周仕杰，趙 瑩，牛 瑞，徐 博，薛東芝，王櫻蕙，張洪杰，4

（1.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)稀土學(xué)院,合肥 230026；2.中國(guó)科學(xué)院贛江創(chuàng)新研究院,贛州 341000；3.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所稀土資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)春 130022；4.清華大學(xué)化學(xué)系,北京 100084）

化學(xué)動(dòng)力學(xué)療法是利用腫瘤組織特有的弱酸性環(huán)境，通過(guò)過(guò)渡金屬離子（Fe2+，Mn2+，Cu2+等）催化腫瘤病灶區(qū)微環(huán)境中過(guò)表達(dá)的H2O2，發(fā)生芬頓或類(lèi)芬頓反應(yīng)產(chǎn)生毒性的羥基自由基（·OH），原位引發(fā)腫瘤細(xì)胞的氧化應(yīng)激，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤凋亡的一種新穎治療方法［1～5］.與傳統(tǒng)的治療方式（如手術(shù)、放射治療、化學(xué)治療等）相比，化學(xué)動(dòng)力學(xué)療法具有特異性強(qiáng)、侵襲性小和毒副作用低等特點(diǎn)，因而受到廣泛關(guān)注.然而，化學(xué)動(dòng)力學(xué)療法的療效依賴于H2O2含量，盡管腫瘤微環(huán)境中H2O2的含量比正常組織更高，但其濃度也僅為0.1～1 mmol/L，導(dǎo)致其治療效果不理想.因此，提高腫瘤微環(huán)境中H2O2含量對(duì)于提高化學(xué)動(dòng)力學(xué)療法的治療效果尤為重要.最近，許多研究團(tuán)隊(duì)針對(duì)該問(wèn)題提出了解決方案，如增加腫瘤內(nèi)源性H2O2濃度的策略，即通過(guò)酶催化反應(yīng)，利用葡萄糖氧化酶（GOx）與葡萄糖反應(yīng)生成H2O2［6，7］，或是通過(guò)超氧化物歧化酶（SOD）在腫瘤微環(huán)境中產(chǎn)生H2O2［8］.但是該方法存在酶的活性和葡萄糖含量有限的問(wèn)題.另一種策略則是向腫瘤部位遞送外源性H2O2，與內(nèi)源性產(chǎn)生H2O2的策略相比，遞送外源性H2O2的方法能夠更直接、更充分地提供H2O2.目前常用的遞送方法有兩種：（1）利用脂質(zhì)體直接包覆H2O2［9］，然而該方法容易在血液循環(huán)過(guò)程中出現(xiàn)H2O2泄漏的問(wèn)題；（2）利用金屬過(guò)氧化物自供給H2O2［10］，常見(jiàn)的過(guò)氧化物有CaO2［11～13］，MgO2［14］，CuO2［15，16］，BaO2［17］和ZnO2［18，19］等.其中，ZnO2不但可以在腫瘤的酸性條件下釋放出H2O2，作為腫瘤內(nèi)外源性H2O2的補(bǔ)充，而且釋放出的Zn2+可以抑制線粒體電子傳遞鏈（ETC）促進(jìn)超氧陰離子（·O-2）的產(chǎn)生［20］，增加內(nèi)源性的活性氧（ROS）產(chǎn)生，從而協(xié)同提高治療效果.

此外，芬頓反應(yīng)的速率與Fe2+離子的濃度有關(guān)，但是Fe2+不穩(wěn)定，容易被氧化，因此如何實(shí)現(xiàn)腫瘤原位高效的Fe2+遞送從而提高化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療效果仍是一個(gè)挑戰(zhàn).Bu等［21］設(shè)計(jì)了單質(zhì)鐵（Fe0）和H2O2酶抑制劑-氨基三唑（AT）負(fù)載的有機(jī)介孔硅納米藥物，在腫瘤微環(huán)境中特異性釋放Fe2+，顯著提高了化學(xué)動(dòng)力學(xué)療法.Zhang等［22］發(fā)現(xiàn)單寧酸（TA）不但可以在室溫下與Fe，Co，Ni等過(guò)渡金屬離子螯合形成穩(wěn)定的金屬-多酚網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而且具有優(yōu)異的還原性和生物相容性.如Fe3+-TA可以在腫瘤的酸性條件下分解為Fe3+和TA，然后Fe3+進(jìn)一步被TA還原為Fe2+.因此，F(xiàn)e3+-TA有望在腫瘤原位自產(chǎn)生Fe2+，從而實(shí)現(xiàn)Fe2+的高效遞送，為提高化學(xué)動(dòng)力學(xué)療效奠定基礎(chǔ).

