聶明霞，汪 毅，梁文耀，賈 芳，李 露，夏澤敏，陳彥君，譚建華

（廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，國(guó)家化妝品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣東 廣州 511447）

羥吡啶酮為1-羥基-2-吡啶酮類化合物，因含有與曲霉酸相似的異羥肟酸結(jié)構(gòu)而具有抑菌作用［1］。有報(bào)道稱該類化合物可用來(lái)治療溢脂性皮炎［2］、口腔黏膜疾病［3］及由真菌、細(xì)菌引起的皮膚感染疾病［4］，其作為配位體與2-氨乙基等化合物合成的鐵離子螯合劑也具有抑菌效果［5］。然而，相關(guān)毒理學(xué)試驗(yàn)表明該化合物具有潛在的致突變性［6-7］。因此，《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）［8］中明確規(guī)定，禁止在化妝品中使用羥吡啶酮。但目前尚無(wú)化妝品中羥吡啶酮的測(cè)定方法報(bào)道。

羥吡啶酮的極性強(qiáng)，反相色譜保留能力較弱，且和2-羥基吡啶-N-氧化物（HOPO）存在互變異構(gòu)現(xiàn)象［9-10］（圖1）。而HOPO與色譜系統(tǒng)中的金屬離子可能發(fā)生較強(qiáng)的絡(luò)合作用，兩種互變異構(gòu)形態(tài)在色譜柱上的異構(gòu)互變會(huì)引起色譜峰嚴(yán)重拖尾或分峰現(xiàn)象，從而給色譜分析帶來(lái)困難。本文以去屑洗發(fā)露為考察基質(zhì)，通過(guò)優(yōu)化儀器方法及提取條件等，解決了羥吡啶酮難以保留、峰形差和雜質(zhì)干擾等問(wèn)題。同時(shí)，采用化妝品常用的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)［11］，結(jié)合硫酸二甲酯衍生化處理，建立了一種洗發(fā)露中禁用原料羥吡啶酮的快速、準(zhǔn)確、靈敏的測(cè)定方法和質(zhì)譜確證方法，以為化妝品的安全監(jiān)管提供有效的技術(shù)支撐。

圖1 HOPO兩種形態(tài)的互變異構(gòu)Fig．1 Tautomerization of HOPO

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀，配DAD檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫公司）；島津液相色譜儀-SCIEX AB 5500+三重四極桿質(zhì)譜儀（日本島津與美國(guó)SCIEX公司）；BSA224S-CW電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；MS3 basic渦旋振蕩器（德國(guó)IKA公司）；KQ-250DV型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

羥吡啶酮（純度為95．0%，CAS：822-89-8，美國(guó)IL及Macklin公司）；2-羥基吡啶-N-氧化物（純度為98．0%，CAS：13161-30-3，美國(guó)Aladdin及Mackin公司）；甲醇、乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司）；草酸、三乙胺（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；硫酸二甲酯（分析純，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司）；實(shí)驗(yàn)用純水（18．2 MΩ·cm）由Milli-Q純水系統(tǒng)制備。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取羥吡啶酮對(duì)照品約0．1 g（精確至0．1 mg），置于50 mL燒杯中，加適量乙腈溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，混勻，即得質(zhì)量濃度為1 000 mg∕L的羥吡啶酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

分別精密移取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成質(zhì)量濃度分別為1．0、2．0、5．0、10．0、50．0、100．0 mg∕L和10．0、20．0、50．0、100．0、200．0、500．0 μg∕L的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液。

1.3 樣品前處理

稱取樣品0．5 g（精確至0．001 g）于10 mL具塞比色管中，加入1 mL乙腈，渦旋30 s使樣品分散，再用乙腈定容至刻度，渦旋30 s后，超聲提取15 min。冷卻至室溫后，上清液過(guò)0．22 μm濾膜，待測(cè)定。

1.4 儀器分析條件

色譜柱：Waters Atlantis Hilic（4．6 mm × 250 mm × 5 μm）；流動(dòng)相：950 mL乙腈 + 50 mL 400 mmol∕L草酸溶液；流速：1．0 mL∕min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：306 nm。

1.5 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證方法

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線衍生制備移取“1．2”中10．0、20．0、50．0、100．0、200．0、500．0 μg∕L的羥吡啶酮標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL于比色管內(nèi)，加入0．5 mL 0．3 mol∕L NaOH 溶液，渦旋30 s后，加入50 μL硫酸二甲酯，渦旋30 s，于37 ℃水浴中加熱15 min后，再加入50 μL三乙胺，渦旋30 s，取衍生后的標(biāo)準(zhǔn)溶液用純水稀釋10倍，過(guò)0．22 μm濾膜，待測(cè)定。

