劉闖，丁黎

（中國藥科大學(xué)，江蘇南京 211100）

雙特異性抗體（以下簡(jiǎn)稱“雙抗”）可以同時(shí)特異性結(jié)合2個(gè)不同的抗原，其在自然狀態(tài)下不存在，只能通過人工方式制備。雙抗因其特異性和雙功能性，現(xiàn)已成為抗體工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，在腫瘤免疫治療及自身免疫病等領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景[1]。作為蛋白質(zhì)藥物的一種，抗體制品在溶解于不同溶液時(shí)其氨基酸側(cè)鏈、C端和N端展現(xiàn)出帶不同電荷的能力，同時(shí)在表達(dá)、生產(chǎn)過程中的翻譯后修飾或構(gòu)象變化也會(huì)導(dǎo)致電荷分布變化，形成電荷異質(zhì)體。電荷異質(zhì)體對(duì)蛋白類藥物的穩(wěn)定性與生物活性有重要影響，是抗體藥物生產(chǎn)的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（Critical Quality Attribute，CQA）[2-3]?！吨腥A人民共和國藥典（2020年版）》中收錄了全柱成像毛細(xì)管等電聚焦電泳法（Whole-Column Imaging Detection for Capillary Isoelectric Focusing，WCID-CIEF，或稱iCIEF）作為一種用來分離、分析蛋白質(zhì)電荷異質(zhì)體的方法。然而，雙特異性抗體的分子結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)復(fù)雜，通常需要針對(duì)特定分子進(jìn)行方法開發(fā)，以獲得具有良好專屬性、重現(xiàn)性和分離度的WCID-CIEF方法。本文基于雙特異性抗體對(duì)專屬性WCID-CIEF方法開發(fā)策略進(jìn)行介紹，包括添加劑、載體兩性電解質(zhì)種類與比例、占位劑、上樣量、等電點(diǎn)標(biāo)記物以及工作溶液穩(wěn)定性等方面，以期為雙抗分子的質(zhì)量研究提供參考。

1 WCID-CIEF概述

依據(jù)不同電荷異質(zhì)體的等電點(diǎn)特征進(jìn)行分離的毛細(xì)管電泳技術(shù)是分離蛋白質(zhì)最具分辨率的方法之一。與傳統(tǒng)的平板凝膠相比，毛細(xì)管電泳使電泳過程在散熱效率極高的毛細(xì)管內(nèi)進(jìn)行，能夠降低焦耳熱，從而確保引入高電場(chǎng)強(qiáng)度，全面改善分離質(zhì)量[4]。不同的電泳模式包括毛細(xì)管凝膠電泳（Capillary Gel Electrophoresis，CGE）、毛細(xì)管等電聚焦電泳（Capillary Isoelectric Focusing，CIEF）和毛細(xì)管區(qū)帶電泳（Capillary Zone Electrophoresis，CZE）等。其中，毛細(xì)管等電聚焦電泳的實(shí)驗(yàn)裝置通常包括在陰極上的堿性電解液和在陽極上的酸性電解液，毛細(xì)管及檢測(cè)系統(tǒng)。通過施加高電壓，在毛細(xì)管內(nèi)部建立起pH梯度，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的pI值高于所處環(huán)境的pH值時(shí)，蛋白質(zhì)就帶正電，反之則帶負(fù)電。當(dāng)電場(chǎng)作用于毛細(xì)血管時(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)向電荷相反的電極移動(dòng)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)到達(dá)與自身pI相同的pH值區(qū)域時(shí)，蛋白質(zhì)上的電荷會(huì)降低到零，一開始充滿整個(gè)毛細(xì)管的蛋白質(zhì)，在沿毛細(xì)管的pH梯度上，根據(jù)它們的pI聚集成尖銳的帶，聚焦條帶在280 nm波長(zhǎng)條件下進(jìn)行檢測(cè)[5]。利用在樣品中加入的兩種已知等電點(diǎn)的標(biāo)記物標(biāo)定出待測(cè)樣品的等電點(diǎn)，同時(shí)得到電荷分布圖譜，采用峰面積歸一化法可以得到不同成分含量[6-7]。與兩步聚焦的CIEF儀器需將樣品區(qū)帶遷移至檢測(cè)窗口不同，WCID-CIEF通過捕獲整個(gè)毛細(xì)管分離區(qū)的圖像來避免移動(dòng)步驟造成的條帶擴(kuò)散或變形[8]。同時(shí)，該技術(shù)通過基于電荷耦合元件（Charge-Coupled Device，CCD）或互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體（Complementary Metal-Oxidesemiconductor，CMOS）的成像裝置獲得實(shí)時(shí)查看分離的優(yōu)勢(shì)[9]，因此可以很容易地確定聚焦時(shí)間的結(jié)束，廣泛應(yīng)用于蛋白藥物pI的測(cè)定和電荷異質(zhì)性的分析[10]。

