朱麗香，劉 娜

（中國檢驗檢疫科學(xué)研究院綜合檢測中心，北京 100124）

微生物導(dǎo)致的食品安全問題十分常見，對人們的健康造成了嚴(yán)重威脅，如由致病微生物導(dǎo)致腹瀉等疾病，嚴(yán)重危害人們的身心健康。目前，食品安全問題已得到廣泛重視，我國出臺了諸多政策法規(guī)，并積極落實，嚴(yán)格控制食品中的微生物污染。對食品檢驗機構(gòu)而言，微生物檢測技術(shù)是一種常用的技術(shù)手段，能夠有效檢出食品中存在的有害微生物，為食品質(zhì)量提供保障。因此，加強對微生物檢測技術(shù)的研究具有重要的現(xiàn)實意義，對于提高食品檢驗質(zhì)量具有重要作用。

1 微生物檢測技術(shù)概述

1.1 定義

微生物檢測技術(shù)是一種檢出食品或其他產(chǎn)品中微生物的技術(shù)手段，是食品質(zhì)量管控體系的主要組成部分，同時也是評估食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)，并非單指一項技術(shù)，而是諸多技術(shù)類型的總稱，用于檢測有害微生物的技術(shù)均可稱作微生物檢測技術(shù)[1]。如今，隨著對食品檢測要求的不斷提高，我國微生物檢測的指標(biāo)內(nèi)容也在不斷增加，具體包括霉菌、致病菌、菌落總數(shù)等。微生物檢測應(yīng)遵循“預(yù)防為主”的原則，嚴(yán)加防控微生物引發(fā)的一系列疾病，為人類的身體健康提供保障。

食品微生物檢驗是食品質(zhì)量管理的重要組成部分，它以“預(yù)防為主”為方針，能夠有效避免或減少由食物引起的人畜共患病的發(fā)生，為人們的身體健康提供保障。食品微生物檢驗也是衡量食品衛(wèi)生質(zhì)量的主要指標(biāo)，對于判定被檢食品是否能夠食用具有重要意義。通過食品微生物檢驗，能夠判斷食品加工環(huán)境及衛(wèi)生情況，對食品受細(xì)菌污染情況作出準(zhǔn)確評價，為各項衛(wèi)生管理工作提供重要依據(jù)。我國微生物檢驗的主要食品類型包括奶制品、調(diào)味品、冷凍飲品、蛋制品和罐頭食品等。

1.2 技術(shù)特點

對食品的微生物檢驗而言，需要檢驗的病原微生物類型繁多，且來源廣泛，微生物受到其他因素影響極易導(dǎo)致傳播，引發(fā)疾病。在實踐工作階段，工作人員應(yīng)對相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)記錄，如病原菌類型、分布特點、菌落總數(shù)等，將實際檢驗得到的結(jié)果和預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)限值進(jìn)行對比，進(jìn)而有效判斷食品是否具有致病性，且根據(jù)病原菌類型等相關(guān)指標(biāo)，進(jìn)一步判斷食品的情況，如變質(zhì)物質(zhì)的摻入時間等，如果其中一項指標(biāo)超出正常區(qū)間，便可判定該食品與質(zhì)量衛(wèi)生要求不符。

2 微生物檢測流程及內(nèi)容

2.1 流程

首先對檢驗流程進(jìn)行分析，按照食品檢驗機構(gòu)的工作流程，在委托方下發(fā)任務(wù)、合同評審結(jié)束，明確檢驗資質(zhì)后，便可進(jìn)行食品的檢驗，具體步驟如下。①抽樣檢查。嚴(yán)格按照《國家食品監(jiān)督抽檢實施細(xì)則》中相關(guān)規(guī)定，安排專業(yè)人員進(jìn)行抽檢工作，對待檢樣品的類型、數(shù)量等信息進(jìn)行認(rèn)真核實，確保其滿足檢驗要求。②樣品核對。安排相關(guān)工作人員對接收樣品進(jìn)行逐一核對，具體內(nèi)容包括外觀、標(biāo)識、檢驗用量等，并進(jìn)行相應(yīng)的照片采集。③樣品制備。為了滿足檢驗要求，應(yīng)做好待測樣品的制備工作，做好保護(hù)措施，確保其存儲環(huán)境、條件適宜。④樣品檢驗。工作人員嚴(yán)格遵守相關(guān)制度標(biāo)準(zhǔn)，做好試劑、儀器等的核對工作，檢驗時嚴(yán)格按照規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行空白試驗，保證樣品的質(zhì)量達(dá)標(biāo)。⑤復(fù)測實驗。檢驗后如果發(fā)現(xiàn)樣品不達(dá)標(biāo)情況，應(yīng)及時按照項目特征進(jìn)行復(fù)驗，比較初驗和復(fù)驗的結(jié)果，明確導(dǎo)致數(shù)據(jù)差異的主要原因，確保檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。⑥建立原始記錄，做好檢驗報告的校對、審核及簽發(fā)工作，將最終獲得的數(shù)據(jù)錄入系統(tǒng)中[2]。

