陳 靜，王 波，王新潮，王 娟，王玉新，諶 越，瞿德業(yè)*

（1．西北師范大學 地理與環(huán)境科學學院，甘肅 蘭州 730070；2．甘肅省綠洲資源環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；3．蘭州海關技術中心，甘肅 蘭州 730070）

除草劑是指能殺死雜草或有害植物，而不影響農(nóng)作物正常生長的化學藥劑，可用于防治農(nóng)田雜草或殺滅非農(nóng)耕地的雜草或灌木［1］。除草劑被廣泛應用于稻谷、水果、蔬菜等種植業(yè)中，造成了稻谷、水果、蔬菜、水體及土壤中除草劑及其代謝物的殘留［2］。殘留的除草劑通過生物積累和擴散到食物鏈中，對人體健康構成威脅。因此，除草劑殘留造成的傷害不容忽視。目前，除草劑殘留的檢測方法主要包括氣相色譜法（GC）［3］、液相色譜法（LC）［4-5］、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS∕MS）［6］、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS∕MS）［7］等。其中，氣相色譜法在果蔬農(nóng)藥殘留檢測中應用較廣，檢測范圍較寬，但不適用于檢測難揮發(fā)和熱不穩(wěn)定的化合物［8］；液相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法在除草劑高通量檢測中的應用較少；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的靈敏度高、抗干擾能力強。

在農(nóng)藥殘留分析中，樣品前處理所需時間通常占分析時間的61%，并對分析的可靠性和準確性起至關重要的作用，因此前處理是分析檢測的重要環(huán)節(jié)［9］。除草劑殘留的常規(guī)前處理方法有液液萃取、固相萃取、固相微萃取、凝膠滲透色譜等技術［10-11］，以上前處理方法操作時間長［12］，且操作過程復雜，制約因素多，對實驗人員的動手能力要求高。溶劑誘導萃取技術的最大優(yōu)勢為經(jīng)萃取劑誘導分離的乙腈層和水層能夠將疏水性和親水性物質(zhì)在線分離，從而實現(xiàn)樣品的凈化和濃縮，且有機相與反相UPLC流動相兼容，可直接進樣分析［13］。本研究基于乙腈與水互溶，在勻相的乙腈-水體系中添加一種疏水且與乙腈互溶的有機溶劑，從而誘導乙腈-水體系分層的原理，建立了一種溶劑誘導萃取∕超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS∕MS）同時檢測環(huán)境水體中12種除草劑的方法。該方法靈敏度高，抗干擾能力強，前處理耗時短，為環(huán)境水體中除草劑的高通量檢測提供了參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；多管渦旋混合儀（美國Scientific Industries）；臺式高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；移液槍（美國Thermo Electron公司）。

乙腈、甲醇（色譜純，德國Merck公司）；甲酸銨、二氯甲烷、三氯甲烷、氯化鈉、甲酸（純度 ＞98%）；實驗用水為蒸餾水（屈臣氏），12種除草劑混合標準溶液（10 mg∕L，阿爾塔科技有限公司）。

12種除草劑標準儲備溶液：準確移取上述標準溶液各1．0 mL，用乙腈-水（體積比1∶1）定容于10 mL棕色容量瓶中，配制成1．0 mg∕L的12種除草劑混合標準儲備溶液，冷藏待用。

1.2 樣品前處理

準確量取10 mL水樣，加入等體積乙腈，渦旋5 min后，加入1．0 mL二氯甲烷，渦旋5 min后靜置3 min。在6 ℃下以10 000 r∕min離心7 min，乙腈-水溶液分層，上層為乙腈層，下層為水層，記錄上下層體積。分別取1．0 mL過0．22 μm有機濾膜，濾液裝入棕色進樣瓶，待測。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（100 mm × 2．1 mm，1．8 μm，美國Agilent公司）；流動相A：0．1%甲酸水；B：乙腈（0．1%甲酸水）；進樣量：2 μL；柱溫：30 ℃；流速：0．30 mL∕min。流動相洗脫梯度：0 ～ 1 min，30% B；1 ～ 2 min，30% ～ 50% B；2 ～ 9 min，50% B；9 ～9．5 min，50% ～ 30% B；9．5 ～ 10 min，30% B。