目前市場(chǎng)上進(jìn)行全柱成像毛細(xì)管等電聚焦電泳檢測(cè)的主流設(shè)備有美國Protein Sample公司生產(chǎn)的全柱成像毛細(xì)管等電聚焦分析儀與Maurice系列，以及與儀器匹配的氟碳涂層毛細(xì)管[11-14]。相較于全柱成像毛細(xì)管等電聚焦分析儀，Maurice系列對(duì)自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)行整合，簡(jiǎn)化了維護(hù)步驟，并增設(shè)了自發(fā)熒光檢測(cè)器，應(yīng)用范圍更加廣泛[15]。在上樣檢測(cè)前，需將樣品與預(yù)混液混合，預(yù)混液中通常包括等電點(diǎn)標(biāo)記物、載體兩性電解質(zhì)、1%的甲基纖維素及添加劑等成分[16]。WCID-CIEF專屬性的方法開發(fā)需要結(jié)合雙特異性抗體的理論等電點(diǎn)，設(shè)置初始方法并在此基礎(chǔ)上對(duì)相關(guān)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化[17]。

2 方法開發(fā)策略

根據(jù)Protein Simple公司提供的全柱成像毛細(xì)管等電聚焦分析儀用戶使用指南，設(shè)計(jì)初始方法。將30 μg待測(cè)樣品與預(yù)混液混合，預(yù)混液包括35 μL 1%的甲基纖維素、涵蓋雙抗理論等電點(diǎn)范圍的兩種等電點(diǎn)標(biāo)記物（一高一低）各0.5 μL以及寬范圍的載體兩性電解質(zhì)（如Pharmalyte pH 3～10）4 μL，用超純水補(bǔ)足到100 μL。預(yù)聚焦電壓1 500 V，持續(xù)1 min；聚焦電壓3 000 V，持續(xù)8 min。自動(dòng)進(jìn)樣器樣品盤溫度設(shè)置為10 ℃。其中，樣品最終鹽離子強(qiáng)度應(yīng)小于15 mmol/L NaCl，否則需對(duì)樣品進(jìn)行換液，避免因離子強(qiáng)度過高，導(dǎo)致聚焦過程中電流過強(qiáng)而損傷毛細(xì)管或引起蛋白質(zhì)變性[17-18]。根據(jù)初始條件獲得雙抗分子的電泳譜圖，基于譜圖表現(xiàn)從添加劑、載體兩性電解質(zhì)種類與比例、占位劑、等電點(diǎn)標(biāo)記物、上樣量以及工作溶液穩(wěn)定性等方面進(jìn)行方法優(yōu)化，以保證良好的譜圖重現(xiàn)性與分離效果。

2.1 添加劑優(yōu)化

在聚焦過程中，蛋白質(zhì)傾向于在其pI值附近沉淀，這是由于蛋白質(zhì)隨著聚焦進(jìn)行自身凈電荷被中和且高度濃縮，導(dǎo)致可溶性下降發(fā)生聚集或沉淀[19]。待測(cè)樣品的聚集或沉淀會(huì)造成電流異常、譜圖不可重復(fù)，且有堵塞毛細(xì)管的風(fēng)險(xiǎn)。因此，需要在待測(cè)樣品中加入合適的添加劑，促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解。在等電聚焦電泳中，具有增溶作用的添加劑不應(yīng)增加樣品內(nèi)的鹽離子濃度，同時(shí)必須與高電壓兼容且在0～280 nm具有較低的紫外線吸收率，以便可以檢測(cè)蛋白質(zhì)分析物[20]。

尿素（CH4N2O）是常見的非離子型去垢劑，能夠斷開蛋白質(zhì)樣品的非共價(jià)鍵連接，促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解[16]。通常可配制終濃度為1～8 mol/L的尿素進(jìn)行重復(fù)進(jìn)樣分析，觀察譜圖重現(xiàn)性。若樣品在多個(gè)尿素濃度下均不沉淀，則選擇分離效果最好且尿素濃度最低的條件，從而減小尿素對(duì)像素位置與pI線性的影響[16]，避免高濃度尿素導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性[21]。另外，尿素應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，否則部分降解的尿素會(huì)造成蛋白的氨甲酰化，產(chǎn)生蛋白異構(gòu)體[22-23]。

甲酰胺（CH3NO）的化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能與尿素非常相似，是WCID-CIEF中另一種常用的添加劑，推薦用量為10%～45%（體積比）[24]。此外，對(duì)于一些難以變性的蛋白質(zhì)來說，可以考慮使用作用力更強(qiáng)的去垢劑，如乙基脲、N-乙基脲、N-丁脲等[20]。

