Detection mechanism of probe 112 for H2O2

Fig.31 Sensing mechanism of probe 113 for hypochlorous acid(A),UV-Vis absorption spectra(B)and fluorescence emission spectra(C)of probe 113 response to HOCl[92]

線粒體是次氯酸鹽（OCl-）產(chǎn)生的主要部位.OCl-水平異常會(huì)引起氧化還原失衡和線粒體功能的喪失.Lin等［92］以菁染料作為熒光發(fā)射器，異硫氰酸苯酯基團(tuán)的硫原子作為OCl-的特定識(shí)別基團(tuán)，設(shè)計(jì)了Mi-OCl-RP探針（113）（圖31）.異硫氰酸苯酯基團(tuán)會(huì)被OCl-氧化釋放一個(gè)仲胺的花菁?jí)A單元，經(jīng)過(guò)仲胺互變異構(gòu)形成Cy-azyl.在pH=7.4的PBS緩沖溶液中Mi-OCl-RP與OCl-反應(yīng)后，在580 nm處的吸收峰減少，一個(gè)以380 nm為中心的新吸收峰顯著增加，在440 nm處有一個(gè)等吸光點(diǎn).Mi-OCl-RP在471 nm處的熒光強(qiáng)度增加，在651 nm處的發(fā)射光譜減少，溶液的顏色由紫藍(lán)色變?yōu)闇\黃色.這些結(jié)果表明可以利用比值法（I471/I651）檢測(cè)OCl-，發(fā)光強(qiáng)度比（I471/I651）與OCl-濃度在0～10μmol/L范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，檢出限為0.35μmol/L.

3.4 pH值

通過(guò)調(diào)節(jié)吲哚基上氮原子的電荷來(lái)改變花菁骨架分子間的電荷轉(zhuǎn)移是控制花菁類探針熒光的一種有效策略.利用探針對(duì)質(zhì)子變化的特殊光物理化學(xué)響應(yīng)可設(shè)計(jì)對(duì)pH敏感的花菁類探針.發(fā)射特性在很大程度上是由芳香環(huán)上兩個(gè)氮原子之間的共振效應(yīng)決定的，因此，吲哚氮原子的質(zhì)子化會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)熒光.另一方面，如此得到的酸化花菁的去質(zhì)子化會(huì)導(dǎo)致熒光猝滅.

2019年，Chen等［93］設(shè)計(jì)了一種pH敏感型探針114（圖32）.在酸性環(huán)境下，吲哚氮原子的質(zhì)子化會(huì)增強(qiáng)電荷轉(zhuǎn)移過(guò)程，吸收光譜發(fā)生紅移，并產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光發(fā)射.在此基礎(chǔ)上，將探針114與另一種染料（以萘酰亞胺為例）結(jié)合，得到的探針114用于細(xì)胞成像.以乙醇作為溶劑，在堿性介質(zhì)中，只有535 nm處有一個(gè)吸收峰.隨著pH的降低，535 nm處的吸收峰逐漸下降，出現(xiàn)一個(gè)新的吸收峰，并在795 nm處逐漸增強(qiáng).在640 nm處存在一個(gè)明顯的等吸光點(diǎn).同時(shí)，隨著酸度的增加，溶液的顏色由粉紅色變?yōu)樽仙?，并進(jìn)一步變?yōu)榫G色，這驗(yàn)證了其作為“肉眼”pH值指示劑的潛在應(yīng)用價(jià)值.

Nagano等［94］構(gòu)建pH傳感器的策略是通過(guò)二胺取代基的質(zhì)子化/去質(zhì)子化來(lái)控制胺基團(tuán)的給電子能力.探針115的pKa值為6.8，細(xì)胞成像結(jié)果證明了通過(guò)熒光比率方法傳感器監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)pH值變化的可能性.Zhang等［95］開(kāi)發(fā)了一系列酸性pH敏感的熒光探針（116～119）并用于溶酶體追蹤（圖33）.通過(guò)在NIR-II染料骨架（Flav32和BTC33）的C7/C6位置引入溶酶體靶向哌嗪，創(chuàng)建了一系列染料，適合于溶酶體的酸性環(huán)境（pH=5.0～6.0）的傳感.由于哌嗪基團(tuán)的質(zhì)子化，在較低的pH值下，這些染料的熒光增強(qiáng).