1.3.2 質(zhì)譜條件采用多反應監(jiān)測（MRM）正離子方式掃描，電噴霧離子源（ESI），毛細管電壓為3 500 V；霧化氣壓力為275．8 kPa；干燥氣溫度為350 ℃，干燥氣流速為10 L∕min。經(jīng)優(yōu)化后，12種除草劑的定性定量離子對、保留時間、碰撞能量及碎裂電壓見表1。

表1 12種除草劑的保留時間以及MRM參數(shù)Table 1 Retention times and MRM parameters of 12 herbicides

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 萃取劑的選擇萃取劑是決定萃取效率的關鍵因素，選擇合適的萃取劑需考慮萃取劑的密度、揮發(fā)性、對目標物質(zhì)的萃取能力以及對后續(xù)色譜分離分析的影響［14］。與乙腈互溶的疏水性溶劑均能作為萃取劑誘導乙腈-水體系分層［13］，因此本實驗對比了不含氧萃取劑（如二氯甲烷）、無機鹽（如NaCl）以及不常用的三氯甲烷3種萃取劑的效果。在空白水樣中添加12種除草劑混合標樣，按照“1．2”處理，比較乙腈層中12種除草劑的含量，并通過計算回收率確定12種除草劑的轉移率（圖1）。結果表明，以二氯甲烷為萃取劑時，目標物的回收率最高，因此選擇二氯甲烷作為萃取劑。

圖1 不同萃取劑對目標物回收率的影響Fig．1 Effects of different extractants on the recoveries of target compounds

2.1.2 萃取劑體積的選擇考察了萃取劑二氯甲烷的體積對目標化合物回收率的影響。在其他條件一致的情況下，配制10 μg∕L空白加標水樣，分別添加不同體積（0．8、1．0、1．2、1．5 mL）的二氯甲烷，按照“1．2”處理后上機測定。結果表明，二氯甲烷體積為1．0 mL時，12種除草劑的回收率總體最高，因此選擇二氯甲烷體積為1．0 mL。

2.1.3 提取劑體積的選擇以乙腈為提取劑，考察了不同體積乙腈對目標物回收率的影響，分別取4．0、6．0、8．0、10、12、14、16 mL乙腈，按照“1．2”處理后上機測定，發(fā)現(xiàn)目標物主要集中在上層乙腈層，因此主要比較上層物質(zhì)的回收率。發(fā)現(xiàn)乙腈體積為10 mL時目標物的出峰效果最好，回收率較高，因此選擇乙腈體積為10 mL。

2.1.4 離心時間的選擇為使二氯甲烷的萃取效果更顯著，在其他條件一致的情況下，配制10 μg∕L空白加標水樣，考察了離心時間（5、6、7、8、9、10 min）對12種除草劑回收率的影響，按照“1．2”處理后上機測定。結果表明，離心時間在5 ～ 7 min時目標物的回收率增加較快，離心時間在7 ～ 10 min時目標物的回收率下降，因此選擇離心時間為7 min。

2.2 響應面分析

2.2.1 響應面設計及結果由“2．1”結果可知，以二氯甲烷作為萃取劑時12種除草劑的萃取效果最好，且乙腈體積為8．0、10、12 mL時目標物的回收率較好。因此，通過極差對單因素水平進行篩選，最終選擇提取劑乙腈體積、萃取劑二氯甲烷體積、離心時間為考察因素，通過響應面法對3個單因素進行分析，實驗方案及結果見表2。

利用Design Expert10軟件對表2數(shù)據(jù)進行方差分析。由表3可知，乙腈體積（P＜ 0．01）和二氯甲烷體積（P＜ 0．01）對12種除草劑回收率的影響極顯著。以12種除草劑的回收率為響應值，經(jīng)擬合得到回歸方程：Y= 95．60 + 4．86A - 9．87B - 2．69C - 0．93AB + 1．40AC - 0．075BC - 9．08A2- 14．80B2- 9．42C2。