1.5.2 樣品前處理與衍生方法取“1．3”中的樣液1 mL于比色管中，加入0．5 mL 0．3 mol∕L NaOH溶液，渦旋30 s后，加入50 μL硫酸二甲酯，渦旋30 s，于37 ℃水浴中加熱15 min后，再加入50 μL三乙胺，渦旋30 s，取樣液用純水稀釋10倍，過(guò)0．22 μm濾膜，待測(cè)定。

1.5.3 液相色譜條件色譜柱：Agilent SB C18（2．1 mm × 100 mm，2．7 μm）；流動(dòng)相：A為0．1%甲酸水溶液，B為乙腈，等度洗脫，VA∶VB= 9∶1；流速：0．3 mL∕min；進(jìn)樣量：2．0 μL；柱溫：30 ℃。

1.5.4 質(zhì)譜條件離子源為電噴霧離子源（ESI源）；監(jiān)測(cè)模式為正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；離子化電壓4 500 V；氣簾氣137．8 kPa；噴霧氣344．7 kPa；碰撞氣62．1 kPa；離子源溫度450 ℃；監(jiān)測(cè)離子對(duì)、碰撞電壓（CE）和去簇電壓（DP）參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 羥吡啶酮的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of hydroxypyridone

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器方法的建立

2.1.1 色譜柱的選擇羥吡啶酮的logP值為-0．65，親水性強(qiáng)，極性較大，難以在色譜柱上獲得較好保留，因此對(duì)比了幾種規(guī)格相同（4．6 mm × 250 mm × 5 μm）的C18柱（Pronto SIL-C18、Ultimate AQ C18）和Waters Atlantis Hilic色譜柱的效果。以100%水為流動(dòng)相對(duì)2 μg∕mL羥吡啶酮標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，C18柱對(duì)羥吡啶酮的保留較弱，且色譜峰拖尾難以消除，因此難以對(duì)低濃度羥吡啶酮準(zhǔn)確定量；而使用Hilic色譜柱時(shí)目標(biāo)物的保留時(shí)間較使用C18柱有所延長(zhǎng)，峰形更加對(duì)稱，因此選用Hilic柱進(jìn)行后續(xù)方法開(kāi)發(fā)。

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇采用配備二極管陣列檢測(cè)器的高效液相色譜儀對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，羥吡啶酮的紫外吸收光譜圖顯示，其特征吸收波長(zhǎng)為228 nm和305 nm，與用乙醇溶解的羥吡啶酮及其互變異構(gòu)體HOPO的特征吸收波長(zhǎng)一致［1］。在實(shí)際樣品測(cè)試過(guò)程中，228 nm波長(zhǎng)下的基質(zhì)干擾較大，而羥吡啶酮在305 nm波長(zhǎng)處的響應(yīng)值滿足方法靈敏度與穩(wěn)定性要求，因此選擇305 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.3 流動(dòng)相的選擇比較了乙腈-水、乙腈-0．1%甲酸水溶液、乙腈-20 mmol∕L醋酸銨水溶液、乙腈（含0．1%甲酸）-甲醇和乙腈-草酸水溶液5種流動(dòng)相體系對(duì)羥吡啶酮的分離效果。結(jié)果顯示，使用前3種流動(dòng)相對(duì)羥吡啶酮進(jìn)行分析，色譜峰均存在不同程度分峰現(xiàn)象；使用95%乙腈（含0．1%甲酸）-5%甲醇作流動(dòng)相時(shí)，分峰現(xiàn)象有所改善，但拖尾仍然嚴(yán)重；采用乙腈-10 mmol∕L草酸水溶液為流動(dòng)相，羥吡啶酮的分峰和拖尾現(xiàn)象被有效消除，色譜峰形良好。這可能是由于草酸水溶液能夠大大降低色譜柱上殘留金屬離子與化合物的絡(luò)合作用所致。

進(jìn)一步比較了不同濃度的草酸（5、10、20、40 mmol∕L）對(duì)羥吡啶酮的色譜分離效果。結(jié)果顯示，隨著草酸濃度增大，羥吡啶酮的保留時(shí)間有所增加，草酸濃度達(dá)20 mmol∕L后，保留時(shí)間無(wú)明顯延長(zhǎng)?？紤]到高濃度草酸溶液在高比例乙腈中有析出風(fēng)險(xiǎn)，最終選擇950 mL乙腈 + 50 mL 400 mmol∕L草酸溶液為流動(dòng)相，預(yù)先混合后使用。