基于此，本文利用ZnO2作為核，在其表面包覆Fe3+-TA殼層.為了進(jìn)一步提高材料的生物相容性，在其表面修飾了生物安全性好的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）［23～25］，最終制備了新穎的納米藥物ZnO2@Fe3+-TA@PVP.該納米藥物在腫瘤的弱酸性環(huán)境下分解為Fe3+，TA，Zn2+和H2O2.TA可以將Fe3+還原為Fe2+，與釋放的H2O2發(fā)生芬頓反應(yīng)產(chǎn)生·OH，實(shí)現(xiàn)高效的化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療.同時(shí)，Zn2+可以通過(guò)抑制ETC，增加內(nèi)源性·O的產(chǎn)生，從而協(xié)同提高治療效果.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該納米藥物可以被腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞，產(chǎn)生活性氧，導(dǎo)致線粒體損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具有優(yōu)異的腫瘤細(xì)胞殺傷能力（Scheme 1）.

Scheme 1 Synthesis process for ZnO2@Fe3+-TA@PVP(A)and schematic illustration of the mechanism of chemodynamic therapy based on ZnO2@Fe3+-TA@PVP(B)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

單寧酸（TA，A.R.級(jí)）、二甲基亞砜（DMSO，A.R.級(jí)）和對(duì)苯二甲酸（PTA，純度99%）均購(gòu)自上海麥克林有限公司；無(wú)水醋酸鋅［Zn（OAC）2，純度99.99%］和六水氯化鐵（FeCl3·6H2O，純度98%）均購(gòu)自上海阿拉丁試劑；胰蛋白酶、青霉素鏈霉素混合液（100×）、磷酸緩沖液（PBS，pH=7.2～7.4）、聚乙烯吡啶酮（PVP，Mw=40000）和異硫氰酸熒光素酯（FITC）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；無(wú)水乙醇（C2H5OH，純度99.7%）和30%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）過(guò)氧化氫溶液（H2O2）購(gòu)自西隆科技有限公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自安徽康源生物技術(shù)有限責(zé)任公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone公司；小鼠乳腺癌細(xì)胞（4T1）購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）、2，7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）探針、Cell Counting Kit-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑（CCK-8）、二氫乙錠（DHE）探針、鈣黃綠素-AM（Calcein-AM）、碘化丙啶（PI）細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒和4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（DAPI）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；過(guò)氧化氫探針（ROSGreenTM H2O2Probe）和鋅離子探針（Zinquin ethyl ester）均購(gòu)自上海懋康生物科技有限公司；實(shí)驗(yàn)所用超純水由深圳市萊克斯智能精密儀器有限公司制得.

FEI Tecnai G2 F20型場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡和Qunta250型掃描電子顯微鏡，美國(guó)FEI公司；D8 Advance型X射線衍射儀，德國(guó)Bruker AXS公司；F-7000型熒光光譜儀，日本日立公司；Zetasizer Nano ZS型納米粒度電位儀，英國(guó)Malvern公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 ZnO2納米顆粒的合成 參照文獻(xiàn)［26，27］方法制備ZnO2納米顆粒.將0.46 g Zn（OAC）2溶解在49 mL水中，加入2 mL 30%H2O2溶液并劇烈攪拌，然后快速將其置于300℃的過(guò)熱板上，加熱至溶液完全變成白色，最后離心洗滌得到產(chǎn)物.

1.2.2 ZnO2@Fe3+-TA@PVP的合成 參照文獻(xiàn)［12］方法包履ZnO2.取3 mg ZnO2納米粒子（NPs）分散于5 mL去離子水；向體系中加入40μL TA水溶液（40 mg/mL），攪拌200 s；隨后，加入20μL FeCl3溶液（10 mg/mL）攪拌10 s后，立即離心分離并用去離子水洗滌3次，得到產(chǎn)物ZnO2@Fe3+-TA.

