凱 樂，盧 萍，姜 凱，李玉玲

內(nèi)蒙古師范大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010022

苦馬豆素（Swainsonine，SW）是由植物內(nèi)生真菌、昆蟲病原體真菌等產(chǎn)生的吲哚里西啶類有毒生物堿，其分子式為C8H15NO3，相對分子質(zhì)量為173，國際上將含苦馬豆素的棘豆屬（Oxytropis）和黃芪屬（Astragalus）植物統(tǒng)稱為瘋草。瘋草是目前危害草原畜牧業(yè)最嚴(yán)重的毒草類型之一，牲畜采食過量瘋草會引起中毒，出現(xiàn)食欲不振、四肢麻痹、體重下降、母畜流產(chǎn)等現(xiàn)象[1-3]。脫SW的植株是優(yōu)良牧草。SW具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，是引發(fā)牲畜瘋草病的唯一毒素[4]，其陽離子半椅式構(gòu)象與甘露糖陽離子類似，能與甘露糖苷競爭性結(jié)合，能夠競爭性抑制動物細(xì)胞α-甘露糖苷酶Ⅰ和高爾基體α-甘露糖苷酶Ⅱ的活性，使牲畜細(xì)胞空泡變性，造成低聚糖代謝及糖蛋白合成障礙，造成細(xì)胞功能紊亂，最終失去正常功能，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡[5-9]。但在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，SW是研究糖蛋白N-寡糖合成的工具藥。此外，還具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用[10-14]，由此受到廣泛關(guān)注。

小花棘豆（Oxytropis glabra DC.）是多年生草本植物[15]，大部分植株含有對牲畜有毒的SW，牲畜采食過量會造成草原畜牧業(yè)重大的經(jīng)濟(jì)損失。盧萍等[16-17]課題組從內(nèi)蒙古小花棘豆中分離出可產(chǎn)SW的內(nèi)生真菌，被歸為Alternaria屬。其中，檢測到含該屬真菌的植株含SW，未檢測到該菌則宿主植株則不含SW，因此，提出其SW毒性由Alternaria屬內(nèi)生真菌引起，并且體外培養(yǎng)的該內(nèi)生真菌也檢測出SW。

此外，克隆了該內(nèi)生真菌酵母氨酸還原酶基因（sac）的DNA（KY052048）和cDNA (KJ944635)，并順利得到了酵母氨酸還原酶基因敲除株Δsac。對產(chǎn)SW的小花棘豆內(nèi)生真菌Alternaria oxytropis OW7.8及Δsac進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序分析[18]。通過KEGG代謝途徑分析，認(rèn)為SW合成與萜類和聚酮化合物代 謝（the metabolism of terpenoids）、其他氨基酸代謝（the metabolism of other amino acids）、輔 因 子 和 維 生素 代 謝（Metabolism of cofactors and vitamins）、其他次生代謝物生物合成（Metabolism of cofactors and vitamins）等途徑有關(guān)。隨后利用第三代測序技術(shù)PacBio測序平臺對內(nèi)生真菌A. oxytropis OW7.8進(jìn)行全基因組測序和組裝，將編碼 基 因 與GO、KEGG、KOG、TCDB、Secretory Protein、CAZy、cytochrome P450、PHI等數(shù)據(jù)庫多個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了功能注釋，尋找SW合成相關(guān)基因。預(yù)測內(nèi)生真菌A. oxytropis中可能與SW合成相關(guān)的關(guān)鍵酶，結(jié)合此前的轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果，以及與他人的有關(guān)研究結(jié)果進(jìn)行比較基因組學(xué)分析，進(jìn)一步推測A. oxytropis中SW的合成途徑與分子機(jī)制，為深入了解SW生物合成途徑和代謝機(jī)制提供重要參考。

SW合成途徑存在于賴氨酸分解代謝的分支中[19-20]，可被劃分為3個階段：第1階段是由賴氨酸生成哌啶酸的過程。Ren[21]等根據(jù)基因組學(xué)的研究，推測在SW合成途徑中，由賴氨酸轉(zhuǎn)化為哌啶酸有2條途徑，即P6C（Δ1-哌 啶-6-羧 酸） 途 徑 和P2C（Δ1-哌啶-2-羧酸）途徑。P6C途徑由L-賴氨酸（L-Lys）經(jīng)酵母氨酸脫氫酶催化生成酵母氨酸，再由該酶催化生成L-2-氨基己二酸6-半醛（L-2-Aminoadipate 6-semialdehyde），經(jīng)1-哌啶-2-羧酸酯/1-吡咯啉-2-羧酸還原酶催化生成P6C，隨后在吡咯啉-5-羧酸還原酶（P5CR）的催化下，轉(zhuǎn)化為L-哌 啶 酸（L-pipecolic acid）；P2C途 徑由L-賴氨酸經(jīng)L-賴氨酸α-氧化酶催化生成6-氨基-2-氧代己酸（6-Amino-2-oxohexanoate），再環(huán)化形成P2C，經(jīng)Δ1-哌啶-2-羧酸還原酶和賴氨酸-6-脫氫酶的共同催化生成L-哌啶酸（L-Pipecolate)。第2階段由L-哌啶酸與丙二酰CoA（Malonyl-CoA）縮合生成1-酮基吲哚里西啶。第3階段生成終產(chǎn)物SW。第2、3階段的系列反應(yīng)可能由SWN基因簇編碼的各種酶催化。對產(chǎn)SW真菌基因組中SWN基因簇的基因成分和基因功能進(jìn)行綜述。