2.2 主要內(nèi)容

有害微生物是檢測技術(shù)的主要檢測對象，這類微生物隨著食物被人們攝入，極易引發(fā)一系列疾病，威脅人們的健康。微生物檢測的具體內(nèi)容包括以下4個方面。①大腸菌群。大腸菌群是主要病菌，具體包括腸桿菌屬、克雷伯菌等，多源于腸道，在35 ℃的環(huán)境下可轉(zhuǎn)化為革蘭氏陰性菌。對食品進(jìn)行檢驗的過程中，當(dāng)大腸菌群結(jié)果為陽性，說明食品存在受污染情況，應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步的檢驗。結(jié)合實際分析，如果食品中該類菌群的含量較多，說明食品存在糞便污染問題，因此可通過對菌群數(shù)量的檢測判斷食品受污染情況。②致病菌。致病菌是導(dǎo)致人體生病的細(xì)菌統(tǒng)稱，包括沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等。不同食品的致病菌類型各不相同，檢驗人員應(yīng)選擇合適菌群。例如，對于海鮮類產(chǎn)品應(yīng)加強對溶血性弧菌的檢驗，而米面類產(chǎn)品則需要加強對蠟樣芽孢桿菌的檢驗。③霉菌及毒素。目前食品微生物檢測中尚未明確霉菌指標(biāo)，但霉菌極易生成毒素，進(jìn)而引發(fā)食品安全問題，因此霉菌也是微生物檢測技術(shù)的主要檢測內(nèi)容，易導(dǎo)致食物中毒及其他疾病的霉菌包括寄生曲霉、黃曲霉、島青霉等[3]，應(yīng)加以關(guān)注。④其他微生物。除了以上幾種微生物外，其他微生物也極易引發(fā)疾病，導(dǎo)致食物中毒，如病毒類微生物，包括肝炎病毒、狂犬病毒、口蹄疫病毒；寄生蟲類，包括肺吸蟲、蛔蟲、螨蟲等，均可能引發(fā)食品安全問題，也是食品微生物檢測的主要內(nèi)容。

3 微生物檢測的應(yīng)用價值

近年來，隨著社會經(jīng)濟發(fā)展水平的不斷提高，人們的生活質(zhì)量得到顯著改善，對食品質(zhì)量的要求也在不斷提高，且食品安全關(guān)乎人們的切實利益，更應(yīng)加強對食品質(zhì)量的關(guān)注。食品檢驗的目的在于保障食品質(zhì)量，防控疾病，同時為市場監(jiān)管提供依據(jù)。以往我國的食品檢驗多采用物理及化學(xué)檢驗方法，實際應(yīng)用效果欠佳，難以充分滿足檢驗工作的要求。在此背景下，微生物檢測技術(shù)為食品檢驗提供了全新的思路。在食品檢驗中采用微生物檢測技術(shù)，能夠有效檢出食品中存在的有害微生物，同時該方法的適用性極強，對于動植物食材均能夠有效檢測。與其他檢測技術(shù)相比，該類技術(shù)的成本低、準(zhǔn)確性高，在食品質(zhì)量評價、質(zhì)量監(jiān)管及生產(chǎn)過程監(jiān)控中均具有極高的應(yīng)用價值，對于保障食品安全具有重要意義。

4 微生物檢測技術(shù)在食品檢驗中的運用

4.1 常規(guī)檢測技術(shù)

4.1.1 生理生化技術(shù)