Fig.32 Molecular structure of pH probe 114

Fig.33 Molecular structures of pH probes 115—119

Fig.34 Sensing mechanism of pH probes 120a—120f

2017年，Ohe等［96］開(kāi)發(fā)了具有親核基團(tuán)（氨基、羥基和巰基）的ICG衍生物120a～120e（圖34），作為pH響應(yīng)探針.這些染料分別在pH=7～9，pH=5～7和pH=3～6范圍內(nèi)，在熒光開(kāi)環(huán)結(jié)構(gòu)和非熒光閉合結(jié)構(gòu)之間表現(xiàn)出pH依賴的平衡.染料120d和120e適用于活性細(xì)胞的高靈敏度分析，還可用于腫瘤組織酸性部位的高對(duì)比度光學(xué)成像.

3.5 中位供電子基團(tuán)(氧/氮原子)電子密度的調(diào)節(jié)

通過(guò)調(diào)節(jié)花菁染料中位氧原子或者氮原子的電子密度可實(shí)現(xiàn)Cy7熒光發(fā)射波長(zhǎng)的調(diào)控，利用這種方法可設(shè)計(jì)比率型探針.這類探針具有斯托克斯位移大、檢測(cè)靈敏度高的特點(diǎn)（圖35）.

Fig.35 General probe design principle via electron density modification of the central O or N atom

3.5.1 金屬離子 2012年，Yoon等［97］設(shè)計(jì)制備了高靈敏度和高選擇性的比例型Zn2+熒光傳感器121（CTMPA）（圖36），探針121與Zn2+可以形成摩爾比1∶1的配合物，選擇560 nm作為激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)量熒光強(qiáng)度比（I590nm/I730nm）對(duì)Zn2+進(jìn)行定量檢測(cè).他們將其成功用于監(jiān)測(cè)活細(xì)胞和生物體中的內(nèi)源性鋅離子，該探針是首個(gè)成功應(yīng)用于檢測(cè)斑馬魚(yú)神經(jīng)瘤的熒光探針.2014年，Zhu等［98］開(kāi)發(fā)了一種基于Tsuji-Trost allylic反應(yīng)的鈀高選擇性傳感器122.利用熒光比值（I655nm/I825nm）變化對(duì)水樣品和活細(xì)胞中的鈀進(jìn)行定量檢測(cè)，檢測(cè)限低至0.3μg/L.

Fig.36 Molecular structures of metal ion probes 121 and 122

3.5.2 pH值 1993年，Strekowski等［99］報(bào)道了首個(gè)通過(guò)調(diào)節(jié)中位氧來(lái)改變熒光發(fā)射波長(zhǎng)的pH探針123（圖37），該探針在水溶液中不穩(wěn)定.在甲醇溶液中，pH＜3時(shí)，染料的最大吸收波長(zhǎng)紅移（531～709 nm），在甲醇-水溶液（體積比=1∶1）中測(cè)得pKa=6.91，該染料適合作為有機(jī)溶劑介質(zhì)中的pH探針.為了解決這些染料在水溶液中不穩(wěn)定的問(wèn)題，通過(guò)在探針中引入磺酸根以及羧基得到了3個(gè)水溶性pH探針124～126［100］.在甲醇中，648 nm處有最大吸收，pH=3時(shí)，出現(xiàn)以932 nm為中心、新的更強(qiáng)的吸收.

Fig.37 Molecular structures of pH probes 123—126

2016年，Tan等［101］開(kāi)發(fā)了一種能監(jiān)測(cè)線粒體自噬、區(qū)分自噬溶酶體和其它溶酶體的對(duì)pH有響應(yīng)的HQO探針（127）（圖38），它可以通過(guò)表現(xiàn)出不同的熒光特性來(lái)同時(shí)探測(cè)活細(xì)胞中的線粒體和自噬溶酶體.HQO選擇性地在線粒體中積累，但當(dāng)功能失調(diào)的線粒體進(jìn)化為自噬溶酶體時(shí)，HQO隨pH的降低而轉(zhuǎn)化為質(zhì)子化的HQOH+形式.由于HQO和HQOH+在低極性環(huán)境中分別在530/650 nm和710/750 nm處表現(xiàn)出不同的吸收和發(fā)射，發(fā)現(xiàn)探針在膠束中特別適合用于監(jiān)測(cè)線粒體自噬.該探針在pH=0～2.0范圍內(nèi)可再次被質(zhì)子化，受此啟發(fā)，2018年，Zhang等［102］開(kāi)發(fā)了一系列探針128和129，這類探針可在極堿和極酸條件下工作.其中也利用表面活性劑進(jìn)行了pH調(diào)劑.