1 各類產(chǎn)SW真菌的SWN基因簇的基因組分

Cook等[22]經(jīng)BLASTp和tBLASTn比對發(fā)現(xiàn)，部分產(chǎn)SW的真菌均含有SWN基因簇，包括綠僵菌屬（Metarhizium）、鏈格孢屬（Alternaria）、毛癬菌屬（Trichophyton）等。該基因簇含7個基因：swnK編碼一個PKS-NRPS雜合酶、swnN和swnR編碼不同Rossmannfold家族還原酶，swnH1和swnH2編碼不同F(xiàn)eⅡ/α-酮戊二酸依賴的氧化酶，swnA編碼一種轉(zhuǎn)氨酶。swnT編碼的蛋白可能與跨膜膽堿轉(zhuǎn)運載體相關(guān)。有些真菌不含swnT和swnA。Cook等[22]經(jīng)研究和比對后認(rèn)為，并非所有SWN基因簇都包含全部7個基因。但所有上述真菌都含swnK、swnN、swnR、swnH1、swnH2 5個基因，毛癬菌屬的swnR基因獨立位于距SWN基因簇較遠(yuǎn)的位置。在Ipomoea carnea endophyte (ICE)內(nèi)生真菌和另一種瘋草內(nèi)生真菌A.oxytropis Raft Rive中不含swnA，但基因組內(nèi)存在swnT的 假 基 因。A.oxytropis Raft Rive與A.oxytropis OW7.8 兩菌株的SWN核苷酸序列一致度高達(dá)99%，僅有少量不同。

2 SWN基因簇各基因的功能

swnK編碼一個PKS-NRPS雜合酶[23]，是一種多功能蛋白，與一般微生物的PKS-NRPS不同的是，其PKS和NRPS模塊顛倒，即NRPS-PKS。swnK包括氨基酸腺苷化結(jié)構(gòu)域（A）、β-酮?；铣擅附Y(jié)構(gòu)域(KS)、?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域(AT)、β-酮?；€原酶結(jié)構(gòu)域(KR)、2個磷酸乙酯結(jié)合/硫代化結(jié)構(gòu)域(T和ACP)以及可催化還原反應(yīng)和非還原的Dieckmann縮合反應(yīng)[22]的R結(jié)構(gòu)域。Luo等推測，綠僵菌中swnK各結(jié)構(gòu)域順序為A-T-KS-AT-KR-ACP-R。編碼的多功能蛋白SwnK的作用過程為：哌啶酸（L-PA）作為起始底物被A結(jié)構(gòu)域識別，隨后KS結(jié)構(gòu)域接受上游肽酰鏈與下游丙二酰CoA縮合，形成C-C鍵，為產(chǎn)物增加2個碳原子，KR結(jié)構(gòu)域?qū)⑸嫌萎a(chǎn)物的酮基還原成羥基，最后由末端R結(jié)構(gòu)域?qū)⑷┗c氨基環(huán)化并脫水生成亞胺離子。Cook等在金龜子綠僵菌中敲除swnK，敲除株中沒有檢測到苦馬豆素，但在swnK基因功能互補(bǔ)株中檢測到了高于野生型綠僵菌的SW水平。推測該酶在金龜子綠僵菌的SW合成途徑中起重要作用。Luo等[23]人敲除了羅伯茨綠僵菌（M. robertsii）的swnK基因，敲除株中同樣沒有檢測到苦馬豆素，再次確認(rèn)了swnK是SW生物合成途徑中的關(guān)鍵基因之一。為了探究SwnK催化產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，Luo等[23]對該產(chǎn)物進(jìn)行了質(zhì)譜分析，最終確定該產(chǎn)物為1-酮基吲哚里西啶（1-oxoindolizidine）。推測swnK編碼的酶在綠僵菌中以L-哌啶酸為底物，催化生成1-酮基吲哚里西啶。