由于人工制備的各種雙特異性抗體的分子結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)更加復(fù)雜，常見的添加劑可能無法實(shí)現(xiàn)良好的增溶效果，因此一些非去垢劑組合可以考慮應(yīng)用在雙抗分子的WCID-CIEF分析中。非去垢劑磺基甜菜堿（NDSB）用于改善膜蛋白的溶解度[25-26]，?；撬岵粎⑴c蛋白質(zhì)的合成[27]，因此，由NDSB和含硫氨基酸?；撬幔═）組合得到的添加劑NDSB-T可以安全地用作蛋白質(zhì)制劑的賦形劑[28]，其能夠在保持蛋白質(zhì)完整性的同時(shí)具有良好的穩(wěn)定性和分離效果[25]。推薦NDSB-T用量為NDSB 0.5 mol/L，牛磺酸10 mmol/L[25]。

此外，一些在毛細(xì)管電泳（Capillary Electrophoresis，CE）中常用的添加劑，如甘油[4-5（]推薦用量為5%～25%）、山梨醇[5]（推薦用量為0.2%～2.0%）、蔗糖（推薦用量為5%～25%）、Simplesol[29（]推薦用量為5%～40%）等也可在WCID-CIEF方法開發(fā)中進(jìn)行嘗試，以防止蛋白質(zhì)沉淀或聚集，保證譜圖重現(xiàn)性。

2.2 載體兩性電解質(zhì)種類和配比優(yōu)化

載體兩性電解質(zhì)是等電點(diǎn)相近、分子量為1～2 kDa的多氨基多羥基兩性化合物的混合物。它在大于其等電點(diǎn)的pH環(huán)境中解離成帶負(fù)電荷的陰離子，向電場(chǎng)的正極泳動(dòng)；在小于其等電點(diǎn)的pH環(huán)境中解離成帶正電荷的陽離子，向電場(chǎng)的負(fù)極泳動(dòng)，從而在預(yù)聚焦階段形成穩(wěn)定、連續(xù)的pH梯度。在聚焦過程中，樣品溶液的電導(dǎo)率和pH值不斷改變，加入載體兩性電解質(zhì)可以有效抵消上述效應(yīng)，并維持pH梯度的穩(wěn)定[30]。

市面上可供選擇的載體兩性電解質(zhì)品牌有很多，不同品牌的載體兩性電解質(zhì)有不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)或電離基團(tuán)[31-33]。其中，Pharmalyte系列的載體兩性電解質(zhì)在280 nm基線噪音小，且對(duì)大多數(shù)蛋白類分子都有較好的分離效果[15]。因此，在WCID-CIEF方法開發(fā)中，可選擇Pharmalyte系列作為初始方法的兩性電解質(zhì)并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化[34]。

待測(cè)樣品中，載體兩性電解質(zhì)的體積分?jǐn)?shù)在2%～8%。載體兩性電解質(zhì)的范圍必須涵蓋樣品的pI值范圍，同時(shí)為了兼顧分離效果和時(shí)間，通常會(huì)將寬、窄范圍的載體兩性電解質(zhì)搭配使用。以Pharmalyte系列為例，在初始方法中只加入4 μL的寬范圍兩性電解質(zhì)（Pharmalyte pH 3～10），若雙抗分子的分離效果較差，則可根據(jù)樣品各成分的等電點(diǎn)選擇窄范圍載體兩性電解質(zhì)（Pharmalyte pH 2～5，5～8），配比為1∶1～1∶3[16]，同時(shí)比較不同配比下的分離效果。需要注意的是，窄范圍載體兩性電解質(zhì)的加入可能會(huì)使樣品在初始聚焦時(shí)間內(nèi)聚集不完全，不同pI值的樣品在規(guī)定時(shí)間內(nèi)無法到達(dá)對(duì)應(yīng)的位置，比較臨近聚焦結(jié)束的幾個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)捕獲的電泳譜圖仍可觀察到明顯變化，此時(shí)可考慮增加第二階段的聚焦時(shí)間至8～12 min[34-35]。

2.3 占位劑優(yōu)化

在WCID-CIEF檢測(cè)中，有時(shí)會(huì)觀察到高pI值或低pI值的部分樣品漂移出檢測(cè)窗口。這種現(xiàn)象可能是由于陰、陽極端發(fā)生等速電泳，致使毛細(xì)管陰陽極末端的載體兩性電解質(zhì)在聚焦過程中損耗[36]，最終導(dǎo)致陰極或陽極漂移[37]。此外，陰極漂移還可能受到電滲流的影響，由于氟碳涂層毛細(xì)管內(nèi)部的電滲流無法完全消除，在聚焦過程中，毛細(xì)管內(nèi)全部成分會(huì)向陰極端移動(dòng)，導(dǎo)致高pI值的等電點(diǎn)標(biāo)記物或待測(cè)樣品譜圖漂移出檢測(cè)窗口[38-39]。為避免上述因素對(duì)WCID-CIEF檢測(cè)影響，可在待測(cè)樣品中加入占位劑。