Fig.38 Molecular structures of pH probes 127—129

2022年，Yin等［103］構(gòu)建了一種腫瘤酸性微環(huán)境激活的納米探針Cy-TPA NPs（130）（圖39），該納米探針可以通過(guò)增強(qiáng)通透性和保留（EPR）效應(yīng)在腫瘤部位積累，并被腫瘤酸性環(huán)境激活.在弱酸性環(huán)境下，Cy-TPA恢復(fù)到長(zhǎng)共軛形式，在725 nm處表現(xiàn)出一個(gè)較強(qiáng)的吸收峰，其熒光和光熱治療能力被“開(kāi)啟”可用于特異性近紅外熒光（NIRF）成像引導(dǎo)的光熱治療（PTT）.

Fig.39 Molecular structure of pH probe 130(A)and fluorescence imaging of 4T1 tumour-bearing mice after i.v.injection of Cy-TPA NPs at different time intervals(B)[103]

3.5.3 硫化物 2012年，Yoon等［104］報(bào)道了一種選擇性檢測(cè)半胱氨酸（Cys）的比率型探針CyAC（131）（圖40）.這是首個(gè)通過(guò)調(diào)節(jié)π共軛鏈長(zhǎng)短的比率型Cys探針.在CyAC溶液中加入Cys后，CyAC的光譜可以發(fā)生顯著的變化（吸收光譜從770 nm變化到515 nm，發(fā)射光譜從780 nm變化到570 nm）.類似的，Chen等［105］將對(duì)硝基苯甲酸酯引入到花菁骨架上得到探針132，利用F640/F785對(duì)Cys進(jìn)行檢測(cè)并將該探針成功用于小鼠體內(nèi)Cys成像.

Fig.40 Molecular structures of Cys fluorescent probes 131 and 132

Fig.41 Continuous detection of superoxide radical anion and H2S n by probe 133

2015年，Chen等［106］開(kāi)發(fā)了一種多響應(yīng)近紅外熒光探針133（圖41），用于超氧陰離子（O·2-）和多硫化物（H2Sn）檢測(cè)，探針133對(duì)O·2-和H2Sn依次響應(yīng).具體過(guò)程為Cy7的氮被O·2-氧化恢復(fù)染料共軛結(jié)構(gòu)，在794 nm處產(chǎn)生弱熒光；而2-氟-5-硝基苯甲酸部分作為熒光調(diào)節(jié)劑，該基團(tuán)中存在的雙親電中心可用于捕獲H2Sn，在H2Sn的作用下，探針133發(fā)生親核取代反應(yīng)，隨后發(fā)生分子內(nèi)的親核反應(yīng)脫去熒光調(diào)節(jié)劑，釋放出Hcy-Mito，并在625 nm處產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光.該多響應(yīng)探針可以作為一種直接的化學(xué)工具用于檢測(cè)細(xì)胞和小鼠的O和H2Sn.

2016年，Chen等［107］報(bào)道了兩個(gè)連續(xù)檢測(cè)超氧陰離子自由基和H2Sn的探針Hcy-Mito和Hcy-Biot（134和135）（圖42），分別用于檢測(cè)細(xì)胞和體內(nèi)的超氧陰離子自由基和H2Sn.Hcy-Mito對(duì)內(nèi)源性超氧陰離子自由基和H2Sn的檢測(cè)表現(xiàn)出顯著的靈敏度和選擇性.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提示，H2Sn可以通過(guò)直接清除超氧陰離子自由基來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受線粒體氧化應(yīng)激的損害.而Hcy-Biot被成功用于活體成像，其可以靶向癌細(xì)胞以檢測(cè)癌細(xì)胞組織中的超氧陰離子自由基和H2Sn.

Fig.42 Continuous detection of superoxide radical anion and H2S n by probe 134 or 135

以上兩種連續(xù)檢測(cè)超氧陰離子自由基和聚硫化物的探針由于光譜重疊，不利于實(shí)際應(yīng)用.因此經(jīng)過(guò)合理設(shè)計(jì)，該課題組又進(jìn)一步設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了探針136（圖43），它在極低的背景信號(hào)干擾下，可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同熒光采集窗口中超氧陰離子自由基和H2Sn的連續(xù)檢測(cè)［108］.