為了提高生物相容性，將得到的ZnO2@Fe3+-TA與10 mg PVP混合，劇烈攪拌6 h，最后離心洗滌得到產(chǎn)物ZnO2@Fe3+-TA@PVP.

1.2.3 H2O2和體外·OH的檢測(cè) 利用DCFH-DA探針檢測(cè)H2O2產(chǎn)生，利用熒光光譜法檢測(cè)·OH的產(chǎn)生量［3，28］.配制5 mL含有10 mmol/L對(duì)苯二甲酸（PTA）的PBS緩沖溶液（pH=7.4，6.5，5.5），加入不同濃度的ZnO2@Fe3+-TA@PVP，反應(yīng)12 h后離心收集上層清液，利用熒光光譜儀測(cè)試不同濃度和不同pH值下得到的反應(yīng)產(chǎn)物2-羥基對(duì)苯二甲酸（TAOH）在425 nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度.

1.2.4 細(xì)胞攝取 參照文獻(xiàn)［4］方法，將ZnO2@Fe3+-TA@PVP與FITC混合攪拌過(guò)夜，得到FITC標(biāo)記的ZnO2@Fe3+-TA@PVP.然后，將4T1細(xì)胞接種在96孔板中，孵育24 h后加入FITC標(biāo)記的ZnO2@Fe3+-TA@PVP分別孵育4 h和6 h，用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞.

1.2.5 細(xì)胞毒性 參照文獻(xiàn)［29］方法，首先將4T1細(xì)胞接種在96孔板中孵育24 h，將細(xì)胞分成6組，同時(shí)配制含不同ZnO2@Fe3+-TA@PVP濃度的pH=6.5和7.4的培養(yǎng)基（Control組，5，10，20，30和40 μg/mL）加入96孔板中繼續(xù)孵育24 h，加入含CCK-8的培養(yǎng)基，孵育1 h后，利用酶標(biāo)儀測(cè)吸光度，計(jì)算得到細(xì)胞的存活率.

1.2.6 細(xì)胞的活死染色 參照文獻(xiàn)［30］方法，首先將4T1細(xì)胞接種在96孔板中孵育24 h.將細(xì)胞分成4組，分別加入pH=6.5和7.4的培養(yǎng)基，pH=7.4和6.5的ZnO2@Fe3+-TA@PVP孵育24 h后，加入Calcein-AM和PI溶液，分別對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞染色，孵育24 h后，用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞.

1.2.7 細(xì)胞內(nèi)ROS的檢測(cè) 參照文獻(xiàn)［31］方法，首先將4T1細(xì)胞接種在96孔板中孵育24 h.將細(xì)胞分成4組，分別加入pH=6.5和7.4的培養(yǎng)基，pH=7.4和6.5的ZnO2@Fe3+-TA@PVP孵育4 h后，加入DCFH-DA熒光探針共同孵育30 min后，用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，評(píng)估ROS的產(chǎn)生.

1.2.9 細(xì)胞內(nèi)的Zn2+檢測(cè) 參照文獻(xiàn)［26］方法，首先將4T1細(xì)胞接種在96中孔板孵育24 h.將細(xì)胞分組，分別加入不含ZnO2@Fe3+-TA@PVP的培養(yǎng)基和含ZnO2@Fe3+-TA@PVP的培養(yǎng)基孵育4 h后，加入Zn2+探針共同孵育30 min后，用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，評(píng)估Zn2+的產(chǎn)生.

1.2.10 細(xì)胞內(nèi)的H2O2的產(chǎn)生 將4T1細(xì)胞接種在96孔板中孵育24 h.將細(xì)胞分組，分別加入不含ZnO2@Fe3+-TA@PVP的培養(yǎng)基和含ZnO2@Fe3+-TA@PVP的培養(yǎng)基孵育4 h后，加入H2O2探針共同孵育30 min后，用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，評(píng)估H2O2的產(chǎn)生.