2.1.4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證方法由于洗發(fā)水的配方組分復(fù)雜，常用的吡硫鎓鋅、吡羅克酮等去屑劑與羥吡啶酮有相似的特征吸收，僅依靠保留時(shí)間和紫外吸收光譜定性可能會(huì)因存在干擾而產(chǎn)生假陽(yáng)性。因此，建立了羥吡啶酮的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證方法，對(duì)陽(yáng)性樣品或疑似陽(yáng)性樣品進(jìn)行確證，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

直接使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)羥吡啶酮標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行分析時(shí)，其質(zhì)譜響應(yīng)極弱，過(guò)高的檢出限無(wú)法滿足分析要求。將硫酸二甲酯在堿性條件下與氨基羥基發(fā)生反應(yīng)［7］，使化合物甲基化，可提高電離效率，從而大大增強(qiáng)化合物的質(zhì)譜響應(yīng)，且解決了化合物的分峰拖尾問(wèn)題，滿足分析確證要求。確證條件見(jiàn)“1．5”。

2.2 前處理方法的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇比較了不同比例的乙腈-水對(duì)羥吡啶酮的提取效果，結(jié)果如圖2所示，當(dāng)提取溶劑為10%和50%乙腈水時(shí)，雜質(zhì)峰及目標(biāo)化合物的色譜峰嚴(yán)重變形。這是由于10%和50%乙腈在Hilic柱上的洗脫能力強(qiáng)于流動(dòng)相，可能存在溶劑效應(yīng)使峰形展寬。另外，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)［11］，由于乙腈-水體系極性更大，減弱了目標(biāo)化合物的分子內(nèi)氫鍵，不利于發(fā)生分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移，反而導(dǎo)致分子間二聚體發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移形成新的化合物，該原因也會(huì)導(dǎo)致峰形展寬。而采用純乙腈作為提取溶劑，進(jìn)行陰性樣品加標(biāo)實(shí)驗(yàn)時(shí)，其回收率均在90%以上且羥吡啶酮的峰形對(duì)稱。因此本文采用純乙腈為提取溶劑。

圖2 不同含量乙腈提取的羥吡啶酮色譜圖Fig．2 Chromatograms of hydroxypyridinone extracted with acetonitrile in different proportions

2.2.2 超聲時(shí)間的優(yōu)化超聲提取具有操作方便、高效等特點(diǎn)，考察了超聲時(shí)間對(duì)加標(biāo)回收率的影響。將樣品渦旋提取后，分別超聲0、5、10、15、20 min，取樣液進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，隨著超聲時(shí)間的增加，目標(biāo)化合物的峰面積有所增加，但超過(guò)15 min后，峰面積無(wú)明顯增加，所以選擇超聲15 min進(jìn)行提取。

2.3 線性方程及檢出限

在優(yōu)化條件下，對(duì)質(zhì)量濃度為1．0 ～ 100．0 mg∕L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，以目標(biāo)物的峰面積（Y）對(duì)其質(zhì)量濃度（X，mg∕L）進(jìn)行線性回歸分析，獲得線性回歸方程Y= 58．573X -85．464，結(jié)果表明羥吡啶酮在1．0 ～ 100．0 mg∕L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r= 0．999。對(duì)樣品進(jìn)行加標(biāo)，以3倍信噪比計(jì)算方法檢出限（LOD），以10倍信噪比計(jì)算方法定量下限（LOQ），羥吡啶酮的LOD和LOQ分別為8．0 μg∕g和20．0 μg∕g，可滿足洗發(fā)水中羥吡啶酮的檢測(cè)需求。

2.4 回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

選取去屑洗發(fā)水陰性樣品，分別添加40、100、400 mg∕kg 3個(gè)水平的羥吡啶酮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照本方法進(jìn)行前處理和測(cè)定，每個(gè)水平平行測(cè)定6次，計(jì)算得到羥吡啶酮的平均回收率為91．8% ～96．7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1．3% ～ 3．7%。結(jié)果表明該方法有良好的回收率和精密度。

2.5 吡硫鎓鋅中羥吡啶酮的測(cè)定及來(lái)源分析

對(duì)9個(gè)不同批次的吡硫鎓鋅原料使用上述方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果有8批次檢出羥吡啶酮，含量范圍為28．3 ～ 87．2 mg∕kg。由于羥吡啶酮與HOPO為同一種化合物的互變異構(gòu)體，且羥吡啶酮是較穩(wěn)定的一種存在方式［1］，為進(jìn)一步探究吡硫鎓鋅中測(cè)得目標(biāo)物的形態(tài)，分別購(gòu)買IL和Macklin兩個(gè)品牌的羥吡啶酮標(biāo)準(zhǔn)品，Aladdin和Mackin兩個(gè)品牌的HOPO標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