（1）ATP生物發(fā)光技術(shù)。它是目前常用的檢測技術(shù)，對其原理進(jìn)行分析，主要是在Mg2+與熒光素酶E的作用下，ATP和熒光素LH2出現(xiàn)腺苷?；换罨?，被活化后，熒光素與熒光素酶結(jié)合能夠產(chǎn)生AMP復(fù)合體，同時也會產(chǎn)生一定數(shù)量的焦磷酸。在分子氧被復(fù)合體氧化后，能夠促進(jìn)復(fù)合物P*-AMP的生成，同時產(chǎn)生一定的二氧化碳。該復(fù)合物從激發(fā)態(tài)向基態(tài)轉(zhuǎn)化的過程中，能夠射出光，進(jìn)而產(chǎn)生氧化蟲熒光素P與AMP。對該項技術(shù)的檢測流程進(jìn)行分析，首先應(yīng)明確ATP生物發(fā)光值，在此基礎(chǔ)上繪制被檢樣品微生物含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，之后進(jìn)行取樣、提取等處理，添加適量酶反應(yīng)試劑，完成檢測后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測維生素的數(shù)值。ATP生物發(fā)光技術(shù)目前多用于食品菌落總數(shù)的檢測。菌落總數(shù)是食品檢測的一項重要衛(wèi)生指標(biāo)，傳統(tǒng)檢測方法耗時長，效率低，對庫存管理、生產(chǎn)銷售等造成諸多不便，而通過采用ATP生物發(fā)光技術(shù)，與傳統(tǒng)檢測方法相比，檢測結(jié)果快速且全面，能夠在短時間內(nèi)得到準(zhǔn)確的結(jié)果。

（2）生物酶技術(shù)。這也是目前十分常用的一種微生物檢測技術(shù)，該項技術(shù)能夠基于對食品結(jié)構(gòu)、性質(zhì)的檢測分析是否存在有害微生物，為食品安全提供保障。該項技術(shù)具有較高的準(zhǔn)確度和靈敏度，目前應(yīng)用廣泛。

（3）微量生化方法。該方法用于分析細(xì)菌生長對外界環(huán)境的影響，進(jìn)而明確細(xì)菌的類型和數(shù)量，主要包括熱量法和放射測量法。在食品檢驗過程中，檢測細(xì)菌生長過程中產(chǎn)生的具有放射性的二氧化碳含量，進(jìn)而明確食物中細(xì)菌的數(shù)量；對細(xì)菌生長中產(chǎn)生熱量的檢測，能夠明確細(xì)菌的類型。該項技術(shù)適用于食品微生物中細(xì)菌數(shù)量和類型的檢測，且結(jié)果準(zhǔn)確性較高。

4.1.2 免疫學(xué)檢測技術(shù)

該項技術(shù)以免疫學(xué)相關(guān)理論知識為基礎(chǔ)，能夠有效檢測食品中的微生物類型，常用檢測方法為非標(biāo)記免疫分析法，具體流程包括凝集、沉淀反應(yīng)、補體參與和中和試驗等，對樣品中細(xì)菌、病菌等微生物的檢測效果良好。且該項技術(shù)對檢測儀器設(shè)備無較高要求，檢測準(zhǔn)確性較高，但因為涉及流程繁多，實際操作具有一定的復(fù)雜性，因此整體效率低下[4]。目前多用于一些配套儀器設(shè)施不完善的食品檢驗機構(gòu)的檢驗工作中，常用的檢測技術(shù)包括以下3種。

（1）免疫聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction， PCR）技術(shù)。該技術(shù)以分子作為主要標(biāo)記物，在常規(guī)免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)上，能夠有效進(jìn)行PCR擴增、電泳分析等操作，整體免疫試驗效果理想。在食品微生物檢測中采用該項技術(shù)，能夠有效強化系統(tǒng)的擴增性能，提高抗原體反應(yīng)的特異性，最大限度提高檢測抗原應(yīng)用的靈敏度，且因為所有DNA分支均為可選擇的固定分子，合成一對引物后便可完成操作，有效避免檢測對象變更需要更換引物等問題，有助于簡化操作流程，優(yōu)化操作模式。通過采用免疫PCR技術(shù)，可將生物素作為連接分子，且生物素在使用時具有獨立的結(jié)合點位，其中一個點位與DNA分子有效結(jié)合，另外一個點位則與抗原-抗體復(fù)合物中的親和素結(jié)合，實現(xiàn)DNA分子和抗原-抗體親和素的整合，最終產(chǎn)生相互融合的復(fù)合物，之后進(jìn)行PCR擴增處理，對DNA標(biāo)記便可完成檢測。

（2）逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）。對其原理進(jìn)行分析，首先提取食品組織或食品細(xì)胞內(nèi)的總RNA，將其中的mRNA作為模板，利用dT或隨機引物，通過逆轉(zhuǎn)錄酶將提取物質(zhì)轉(zhuǎn)錄為cDNA，將其作為模板，達(dá)到PCR擴增的效果，幫助工作人員了解目標(biāo)檢測基因的具體情況。在食品微生物檢驗中采用該技術(shù)可提高檢測的靈敏度，甚至可提升多個數(shù)量級，實現(xiàn)對微量RNA樣本的準(zhǔn)確分析。例如，食品微生物檢驗中采用該項技術(shù)檢測大腸桿菌噬菌體情況，將F-RNA平板作為陽性結(jié)果數(shù)據(jù)的主要依據(jù)，在SC和F-RNA噬菌體混合液中，實現(xiàn)對噬菌體的有效檢測。