1.2.11 細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的檢測(cè) 參照文獻(xiàn)［31］方法，首先將4T1細(xì)胞接種在96孔板中孵育24 h.將細(xì)胞分組，分別加入不含ZnO2@Fe3+-TA@PVP的培養(yǎng)基和含ZnO2@Fe3+-TA@PVP的培養(yǎng)基孵育4 h后，加入JC-1染料共同孵育30 min后，用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，評(píng)估線粒體膜電位的變化.

Fig.1 SEMimage of ZnO2(A),TEMimages of ZnO2(B),ZnO2@Fe3+-TA(C),ZnO2@Fe3+-TA@PVP(D),EDS elemental mappings of ZnO2@Fe3+-TA@PVP(E1—E5),XRD pattern of ZnO2(F),zeta potentials of ZnO2,ZnO2@Fe3+-TA,ZnO2@Fe3+-TA@PVP(G),and comparison of PVP modified with and without nanodrugs(H)

2 結(jié)果與討論

2.1 材料的制備與表征

首先通過(guò)改進(jìn)已有方法制備ZnO2納米粒子（NPs），并利用透射電子顯微鏡（TEM）和掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)其形貌進(jìn)行了表征.如圖1（A）和（B）所示，合成的ZnO2NPs表面粗糙且有毛刺，呈球形，平均粒徑為49.8 nm.X射線粉末衍射（XRD）譜圖［圖1（F）］顯示，合成的ZnO2NPs的所有衍射峰均與立方相ZnO2（JCPDS：13-0311）一致，表明已制得ZnO2NPs.然后，通過(guò)原位組裝的方式，在ZnO2NPs表面包覆了一層Fe3+-TA殼層（ZnO2@Fe3+-TA）.TEM圖片顯示，F(xiàn)e3+-TA殼層的厚度大約為9 nm，包覆后與ZnO2NPs相比表面明顯光滑［圖1（C）］.為了提高ZnO2@Fe3+-TA的生物相容性，在其表面修飾了PVP，修飾后其形貌基本無(wú)改變［圖1（D）］.元素mapping結(jié)果［圖1（E1）～（E5）］顯示，Zn元素分布在核的區(qū)域，F(xiàn)e，O，N元素則均勻分布在外層，表明核-殼結(jié)構(gòu)的納米藥物成功制備.表面電荷的變化進(jìn)一步證明了Fe3+-TA和PVP的包覆.如圖1（G）所示，ZnO2的表面帶正電（36.4 mV），包覆Fe3+-TA殼層后表面電位為-19.8 mV，進(jìn)一步修飾PVP后，ZnO2@Fe3+-TA@PVP的表面電位為-15.1 mV.此外，傅里葉變換紅外光譜（FTIR）中PVP在1660 cm-1處的特征峰同樣驗(yàn)證了PVP已被修飾（圖S1，見(jiàn)本文支持信息）.修飾PVP后，ZnO2@Fe3+-TA@PVP在水、磷酸緩沖液（PBS）、胎牛血清（FBS）和1640培養(yǎng)基中表現(xiàn)出更加優(yōu)異的分散性，為其進(jìn)一步生物應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)［圖1（H）］.

Fig.2 TEMimages of ZnO2@Fe3+-TA@PVP in PBS solutions[pH=7.4(A)and 6.5(B)]at 24 h,schematic illustration of ZnO2@Fe3+-TA@PVP self-sufficient H2O2,Fe2+and Zn2+(C),color change of the system before and after adding 1,10-phenanthroline(top:without 1,10-phenanthroline;bottom:with 1,10-phenanthroline)(D),H2O2 generation of ZnO2 in different pH solutions(E),fluorescence spectra of terephthalic acid oxidized by ZnO2@Fe3+-TA@PVP at different concentrations(F)and pH values(G)