Fig.43 Continuous detection of superoxide radical anion and H2S n by probe 136

2013年，Tang等［109］開(kāi)發(fā)了一種選擇性檢測(cè)硫化氫的比率型探針137（圖44）.探針137在700和780 nm處分別有最大吸收峰和發(fā)射峰.探針137與硫化氫反應(yīng)后在3 min內(nèi)熒光被猝滅.隨后，在35 min內(nèi)，在625 nm左右（510 nm激發(fā)）處逐漸出現(xiàn)了一個(gè)新的藍(lán)移發(fā)射峰.他們利用熒光強(qiáng)度比（I625/I780）成功應(yīng)用于細(xì)胞成像以及量化硫化氫.類似的，Yin等［110］報(bào)道了另外一種硫化氫檢測(cè)器138，探針與硫化氫反應(yīng)后熒光開(kāi)啟.

Fig.44 Molecular structure of hydrogen sulfide fluorescent probes 137 and 138

Fig.45 Molecular structure of a N2H4 probe 139

3.5.4 其它 2013年，Peng等［111］開(kāi)發(fā)了一種檢測(cè)聯(lián)氨的比率型探針139（I810/I582）（圖45），首次在活小鼠中實(shí)現(xiàn)聯(lián)氨可視化.探針139與聯(lián)氨反應(yīng)后，分別在530和624 nm處出現(xiàn)新的最大吸收和發(fā)射峰，熒光量子產(chǎn)率由0.044增加到0.340.

2018年，Chen等［112］報(bào)道了首個(gè)能聯(lián)合檢測(cè)O和Hg2+的三通道比例型熒光探針HCy-SeH（140）（圖46），以驗(yàn)證Hg2+引起的細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激.HCy-SeH有紅色熒光發(fā)射，吸收峰以755 nm為中心，發(fā)射峰以800 nm為中心.Cy=Se表現(xiàn)出綠色熒光發(fā)射，吸收峰以405 nm為中心，發(fā)射峰以567 nm為中心.與Hg2+反應(yīng)后，最終產(chǎn)物Keto-Cy在510 nm處形成最大吸收，在607 nm處有發(fā)射峰，通過(guò)比值更好地定量檢測(cè).HCySeH已成功應(yīng)用于慢性汞中毒小鼠模型中O和Hg2+的檢測(cè).之后他們將Se替換成S，得到了類似響應(yīng)機(jī)制的檢測(cè)探針141［113］.探針HCy-SH可用于HEK 293細(xì)胞和小鼠模型的汞中毒檢測(cè)，對(duì)O的檢測(cè)限為65 nmol/L，對(duì)Hg2+的檢測(cè)限為72 nmol/L.

Fig.46 Continuous detection of superoxide radical anion and Hg2+by probe 140 or 141

2019年，Miao等［114］報(bào)道了一種用于硝基還原酶（NTR）上轉(zhuǎn)換發(fā)光探針Cy7-NO2（142）（圖47），用以在體內(nèi)檢測(cè)NTR.探針142響應(yīng)基團(tuán)為硝基苯環(huán).該探針在硝基還原酶作用后，850 nm波長(zhǎng)激發(fā)下，在790 nm處發(fā)射熒光.2020年，Yin等［115］開(kāi)發(fā)了一種對(duì)去甲腎上腺素（NE）響應(yīng)的探針143.在NE存在下，探針143在640 nm處熒光開(kāi)啟.在這項(xiàng)工作中，將該探針應(yīng)用于高K+刺激下去甲腎上腺素胞吐信號(hào)通路的熒光成像.首次實(shí)現(xiàn)抗抑郁藥物對(duì)去甲腎上腺素干預(yù)效果的可視化.

Fig.47 Molecular structures of nitroreductase and norepinephrine fluorescent probes 142 and 143

2018年，Li等［116］報(bào)道了一種由改進(jìn)的Suzuki偶聯(lián)得到的檢測(cè)CN-的探針144（圖48），實(shí)現(xiàn)了對(duì)氰根離子的定量檢測(cè).該探針在乙腈中對(duì)氰根離子的檢測(cè)限為14 nmol/L，在CH3CN/H2O（V/V=9∶1）中的檢測(cè)限為0.23μmol/L.