swnN編碼一個Rossmann-fold家族的短鏈脫氫酶[23]，在羅伯茨綠僵菌中，swnN基因敲除株ΔswnN的SW含量相對野生型菌株而言明顯減少，但并未完全消失。且相比于野生型，該敲除株中積累了1-酮基吲哚里西啶，推測swn編碼的還原酶以1-酮基吲哚里西啶為底物，催化還原反應(yīng)，生成1-羥基吲哚里西啶。

swnR編碼的酶也是一個Rossmann-fold家族的還原酶。羅伯茨綠僵菌的swnR基因敲除株ΔswnR的SW及所有中間產(chǎn)物水平均減少，認(rèn)為swnR對SW的合成也有重要作用，但目前swnR調(diào)節(jié)SW的作用機(jī)理未知。

swnH2和swnH1編 碼2種 不 同 的Fell/α-酮戊二酸依賴的雙加氧酶，羅伯茨綠僵菌swnH2基因敲除株ΔswnH2未檢測到SW，且缺少1-酮基吲哚里西啶和1，2-2羥基吲哚里西啶，但有2種能自發(fā)異構(gòu)化的1羥基吲哚里西啶（1-hydroxyindolizine）含量顯著升高，因此認(rèn)為二者均為SwnH2底物，經(jīng)NMR分析確定構(gòu)型為(1S)-1-羥基吲哚里西啶和(1R)-1-羥基吲哚里西啶，推測SwnH2以1羥基吲哚里西啶為底物催化氧化反應(yīng)生成1，2-二羥基吲哚里西啶（1，2-dihydroxyindolizine）。

swnH1敲除菌株ΔswnH1也未檢測到SW，但有3種1，2-二羥基吲哚里西啶含量顯著升高，推測SwnH1催化SW合成途徑中的最后一步反應(yīng)，以3種1，2-二羥基吲哚里西啶為底物催化氧化反應(yīng)生成終產(chǎn)物SW。經(jīng)HPLC分離和多步純化后對得到的化合物進(jìn)行NMR分析，確定為3種底物構(gòu)型為(1S，2S)-1，2-二羥基吲哚里西啶、(1R，2S)-二羥基吲哚里西啶和(1S，2R)-二羥基吲哚里西啶。

3 展望

SW的分子結(jié)構(gòu)為雙雜環(huán)，并且有4種手性異構(gòu)[24]。這意味著化學(xué)合成的SW極容易摻雜手性異構(gòu)體，難以分離純化。研究內(nèi)生真菌中的SW合成途徑，利用生物合成的方法得到SW，從而根據(jù)SW的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用生產(chǎn)藥物，為多種疾病的治療提供可能性。SWN基因簇幾乎存在于所有產(chǎn)SW的真菌中，處于SW生物合成通路的下游，以L-哌啶酸為底物經(jīng)一系列反應(yīng)催化生成終產(chǎn)物SW。

有關(guān)產(chǎn)SW真菌的SW合成機(jī)理和代謝途徑最早在豆類絲核菌中、后來在綠僵菌中開展了一些研究，而在瘋草內(nèi)生真菌中研究較少。而到目前為止，對SWN基因簇相關(guān)基因功能的研究結(jié)果多在羅伯茨綠僵菌及金龜子綠僵菌中進(jìn)行，而瘋草內(nèi)生真菌此方面的研究未見報道。本課題組前期對產(chǎn)SW的小花棘豆內(nèi)生真菌A. oxytropis OW7.8及其酵母氨酸還原酶基因敲除株Δsac進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序分析，對A. oxytropis OW7.8進(jìn)行了全基因組測序分析，發(fā)現(xiàn)該真菌基因組中有SWN基因簇的5個基因，即swnK、swnN、swnR、swnH1、swnH2，在SW合成途徑中催化下游反應(yīng)，對SW生物合成意義重大。目前已克隆OW7.8的上述5個基因，構(gòu)建了一系列基因敲除載體和表達(dá)載體，個別構(gòu)建了CRISPR/Cas9基因編輯載體。上述載體分別用于OW7.8原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化子篩選工作仍在進(jìn)行中，以期得到基因敲除株，利用HPLC-MS技術(shù)檢測各突變株中SW及關(guān)鍵中間產(chǎn)物的水平變化，深入研究相關(guān)基因?qū)π』箖?nèi)生真菌A. oxytropis SW合成的影響，為進(jìn)一步明晰瘋草內(nèi)生真菌SW合成的分子機(jī)制和代謝途徑奠定基礎(chǔ)，對通過遺傳改良得無SW的優(yōu)良牧草、促進(jìn)草原畜牧業(yè)的發(fā)展有積極意義。