（3）巢式PCR技術(shù)。該技術(shù)能夠構(gòu)建兩套引物達(dá)到PCR擴增處理的效果，利用內(nèi)外部兩對引物對靶基因片段進(jìn)行擴增處理，首先采用一套引物擴增約20個循環(huán)，之后利用擴增后的DNA片段，進(jìn)入另外一套引物的擴增循環(huán)，循環(huán)數(shù)約20個。在此過程中，第二套引物的設(shè)計片段位于第一套引物的擴增片段內(nèi)，所以第一套引物可作為外引物，第二套引物作為內(nèi)引物。此外，該項技術(shù)的應(yīng)用不但能夠有效提高整體反應(yīng)的特異性，同時可為工作人員提供豐富的特異靶序列，提高整體檢測的敏感度。在食品微生物檢驗中，能夠?qū)崿F(xiàn)對基因靶DNA的單拷貝擴增處理，保證食品檢驗效率和質(zhì)量。

4.2 快速檢測技術(shù)

4.2.1 生物傳感器技術(shù)

生物傳感器技術(shù)是一種采用生物傳感器進(jìn)行檢測的快速檢測技術(shù)。生物傳感器的主要組成部分包括識別元件和轉(zhuǎn)換元件，其優(yōu)勢在于實現(xiàn)生物反應(yīng)技術(shù)和生物特征的有效融合，能夠在生物傳感器的識別系統(tǒng)中進(jìn)行有效識別并分析，之后通過轉(zhuǎn)換被測信號得到食品中的成分類型及有害物質(zhì)含量。該項技術(shù)具有操作便捷、靈敏度高、精確性強、篩查快速、便于攜帶、在線監(jiān)測及成本低等優(yōu)勢。作為一種多學(xué)科交叉的新型技術(shù)，目前已成為食品檢測的主要手段。生物傳感器技術(shù)能夠?qū)κ称分杏泻ξ⑸铩⒉《?、農(nóng)藥及非法添加物等進(jìn)行檢測。例如，對食品樣本中的細(xì)菌進(jìn)行快速檢測的過程中，能夠通過細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)ATP和熒光素-酶試劑反應(yīng)發(fā)光，將信號轉(zhuǎn)化為電信號，最終通過光度計對細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行檢測。但實際應(yīng)用過程中也存在諸多不足，如穩(wěn)定性不佳、使用壽命較短等。目前，生物傳感器技術(shù)多用于食品中病原菌、農(nóng)藥殘留的檢測，實際應(yīng)用具有一定的局限性，仍需要不斷提高技術(shù)水平。

4.2.2 電阻電導(dǎo)檢測技術(shù)

電阻電導(dǎo)技術(shù)是通過檢測微生物代謝導(dǎo)致的培養(yǎng)基電特性變化情況來檢測食品樣品中微生物含量的一種快速檢測技術(shù)。培養(yǎng)微生物時，受到生理代謝作用的影響，能夠使培養(yǎng)基中電惰性物質(zhì)轉(zhuǎn)化為活性物質(zhì)，脂肪代謝為重磷酸鹽，大分子物質(zhì)代謝為小分子物質(zhì)。在微生物不斷生長的過程中，培養(yǎng)基中的電惰性分子逐漸被活性分子和離子替代，導(dǎo)致導(dǎo)電性提升，電阻抗下降。微生物的起始數(shù)量存在差異，其指數(shù)增長期的時間也各不相同，通過建立兩者間的關(guān)系，便能夠采用該項技術(shù)測量出微生物的原始菌數(shù)。此外，該項技術(shù)也可用于食品保質(zhì)期的判斷。該項技術(shù)的使用通常需要借助微生物計數(shù)儀、全自動微生物檢測儀等設(shè)備，結(jié)合電阻、電容等參數(shù)計算微生物具體數(shù)量，生成具備參考價值的數(shù)據(jù)，為檢驗人員判斷食品是否達(dá)標(biāo)提供 依據(jù)。