Fig.48 Molecular structure of cyanogen fluorescent probe 144

2019年，Yin等［117］報(bào)道了一種用于弱酸性環(huán)境下脂肪酸（FA）的特異性檢測(cè)探針145（圖49）.當(dāng)暴露于FA時(shí)，探針145在弱酸性環(huán)境（pH=3～6）中顏色變化明顯，從藍(lán)色變成綠色，而在中性或堿性環(huán)境中保持藍(lán)色.探針145的顏色在FA暴露下發(fā)生變化，這是由于FA縮合誘導(dǎo)的pKa增加和隨后在弱酸條件下的質(zhì)子化過(guò)程.探針145可在30 s內(nèi)對(duì)FA快速反應(yīng)，靈敏度較高（檢測(cè)限為3.25μmol/L），選擇性好.該探針被成功用于弱酸性溶液和氣體環(huán)境中FA的快速檢測(cè)，這個(gè)工作為特定條件下FA的檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)便而有效的策略.

Fig.49 Molecular structure of a fatty acid probe 145

2019年，Chen等［118］報(bào)道了一種可用于活細(xì)胞和體內(nèi)缺氧條件下檢測(cè)次氯酸的探針CyHOCl（146）（圖50）.該探針對(duì)次氯酸的反應(yīng)靈敏，生物相容性好，被成功用于測(cè)量急性缺血小鼠模型體外解剖器官中的次氯酸，并用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)缺氧斑馬魚(yú)模型中次氯酸的變化.

Fig.50 Molecular structure of a hypochlorous acid fluorescent probe 146

大多數(shù)情況下，利用PET機(jī)制或者共軛骨架的破壞與恢復(fù)策略設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)的探針只在一個(gè)熒光通道下發(fā)生強(qiáng)度的增強(qiáng)或者減弱，而基于Cy7共軛外圍基團(tuán)吸電子和供電子能力調(diào)控策略開(kāi)發(fā)的分子探針，在檢測(cè)前后通常具有不同的熒光發(fā)射波長(zhǎng)，因此有潛力對(duì)待測(cè)底物實(shí)現(xiàn)比例型定量檢測(cè).

4 熒光共振能量轉(zhuǎn)移

當(dāng)一個(gè)熒光分子（供體分子）的熒光發(fā)射光譜與另一個(gè)熒光分子（受體分子）的激發(fā)光譜重疊時(shí)，供體熒光分子的激發(fā)能誘發(fā)受體分子發(fā)出熒光，同時(shí)供體熒光分子自身的熒光強(qiáng)度衰減，這一過(guò)程被稱為“熒光共振能量轉(zhuǎn)移”（FRET）［119］.Cy7與其它光譜匹配的染料可以形成FRET對(duì)，利用二者對(duì)底物的反應(yīng)性差異，可以實(shí)現(xiàn)基于FRET機(jī)理的熒光探針構(gòu)建，從而實(shí)現(xiàn)待測(cè)底物的比例型檢測(cè)［120］.

2010年，Nagano等［121］研究了Cy5和Cy7與ROS反應(yīng)性的差異（圖51），發(fā)現(xiàn)Cy7比Cy5對(duì)ROS更敏感，共軛結(jié)構(gòu)更容易被破壞.通過(guò)將Cy5和Cy7連接成功地開(kāi)發(fā)了近紅外熒光探針FOSCY-1（147），用以檢測(cè)氧化應(yīng)激水平.在沒(méi)有ROS的情況下，由于兩種菁染料分子的FRET效應(yīng)，在Cy5的激發(fā)波長(zhǎng)下，探針只發(fā)射微弱的Cy5對(duì)應(yīng)的熒光，而Cy7通道熒光較強(qiáng).然而加入ROS后，Cy7的多甲基鏈發(fā)生斷裂，F(xiàn)RET效應(yīng)消失，Cy5熒光得到恢復(fù).探針147可檢測(cè)HL60細(xì)胞、豬中性粒細(xì)胞和小鼠腹膜炎模型中的ROS.基于類似的研究思路，2016年，Qian等［122］開(kāi)發(fā)了一種基于FRET的小分子熒光探針PNCy3Cy5（148），利用Cy3和Cy5對(duì)ONOO-的反應(yīng)性差異監(jiān)測(cè)ONOO-.當(dāng)ONOO-存在時(shí)，熒光強(qiáng)度在560 nm處增強(qiáng)，在660 nm處減弱（圖52）.兩個(gè)熒光發(fā)射通道強(qiáng)度比（F560/F660）在檢測(cè)前后顯示出高達(dá)324倍的動(dòng)態(tài)增長(zhǎng)，該探針對(duì)ONOO-的最低檢測(cè)限為0.65 nmol/L.