表2 響應面實驗設計及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

根據(jù)方差分析結果，該模型的相關系數(shù)（r2）為0．983，說明模型的可信度高。該模型達到極顯著水平（P＜ 0．01），表明該二次模型能夠擬合實際結果，誤差較小，可利用此回歸方程確定12種除草劑的最佳萃取條件。由表3還知，A、B、A2、B2、C2對12種除草劑的回收率產(chǎn)生極顯著影響（P＜ 0．01），而AB、AC、BC對目標物回收率的影響不顯著。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.2 響應面結果各因素交互作用的響應面和等高線圖見圖2。響應面圖可較直觀地顯示各因素交互作用對除草劑回收率的影響，曲線越陡峭，則表明該因素的影響越大［15］。由表3及圖2可見，二氯甲烷體積對除草劑回收率的影響最大，乙腈體積、二氯甲烷體積、離心時間之間的交互作用對目標物回收率的影響不大。根據(jù)軟件計算結果，預測12種除草劑的最佳回收率為97．8%，乙腈體積為10．7 mL，二氯甲烷體積為1．1 mL，離心時間為6．9 min。將上述條件簡化為乙腈體積10 mL、二氯甲烷體積1．0 mL、離心時間7 min，進行5次重復實驗，得到12種除草劑的平均回收率為96．5%，測定結果與理論結果較一致。因此確定乙腈體積為10 mL，二氯甲烷體積為1．0 mL，離心時間為7 min。

圖2 各因素交互作用的響應面和等高線圖Fig．2 Response surface and contour plots of interaction of experimental factors

2.3 儀器條件的優(yōu)化

2.3.1 質(zhì)譜參數(shù)的選擇將質(zhì)量濃度為100 μg∕L的混合標準溶液采用正離子模式掃描，選擇峰強度較大的離子作為定性和定量離子。根據(jù)選擇的離子對優(yōu)化去簇電壓和碎裂電壓，再對電噴霧電壓、離子源溫度和駐留時間等參數(shù)進行優(yōu)化，得到的最佳質(zhì)譜條件如“1．3．2”所示。雖然各離子的色譜圖會有重疊，但各峰的定量離子和定性離子不同，因此不影響定量分析［16］。通過梯度洗脫可實現(xiàn)多種化合物的有效分離，且峰形較好。12種除草劑的總離子流圖如圖3所示。

圖3 12種除草劑混合標準溶液（100 μg∕L）的總離子流圖Fig．3 Total ion chromatogram of 12 herbicides mixed standard solution（100 μg∕L）

2.3.2 色譜柱的選擇比較了ACQUITY UPLCTMBEH C18（1．0 mm × 50 mm，1．7 μm）和ZORBAX Eclipse Plus C18（100 mm × 2．1 mm，1．8 μm）兩款色譜柱對12種化合物分離效果的影響。結果顯示，使用后者能使12種目標物的峰形對稱，色譜響應較高。該柱適用于高壓條件下操作（高達60 MPa），且裝填了高性能的微粒C18填料可用于高速反相HPLC，對所有類型化合物分析均能得到高柱效和優(yōu)異峰形。因此選用ZORBAX Eclipse Plus C18（100 mm × 2．1 mm，1．8 μm）色譜柱。

2.3.3 流動相的優(yōu)化由于待測化合物均在正離子模式下進行檢測，理論上母離子大部分是H+、和Na+，因此在流動相中加入甲酸或乙酸銨可以提高待測物的離子化效率，提高質(zhì)譜響應［17］?？疾炝怂?．01%甲酸水 + 2 mmol∕L甲酸銨）-甲醇（0．01%甲酸水 + 2 mmol∕L甲酸銨）、0．1%甲酸水-甲醇（0．01%甲酸水 + 2 mmol∕L甲酸銨）、0．1%甲酸水-乙腈、0．1%甲酸水-乙腈（0．1%甲酸水）4種流動相對12種除草劑分離效果的影響。結果顯示，以0．1%甲酸水-乙腈（0．1%甲酸水）為流動相時，所有目標化合物的響應強度最高，出峰時間最短，因此選擇該流動相進行分離。