2.2 ZnO2@Fe3+-TA@PVP酸性降解性能評(píng)估和·OH的產(chǎn)生

為了研究ZnO2@Fe3+-TA@PVP在酸性腫瘤微環(huán)境中的降解能力，在模擬腫瘤微環(huán)境（pH=6.5）與正常組織的生理?xiàng)l件（pH=7.4）下研究了不同時(shí)間內(nèi)Fe2+和H2O2的產(chǎn)生，以及其形貌變化.將ZnO2@Fe3+-TA@PVP分別于pH=7.4和6.5的PBS緩沖溶液中孵育24 h后，利用TEM對(duì)其形貌進(jìn)行表征分析.如圖2（A）和（B）所示，在正常組織的pH條件下，ZnO2@Fe3+-TA@PVP形貌基本上無(wú)變化，ZnO2核發(fā)生部分分解，這與文獻(xiàn)［18］報(bào)道的現(xiàn)象一致；而在模擬腫瘤酸性條件下，ZnO2@Fe3+-TA@PVP的核殼結(jié)構(gòu)在24 h后已經(jīng)完全降解消失.水合粒徑的變化也證明了這一現(xiàn)象（圖S2，見(jiàn)本文支持信息）.為了進(jìn)一步驗(yàn)證分解產(chǎn)生的Fe3+可以被TA還原為Fe2+，設(shè)計(jì)了以下4組實(shí)驗(yàn)：Fe3+（pH=7.4），F(xiàn)e2+（pH=7.4），ZnO2@Fe3+-TA@PVP（pH=7.4）和ZnO2@Fe3+-TA@PVP（pH=6.5），并分別在以上各組中加入等摩爾量的1，10-菲羅啉.1，10-菲羅啉可與溶液中的Fe2+形成橙紅色配合物，而與Fe3+共存時(shí)溶液顏色無(wú)明顯變化［33］.如圖2（D）所示，加入1，10-菲羅啉前后Fe3+溶液的顏色沒(méi)有變化，而Fe2+溶液則從橙黃色變?yōu)榱顺燃t色.在中性條件下，ZnO2@Fe3+-TA@PVP由于基本沒(méi)有Fe3+釋放，所以溶液顏色保持不變，而在酸性條件下，溶液顏色發(fā)生了變化.同時(shí)，紫外吸收光譜（圖S3，見(jiàn)本文支持信息）也證明了ZnO2@Fe3+-TA@PVP釋放出的Fe3+與TA發(fā)生反應(yīng)生成了Fe2+，為進(jìn)一步的化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療奠定了基礎(chǔ).同時(shí)，利用DCFH-DA探針考察了ZnO2在不同pH條件下產(chǎn)生H2O2的能力，該探針與H2O2相互作用后會(huì)發(fā)射525 nm的熒光（激發(fā)波長(zhǎng)490 nm）.如圖2（E）所示，熒光強(qiáng)度隨著pH值的減低而升高，表明與正常pH條件相比，ZnO2@Fe3+-TA@PVP在酸性條件下分解產(chǎn)生H2O2的能力更強(qiáng).上述結(jié)果表明，納米藥物ZnO2@Fe3+-TA@PVP可以特異性地在腫瘤酸性條件下分解為Zn2+，H2O2和Fe3+，并進(jìn)一步被還原為Fe2+，為實(shí)現(xiàn)高效的化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ).

進(jìn)一步研究了ZnO2@Fe3+-TA@PVP在正常組織pH條件下和腫瘤微環(huán)境中產(chǎn)生·OH的能力.對(duì)苯二甲酸（PTA）是一種檢測(cè)·OH的特異性試劑，與·OH作用后，可以生成一種具有熒光特性的產(chǎn)物TAOH（發(fā)射峰位于425 nm）.如圖2（F）和（G）所示，ZnO2@Fe3+-TA@PVP的質(zhì)量濃度越高，體系的pH越低，·OH的生成量越高，表明ZnO2@Fe3+-TA@PVP通過(guò)酸性環(huán)境下的自身降解產(chǎn)生了H2O2和Fe2+，通過(guò)高效的芬頓反應(yīng)產(chǎn)生·OH，同時(shí)，TA可以進(jìn)一步提高Fe3+向Fe2+的轉(zhuǎn)化速率，提高芬頓反應(yīng)的效率，為其后續(xù)用于腫瘤細(xì)胞的化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療奠定了基礎(chǔ)［圖2（C）］.