占位劑本身就是良好的兩性電解質(zhì)，在pH梯度中占據(jù)了毛細(xì)管兩端相對(duì)穩(wěn)定的位置，作為犧牲性兩性電解質(zhì)防止載體兩性電解質(zhì)的損耗，避免陰陽極漂移。陽極端占位劑的pI值應(yīng)高于陽極電解液，且pH值＜3。常用的陽極端占位劑為亞氨基二乙酸，pI值為2.2；陰極端占位劑分子的pI值低于陰極電解液，pH值＞10，常用的陰極端占位劑為L(zhǎng)-精氨酸，pI值為10.7。此外，由于加入占位劑會(huì)壓縮pH梯度，可能導(dǎo)致分離度下降，因此占位劑的濃度不應(yīng)過高，一般為2～10 mmol/L[18,38]。

2.4 上樣量和等電點(diǎn)標(biāo)記物優(yōu)化

通常在100 μL體系中加入20～50 μg樣品，使樣品主峰在0.1～0.6 AU，避免過載或低于儀器檢測(cè)限度。等電點(diǎn)標(biāo)記物為小分子物質(zhì)，在280 nm波長(zhǎng)下呈現(xiàn)單一、顯著的峰，為了減小誤差，等電點(diǎn)標(biāo)記物應(yīng)當(dāng)盡可能地靠近目標(biāo)蛋白兩側(cè)，一般在其pI的0.5～1.0個(gè)pH單位。此外，有些等電點(diǎn)標(biāo)記物的成分為多肽，如Protein Simple公司生產(chǎn)的等電點(diǎn)標(biāo)記物4.05、5.85、6.14、8.40、8.79和9.50可能會(huì)被羧肽酶等水解。因此，在使用羧肽酶對(duì)樣品進(jìn)行前處理時(shí)，應(yīng)避免使用上述等電點(diǎn)標(biāo)記物[39]。在方法開發(fā)中，可能會(huì)觀察到不同等電點(diǎn)標(biāo)記物組合所測(cè)得的同一樣品的等電點(diǎn)存在差異。因此，在完成方法開發(fā)后，應(yīng)使用同一等電點(diǎn)標(biāo)記物組合進(jìn)行批間檢測(cè)、放行和穩(wěn)定性考察。

2.5 工作溶液穩(wěn)定性優(yōu)化

由于雙抗分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，WCID-CIEF預(yù)混液組成成分較多以及毛細(xì)管電泳本身的限制，雙抗分子在進(jìn)行專屬性WCID-CIEF方法開發(fā)時(shí)，需要注意對(duì)工作溶液穩(wěn)定性的考察[6,40]。一般需要考察工作溶液在24～48 h的譜圖重現(xiàn)性。當(dāng)譜圖無法重現(xiàn)時(shí)，一方面可考慮降低自動(dòng)進(jìn)樣器樣品盤溫度至5～8 ℃，重新考察方法的工作溶液穩(wěn)定性[16,41]。此外，若添加劑為高濃度尿素，則樣品盤溫度不可過低，否則尿素會(huì)在低溫環(huán)境中析出從而堵塞毛細(xì)管。另一方面，可嘗試改變添加劑或載體兩性電解質(zhì)的種類（見2.1、2.2），以提高工作溶液穩(wěn)定性。

根據(jù)2.1～2.5的優(yōu)化方法確定參數(shù)后，可參考藥品評(píng)審中心發(fā)布的《生物制品質(zhì)量控制分析方法驗(yàn)證技術(shù)評(píng)審一般原則》[42-43]，對(duì)方法的專屬性、精密度、線性、耐用性等進(jìn)行評(píng)估并設(shè)置質(zhì)量接受標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)語

治療性蛋白作為一種在大小、電荷和聚糖組成上具有異質(zhì)性的復(fù)雜化合物，其分析和鑒定是生物藥物開發(fā)中的關(guān)鍵任務(wù)之一。雙特異性抗體的復(fù)雜分子結(jié)構(gòu)在工藝開發(fā)過程中帶來了獨(dú)特的挑戰(zhàn)，對(duì)抗體藥物的質(zhì)量控制提出了新的要求。全柱成像毛細(xì)管等電聚焦電泳技術(shù)提供了一個(gè)快速、高分離度、可重現(xiàn)的選擇，在生物制藥行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用前景。開發(fā)或優(yōu)化專屬性的WCID-CIEF方法能夠?qū)Σ煌A段的抗體制品的電荷異質(zhì)體進(jìn)行有效監(jiān)控，并結(jié)合其他分析技術(shù)為上下游工藝優(yōu)化提供選擇依據(jù)，對(duì)提升產(chǎn)品質(zhì)量、保證工藝穩(wěn)定性具有重要意義。