2.4 線性關系、檢出限與定量下限

用乙腈-水（1∶1）配制0．05、0．1、0．2、0．5、1．0、2．0、5．0、10．0、20．0、50．0 μg∕L的標準系列工作溶液，按照優(yōu)化的實驗條件進行測定，以各目標化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標（x，μg∕L），對應的峰面積響應值為縱坐標（y）繪制標準曲線。結果表明，12種除草劑在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關系數(shù)（r）均大于0．999 5。以3倍信噪比計算得到目標化合物的檢出限（LOD）為0．05 ～ 0．5 μg∕L，以10倍信噪比計算得到目標化合物的定量下限（LOQ）為0．2 ～ 5．0 μg∕L（見表4）。

表4 12種除草劑的線性關系、檢出限及定量下限Table 4 Linear relations，detection limits and quantitation limits

2.5 準確度與精密度

選擇空白水樣準確加入適量的混合標準溶液，配制成0．5、5、50 μg∕L的加標樣品，按照優(yōu)化的實驗條件進行處理和測定，每個加標水平重復測定5次，計算平均回收率和相對標準偏差（RSD），以評價該方法的準確度和精密度。由表5可知，3個加標水平下12種除草劑的回收率為83．0% ～ 110%，RSD為0．30% ～ 5．0%，表明本方法的準確度和精密度較好。

表5 加標水樣的平均回收率及相對標準偏差（n = 5）Table 5 Average recoveries and relative standard deviations of spiked water samples（n = 5）

2.6 與標準方法的比較

與GB∕T 5750．8-2006 《生活飲用水標準檢驗方法 有機物指標》［18］和GB∕T 23214-2008 《飲用水中450種農(nóng)藥及相關化學品殘留量的測定》［19］標準方法相比，本方法前處理只需乙腈、二氯甲烷2種試劑，而標準方法需使用乙腈、無水乙酸鈉、無水硫酸鎂、甲苯等多種試劑，成本升高；本方法只需渦旋、離心、分層、進樣，操作簡單，有利于進行高通量、快速的樣品處理，且對操作要求較低；本方法前處理僅耗時30 min，標準方法的前處理時間為本方法的2 ～ 3倍；本方法的檢出限最高為0．5 μg∕L，而標準方法的檢出限最高為34．37 μg∕L。綜上，本方法試劑用量少，操作簡單，前處理耗時短，靈敏度高。

2.7 實際樣品的測定

為驗證本方法的實用性，采集湖水、河水、二次供水、飲用水、農(nóng)田灌溉水各10份共50份樣品，采用本方法進行測定。結果在實際樣品中檢出莠滅凈、氰草津、氯磺隆，其中河水中檢出4．2 μg∕L氰草津，湖水中檢出3．6 μg∕L莠滅凈，農(nóng)田灌溉水中分別檢出5．3 μg∕L莠滅凈、6．5 μg∕L氰草津和15．8μg∕L氯磺隆。特別是農(nóng)田灌溉水，氯磺隆的檢出率高達30%，這可能是由于農(nóng)田中除草劑的使用頻率較高，一部分除草劑會滲透到土壤中，灌溉農(nóng)田時再次溶入水中；氯磺隆的殘留期長，所以在農(nóng)田灌溉水中檢出濃度較高，應多給予關注。二次供水、飲用水中均未檢出12種除草劑。

3 結 論

本文通過單因素實驗和響應面分析得到最優(yōu)的前處理條件，建立了測定環(huán)境水樣中12種除草劑的溶劑誘導萃取∕UPLC-MS∕MS法。12種除草劑的回收率為83．0% ～ 110%，RSD為0．30% ～ 5．0%，檢出限為0．05 ～ 0．5 μg∕L，定量下限為0．2 ～ 5．0 μg∕L，方法學指標均能滿足檢測要求。溶劑誘導萃取技術不僅能夠提高檢測通量，而且試劑用量少，能夠在線完成凈化和富集，操作簡單，前處理用時少，有效降低了實驗成本。該方法可為除草劑或農(nóng)藥殘留的高通量檢測提供新思路。