2.3 抗腫瘤性能研究

選取4T1作為模型細(xì)胞，用FITC標(biāo)記ZnO2@Fe3+-TA@PVP，研究了ZnO2@Fe3+-TA@PVP的細(xì)胞攝取.如圖3（A）所示，當(dāng)4T1細(xì)胞與FITC標(biāo)記的ZnO2@Fe3+-TA@PVP共孵育4 h后，可以在細(xì)胞中觀察到明顯的綠色熒光信號(hào)，證明其已被細(xì)胞攝取；而且隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)吞ZnO2@Fe3+-TA@PVP的數(shù)量增加.以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明4T1細(xì)胞可以有效攝取ZnO2@Fe3+-TA@PVP，這也為ZnO2@Fe3+-TA@PVP有效殺死癌細(xì)胞奠定了基礎(chǔ).同時(shí)，采用CCK-8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)研究了ZnO2@Fe3+-TA@PVP的生物相容性和抗腫瘤性能.如圖3（B）所示，在正常組織的pH條件下（pH=7.4），ZnO2@Fe3+-TA@PVP沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性，具有較好的生物相容性.而在腫瘤的弱酸性條件下（pH=6.5），細(xì)胞存活率隨著濃度的增加顯著下降，經(jīng)計(jì)算IC50值約為26.5μg/mL（圖S4，見(jiàn)本文支持信息），展現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞殺傷能力.為了更直觀地證明細(xì)胞的存活狀態(tài)，利用Calcein-AM和PI進(jìn)行了細(xì)胞共染色實(shí)驗(yàn)，Calcein-AM染色活細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，而PI染色死細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光.如圖3（C）所示，未加藥物的Control組，無(wú)論是在pH=7.4還是pH=6.5條件下，細(xì)胞均呈現(xiàn)出綠色熒光；而加入ZnO2@Fe3+-TA@PVP的實(shí)驗(yàn)組，在pH=7.4條件下，細(xì)胞仍主要呈現(xiàn)綠色熒光；在pH=6.5條件下，大部分細(xì)胞則顯示紅色熒光，這說(shuō)明ZnO2@Fe3+-TA@PVP在pH=7.4條件下具有良好生物相容性，在酸性條件下具有較好的抗腫瘤治療效果.這主要是由于ZnO2@Fe3+-TA@PVP在酸性條件下降解產(chǎn)生Zn2+，通過(guò)抑制ETC產(chǎn)生·O-2，H2O2和Fe2+通過(guò)芬頓反應(yīng)產(chǎn)生·OH，在二者的協(xié)同作用下有效抑制了細(xì)胞的分裂.