Fig.51 Molecular structure of a FRET probe 147 for ROS

Fig.52 Molecular structure of a FRET probe 148 with its spectral response to ONOO-[122]

羅丹明供體和Cy7也可以組成FRET染料對(duì).如2012年Hanaoka等［123］報(bào)道的可逆FRET系統(tǒng)149（圖53），用于監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中的重復(fù)缺氧-常氧循環(huán).2018年，Liu等［124］合成了一種基于FRET的近紅外pH熒光探針150，將羅丹明供體與Cy7受體連接，利用羅丹明的酸堿響應(yīng)開(kāi)關(guān)調(diào)控其熒光發(fā)射，同時(shí)通過(guò)FRET將信號(hào)通過(guò)Cy7反饋出來(lái).

Fig.53 Molecular structures of FRET probes 149—152

此外，基于Cy7平臺(tái)的FRET機(jī)制在設(shè)計(jì)特定的酶敏感化學(xué)傳感器中也非常流行.如2017年Yoon等［125］開(kāi)發(fā)的可被組織蛋白酶B激發(fā)的探針151，可用于腫瘤特異性近紅外成像和光療；2019年設(shè)計(jì)的探針152［126］可用于檢測(cè)組蛋白脫乙酰基酶SIRT1的活性.

5 總結(jié)與展望

綜合評(píng)述了用作各種分析物比色和熒光傳感器的吲哚七甲川菁染料，特別關(guān)注了它們的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、檢測(cè)機(jī)制以及生物成像劑的應(yīng)用.對(duì)于花菁染料骨架的修飾通常有6個(gè)位點(diǎn)，分別為對(duì)稱結(jié)構(gòu)的吲哚氮原子上的取代基、吲哚苯環(huán)上的取代基、聚甲川鏈中位N/O上的修飾以及中心環(huán)上的取代.其中，聚甲川鏈中位N/O上通常與目標(biāo)分子響應(yīng)位點(diǎn)相連接.目前已經(jīng)探索了檢測(cè)pH、活性氧、活性氮、硫化物和金屬離子等活性小分子的化學(xué)傳感器，并根據(jù)檢測(cè)機(jī)制進(jìn)行細(xì)致的分類，其中，基于PET以及改變共軛外圍基團(tuán)吸電子和供電子能力的探針最為常見(jiàn).這些花菁化學(xué)傳感器由于其合適的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)以及在生物樣品中的良好生物相容性，是必不可少的生物成像劑.

吲哚七甲川花菁染料具有較高的摩爾消光系數(shù)，結(jié)構(gòu)可修飾性位點(diǎn)多，調(diào)控策略豐富，熒光發(fā)射處于近紅外區(qū)間.在過(guò)去的幾十年里，許多基于經(jīng)典的花菁染料的熒光探針已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)，用于體內(nèi)檢測(cè).然而，由于生物組織具有背景熒光，亟需開(kāi)發(fā)具有高對(duì)比度和靈敏度的深組織生物成像熒光團(tuán).為了擴(kuò)大其在生物成像或生物傳感方面的應(yīng)用，必須克服菁染料熒光團(tuán)的幾個(gè)局限性：（1）菁染料仍然面臨量子產(chǎn)率低和穩(wěn)定性差的問(wèn)題.如其光穩(wěn)定較差，在成像的過(guò)程中可能因?yàn)楣饨鈱?dǎo)致探針信號(hào)減弱，對(duì)待測(cè)底物的檢測(cè)造成一定的干擾；（2）水溶性差，易堆積，需要引入額外的親水性基團(tuán)或者通過(guò)材料包裹改善溶解性.活體內(nèi)代謝過(guò)快等不足也限制了其在生物體內(nèi)中的應(yīng)用.此外，作為醫(yī)學(xué)診斷和疾病治療的熒光指標(biāo)的花菁探針需要進(jìn)一步關(guān)注.基于菁平臺(tái)的理想特性，相關(guān)化學(xué)傳感器的開(kāi)發(fā)有重要的意義.