用乙腈分別配制羥吡啶酮與HOPO的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并分別對(duì)空白洗發(fā)水樣品進(jìn)行相同濃度加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，采用上述方法分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液與提取樣液進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，兩種化合物的保留時(shí)間及光譜圖一致。

使用傅里葉變換紅外光譜對(duì)4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行鑒別，如圖3所示，1 626 cm-1處的吸收峰為羰基C= = O的伸縮振動(dòng)，同時(shí)羰基大幅度紅移；1 626 cm-1和1 508 cm-1之間的弱峰為C= = C共軛雙鍵的伸縮振動(dòng)，1 508 cm-1處為—N—O—的伸縮振動(dòng)，3 075、3 040 cm-1處為C—H的伸縮振動(dòng)。而3 650 ～ 3 200 cm-1處未發(fā)現(xiàn)OH的強(qiáng)吸收峰，說(shuō)明化合物存在分子內(nèi)氫鍵；718、752 cm-1處為C—H的彎曲振動(dòng)吸收峰。羥吡啶酮與HOPO標(biāo)準(zhǔn)品紅外譜圖的主要特征吸收峰波長(zhǎng)基本一致，但吸光強(qiáng)度有所差異，說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)品中發(fā)生了互變異構(gòu)，兩種異構(gòu)體共存，且互變異構(gòu)體可能主要以酮式存在。該結(jié)果與文獻(xiàn)［12］報(bào)道的互變異構(gòu)過(guò)程相符。

圖3 羥吡啶酮和HOPO的紅外光譜Fig．3 FTIR spectra of hydroxypyridinone and HOPO

進(jìn)一步查閱資料發(fā)現(xiàn)吡硫鎓鋅與HOPO的合成路線相似［13-15］，如使用2-氯代吡啶為原料，用H2O2氧化生成N-氧化-2-氯吡啶，在堿性條件下巰基化后再與ZnSO4螯合即可生成吡硫鎓鋅。該合成路線與文獻(xiàn)［16］所報(bào)道的HOPO的制備方法十分相似。因此在吡硫鎓鋅合成過(guò)程中極易生成HOPO雜質(zhì)。

對(duì)比兩種形態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)品無(wú)法對(duì)兩者進(jìn)行有效區(qū)分，而紅外光譜結(jié)果表明兩者均以更穩(wěn)定的羥吡啶酮形態(tài)存在，推測(cè)從原料中檢出的羥吡啶酮很可能由HOPO互變產(chǎn)生。

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

采用該方法對(duì)市面上采集的20個(gè)批次的去屑洗發(fā)水進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果在14個(gè)批次產(chǎn)品中檢出羥吡啶酮，含量范圍為16．8 ～ 120．2 mg∕kg。陽(yáng)性樣品的色譜圖如圖4所示。樣品中的雜質(zhì)峰未對(duì)目標(biāo)物造成干擾，說(shuō)明該方法能準(zhǔn)確對(duì)去屑洗發(fā)水中的目標(biāo)物進(jìn)行定性定量分析。而檢出羥吡啶酮的洗發(fā)水中均添加了吡硫鎓鋅，因此羥吡啶酮極有可能是作為吡硫鎓鋅原料中的雜質(zhì)引入的。

圖4 羥吡啶酮的色譜圖Fig．4 Chromatograms of hydroxypyridinone

3 結(jié) 論

通過(guò)優(yōu)化樣品前處理?xiàng)l件、色譜分離條件和質(zhì)譜確證條件，建立了一種原料及洗發(fā)露中羥吡啶酮的測(cè)定方法，該方法前處理簡(jiǎn)單，快速、高效、準(zhǔn)確，能夠?yàn)槿バ枷窗l(fā)露及吡硫鎓鋅原料的質(zhì)量監(jiān)管提供有效的技術(shù)支持。該文首次報(bào)道了洗發(fā)露中禁用成分羥吡啶酮的添加情況及帶入原因，為相關(guān)監(jiān)管機(jī)構(gòu)及生產(chǎn)企業(yè)提供了重要的風(fēng)險(xiǎn)線索。目前歐盟已將吡硫鎓鋅列入禁用名單，我國(guó)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）規(guī)定吡硫鎓鋅在去屑淋洗類發(fā)用產(chǎn)品中的使用限量為1．5%，在駐留類發(fā)用產(chǎn)品中的使用限量為0．1%［7］，故羥吡啶酮仍然存在引入風(fēng)險(xiǎn)?？紤]到羥吡啶酮的潛在基因毒性，呼吁相關(guān)部門重新評(píng)價(jià)吡硫鎓鋅作為去屑劑使用的安全性，并對(duì)吡硫鎓鋅原料加強(qiáng)監(jiān)管，以保護(hù)廣大消費(fèi)者的健康。