為了進(jìn)一步驗(yàn)證治療機(jī)制，利用ROS探針DCFH-DA驗(yàn)證了ZnO2@Fe3+-TA@PVP在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS的能力.在細(xì)胞內(nèi)存在ROS的情況，無(wú)熒光的DCFH-DA探針將被ROS氧化發(fā)出綠色熒光.如圖3（D）所示，未加藥物的Control組，無(wú)論是pH=7.4條件還是pH=6.5條件下，均檢測(cè)不到熒光信號(hào)，說(shuō)明沒(méi)有ROS產(chǎn)生.而加入藥物的實(shí)驗(yàn)組，在pH=7.4條件下，細(xì)胞呈現(xiàn)微弱的綠色熒光，這可能是ZnO2核少量分解，釋放出H2O2和Zn2+，并通過(guò)抑制ETC產(chǎn)生了·O-2；在pH=6.5條件下，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，說(shuō)明有大量的ROS產(chǎn)生，這是由于在酸性條件下，不但產(chǎn)生的H2O2和·O2-顯著增加，而且通過(guò)芬頓反應(yīng)還有大量的·OH產(chǎn)生.如圖3（E）所示，沒(méi)有經(jīng)過(guò)ZnO2@Fe3+-TA@PVP處理的Control組沒(méi)有熒光信號(hào)，而經(jīng)過(guò)ZnO2@Fe3+-TA@PVP處理后4T1細(xì)胞則呈現(xiàn)出明顯的藍(lán)色熒光信號(hào).利用H2O2探針研究了細(xì)胞內(nèi)H2O2的含量，發(fā)現(xiàn)其在存在H2O2時(shí)發(fā)出綠色的熒光.如圖3（F）所示，沒(méi)有經(jīng)過(guò)ZnO2@Fe3+-TA@PVP處理的Control組沒(méi)有熒光信號(hào)，而經(jīng)過(guò)ZnO2@Fe3+-TA@PVP處理后4T1細(xì)胞則呈現(xiàn)出明顯的綠色熒光信號(hào)，證明ZnO2@Fe3+-TA@PVP可以被細(xì)胞內(nèi)吞，并在酸性條件下釋放出Zn2+和H2O2.而后，利用·O-2探針DHE研究了ZnO2@Fe3+-TA@PVP在細(xì)胞內(nèi)·O-2的產(chǎn)生能力，其在存在·O-2時(shí)呈現(xiàn)紅色熒光.如圖3（G）所示，4T1細(xì)胞經(jīng)過(guò)ZnO2@Fe3+-TA@PVP處理后呈現(xiàn)出紅色熒光，沒(méi)有經(jīng)過(guò)ZnO2@Fe3+-TA@PVP處理的Control組則沒(méi)有紅色熒光信號(hào)，說(shuō)明ZnO2@Fe3+-TA@PVP降解后，產(chǎn)生的Zn2+可以通過(guò)抑制ETC產(chǎn)生·O-2，協(xié)同·OH殺傷腫瘤細(xì)胞.為了進(jìn)一步證明·O-2和·OH導(dǎo)致了細(xì)胞線粒體的損傷，利用JC-1熒光探針檢測(cè)了線粒體膜電位的變化.對(duì)于正常的線粒體，其膜電位較高，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中形成聚合物，呈現(xiàn)紅色熒光；當(dāng)線粒體損傷后，線粒體膜電位降低，JC-1以單體形式存在，呈現(xiàn)綠色熒光.如圖3（H）所示，4T1細(xì)胞經(jīng)過(guò)ZnO2@Fe3+-TA@PVP處理后，可見(jiàn)明顯的綠色熒光，代表線粒體膜電位下降，線粒體功能障礙，而沒(méi)有經(jīng)過(guò)ZnO2@Fe3+-TA@PVP處理的Control組呈現(xiàn)出紅色熒光.進(jìn)一步地，通過(guò)流式細(xì)胞法定量證明了不同實(shí)驗(yàn)組處理后的4T1細(xì)胞凋亡程度與上述染色實(shí)驗(yàn)基本一致（圖S5，見(jiàn)本文支持信息）.上述結(jié)果表明，ZnO2@Fe3+-TA@PVP在腫瘤的酸性條件下降解，并在腫瘤原位產(chǎn)生·O-2和·OH，導(dǎo)致線粒體損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.

3 結(jié) 論

設(shè)計(jì)制備了一種新型可降解納米藥物ZnO2@Fe3+-TA@PVP用于高效的化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療.在腫瘤的弱酸性條件下，其外部的Fe3+-TA殼層分解釋放出Fe3+和TA，F(xiàn)e3+則可以被TA還原成Fe2+，實(shí)現(xiàn)腫瘤原位Fe2+的自生成.內(nèi)部的ZnO2降解產(chǎn)生大量的H2O2和Zn2+，實(shí)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境內(nèi)H2O2的自供給，從而實(shí)現(xiàn)Fe2+與H2O2高效的芬頓反應(yīng)，產(chǎn)生大量有毒·OH.同時(shí)，在TA的參與下，可以加快Fe3+向Fe2+的轉(zhuǎn)化速率，從而提高化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療效果.釋放的Zn2+則可以通過(guò)抑制ETC實(shí)現(xiàn)內(nèi)源性·O-2的生成，進(jìn)一步提高治療效果.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，納米藥物ZnO2@Fe3+-TA@PVP可以在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS，造成線粒體損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，有效抑制了4T1細(xì)胞的分裂，具有優(yōu)異的抗腫瘤治療效果.重要的是，該納米藥物可以在腫瘤微環(huán)境中實(shí)現(xiàn)完全降解，有效避免了在體內(nèi)長(zhǎng)期滯留的毒副作用，在未來(lái)的臨床轉(zhuǎn)化中具有應(yīng)用潛力.

支持信息見(jiàn)http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20220554.