4.2.3 質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用涵蓋諸多理論知識，如生物基因?qū)W、代謝組學(xué)等，在海鮮食品、發(fā)酵食品等食品類型檢驗中的應(yīng)用價值較高。具體檢測時，采用該項技術(shù)能夠分離食品中的革蘭氏陽性菌，并生成光譜指紋圖譜列表，結(jié)合菌屬特異性峰值、數(shù)量等指標(biāo)進(jìn)行細(xì)菌的檢測。例如，對發(fā)酵食品進(jìn)行檢測，能夠有效判斷動物源雙歧桿菌亞種的類型。該技術(shù)的使用可彌補分子生物學(xué)檢測的不足，滿足快速檢驗的要求。在具體檢驗過程中，工作人員通過運用液相色譜分離技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)，能夠高效檢出食品中的菌種污染情況。

4.2.4 氣相色譜技術(shù)

氣相色譜技術(shù)是目前常用的一種快速檢測技術(shù)，主要將惰性氣體作為載體，將被檢樣品導(dǎo)入儀器后進(jìn)行對比分析，通過氣相色譜儀對氣體、液體及固體進(jìn)行全面分析。該項技術(shù)在氣體混合物、固體以及易揮發(fā)液體中具有明顯應(yīng)用優(yōu)勢，對分離較為復(fù)雜的混合物進(jìn)行檢測，分離時間也非常短?；旌衔锏慕M分會在氣體流動相的帶動下，逐漸流動到另一個固體或液體的固定相中，固定相對不同組分表現(xiàn)出的溶解和吸附能力不同，因此混合物組分在其中實際停留時間不同，進(jìn)而能夠分離成多個組分[5]。分離處理后，相關(guān)儀器能夠按照相應(yīng)順序進(jìn)行非電量轉(zhuǎn)換，顯示與各組分濃度對應(yīng)的電信號，為工作人員記錄、分析提供便利。

4.2.5 核酸探針技術(shù)

核酸探針技術(shù)主要包括核酸分子雜交技術(shù)、基因探針技術(shù)等，其作用為檢測食品中不同的基因鏈，在此基礎(chǔ)上明確食品中的微生物情況。不同核酸鏈的來源不同，其中的互補堿基序列在特異性結(jié)合的作用下能夠生成分子雜交鏈，因此在已知DNA或RNA片段上進(jìn)行探針標(biāo)記便可有效檢測微生物，即對食品中是否存在相同的序列進(jìn)行檢測。目前該檢測技術(shù)在食品微生物檢測中應(yīng)用頻率較高，適用于毒素、致病菌的檢測。

4.2.6 低場核磁共振技術(shù)

低場核磁共振技術(shù)主要指磁性原子核磁場產(chǎn)生一定的作用，低能態(tài)原子核磁矩吸收交變場能量后達(dá)到高能態(tài)，這一現(xiàn)象便是核磁共振現(xiàn)象，同時生成相應(yīng)的核磁共振信號。按照磁場的強度進(jìn)行劃分，高場核磁共振主要指恒定磁場強度＞1.0 T；中場核磁共振主要指恒定磁場強度為0.5～1.0 T；低場核磁共振主要指恒定磁場強度＜0.5 T。該技術(shù)利用物理原理，實現(xiàn)對譜線特征參數(shù)的有效檢測，進(jìn)而分析食品物質(zhì)分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。磁場的強度非常低，因此也是一種無損檢測方法，能夠最大限度維持物質(zhì)的原有結(jié)構(gòu)。該技術(shù)相較于傳統(tǒng)檢測技術(shù)，能夠滿足快速檢測的要求，且具有綠色、環(huán)保的優(yōu)勢。在食品品質(zhì)的檢測中，不同食品的水分含量與保水性差異顯著，采用該技術(shù)檢驗食品中的水品質(zhì)，可準(zhǔn)確分析食品品質(zhì)，且具有無損、可重復(fù)性等優(yōu)勢。例如，對干制蝦仁水分和品質(zhì)檢測的過程中，基于對核磁共振參數(shù)與結(jié)構(gòu)、水分關(guān)系的分析，能夠檢測出食品中自由水和結(jié)合水的含量變化情況及擴散方向，滿足高效無損檢測的要求。此外，該技術(shù)還能夠?qū)κ称诽砑铀胶退趾窟M(jìn)行分析，有效檢測其理化性質(zhì)，保證食品質(zhì)量。

5 結(jié)語

綜上所述，微生物檢測技術(shù)在食品檢驗中具有極高的應(yīng)用價值，具備高效、便捷、安全和低成本等優(yōu)勢，能夠為食源性疾病的防控提供重要保障，提高食品安全衛(wèi)生質(zhì)量。未來仍需要加強對技術(shù)的研究，不斷提高技術(shù)應(yīng)用水平。