殷志斌，陳旭峰，江 彪，晏石娟

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心/廣東省農(nóng)作物種質(zhì)資源保存與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

脂質(zhì)是一類具有疏水結(jié)構(gòu)特性的兩親性物質(zhì)，根據(jù)其結(jié)構(gòu)特性，主要分為以下8 類：（1）脂肪酰類（Fatty acyl,FA），如亞油酸、花生酸等；（2）中性甘油脂類（Glycerolipid，GL），如甘油三酯（Triacylglycerol，TAG）和甘油二酯（Diacylglycerol，DAG）等；（3）甘油磷脂類（Glycerophospholipid,GP），如磷脂酰膽堿（Phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰乙醇胺（Phosphatidylethanolamine，PE）和磷脂酰肌醇（Phosphatidylinositol，PI）等；（4）鞘脂類（Sphingolipid，SP），如神經(jīng)酰胺（Ceramide，Cer）和鞘磷脂（Sphingomyelin，SM）等；（5）甾醇脂類（Sterol lipid，ST），如固醇酯（Cholesterol ester）等；（6）糖脂類（Saccharolipid，SL），如單半乳糖甘油二酯（Monogalactosyl diacylglycerol，MGDG）和硫代異鼠李糖甘油二酯（Sulfoquinovosyl diacylglycerol，SQDG）等；（7）異戊烯醇類（Prenol lipid，PR），如CoA 等；（8）聚酮類（Polyketides，PK），如抗生素等。

脂質(zhì)作為細(xì)胞膜的一部分，不僅為其提供支撐作用，還影響并調(diào)控許多植物的代謝過程。脂質(zhì)在動(dòng)/植物生命體中扮演重要角色，對(duì)維持生理動(dòng)態(tài)平衡至關(guān)重要。其功能主要?dú)w納為以下幾類：（1）自組裝成磷脂雙分子層作為每個(gè)活細(xì)胞中細(xì)胞膜的基本骨架，維持細(xì)胞的相對(duì)獨(dú)立性和完整性；（2）以脂肪酸的形式存在，作為維持多種細(xì)胞基本活動(dòng)和功能的能量來源；（3）作為一些膜磷脂的特定成分，如酯化花生四烯酸酯、溶血磷脂、大麻素等可以被酶釋放到游離酸中，并轉(zhuǎn)化為具有多種生物效應(yīng)的二級(jí)信號(hào)傳遞分子，參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等［1］。此外，脂質(zhì)還參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)，調(diào)控細(xì)胞代謝及凋亡等過程［2-4］，引起脂質(zhì)代謝紊亂及異常，常被認(rèn)為與疾病的發(fā)生密切相關(guān)［5］。前人研究表明，脂質(zhì)在植物應(yīng)答脅迫過程中起重要作用，一方面作物中膜脂的流動(dòng)特性能在遭遇逆境時(shí)起到一定的緩沖作用；另一方面，脂質(zhì)作為信號(hào)分子或能量物質(zhì)參與（非）生物脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控植物生長發(fā)育和逆境響應(yīng)。Yang 等［6］通過水稻代謝組和基因表達(dá)譜的聯(lián)合分析定位到一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子OsDREB2A，能正向調(diào)控水稻種子的甘油磷脂代謝，過表達(dá)該轉(zhuǎn)錄因子可顯著提高水稻抗旱性和耐鹽性［6］。植物細(xì)胞膜本質(zhì)是磷脂雙分子層，磷脂不僅是膜的成分，磷脂信號(hào)也在植物生長、應(yīng)激過程中具有重要作用。膜磷脂被磷脂酶D（Phospholipase D，PLD）催化后產(chǎn)生的磷脂酸（Phosphatidic acid，PA）在植物響應(yīng)作物脅迫時(shí)起重要作用。水解磷脂的磷脂酶分為三大類，其中磷脂酶C 可分為非特異性磷脂酶C（Nonspecific phospholipase C，NPC）、磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C（Phosphatidylinositol specific phospholipase C，PI-PLC）［7］。NPC 已被證明在調(diào)節(jié)植物對(duì)各種脅迫的反應(yīng)中起重要作用，如水稻中的非特異性磷脂酶6（Nonspecific phospholipase 6，NPC6）參與水稻中赤霉素（Gibberellic acid，GA）介導(dǎo)的中胚層伸長［8］。NPC3 或NPC4 的突變通過油菜素內(nèi)酯（Brassinolide，BL）反應(yīng)影響根系結(jié)構(gòu)［9］。在植物生長發(fā)育過程中，PI-PLC在包括根、莖、葉、花和果實(shí)等營養(yǎng)器官和生殖器官中都會(huì)表達(dá)［10］。PI-PLCs 可在多種脅迫源下誘導(dǎo)產(chǎn)生，前人研究指出，油菜籽、玉米、小麥、水稻等作物遭受脫落酸（Abscisic acid，ABA）、鹽、低溫、水楊酸（Salicylic acid，SA）和干旱等脅迫時(shí)能誘導(dǎo)產(chǎn)生PI-PLCs［11-13］。不同水稻的PLC 成員在非生物脅迫觸發(fā)的信號(hào)傳導(dǎo)和植物發(fā)育中具有重要作用，這也得到其啟動(dòng)子中存在相關(guān)順式調(diào)控元件的支持［14］。前人研究還表明，植物種子中脂質(zhì)代謝調(diào)控與種子的活力與壽命等復(fù)雜性狀息息相關(guān)［15-19］，直接影響種子萌發(fā)、種子應(yīng)答脅迫等生理過程。本文總結(jié)了基于質(zhì)譜策略的脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展歷程和研究現(xiàn)狀，綜述了脂質(zhì)分析技術(shù)特別是質(zhì)譜成像技術(shù)，在植物種子脂質(zhì)代謝調(diào)控研究中的應(yīng)用和最新進(jìn)展。

1 脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)

1.1 脂質(zhì)組學(xué)發(fā)展歷程

2003 年，Han 等［20-22］首次提出“脂質(zhì)組學(xué)（Lipidomics）”的概念，自此“脂質(zhì)組學(xué)”迅速發(fā)展成對(duì)脂質(zhì)整體系統(tǒng)分析的一門新興學(xué)科，既作為代謝組學(xué)的一大分支，也是全代謝組研究的拓展和延伸。通過脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)系統(tǒng)、深入地研究植物種子中整體脂質(zhì)分子的含量、結(jié)構(gòu)、組成及其空間定位的變化，對(duì)于闡明脂質(zhì)分子在種子生命活動(dòng)中的代謝方式和調(diào)控機(jī)制至關(guān)重要［23］。隨著質(zhì)譜儀器和技術(shù)的不斷推陳出新，脂質(zhì)組學(xué)研究方法也不斷取得突破性進(jìn)展。長期以來，脂質(zhì)組學(xué)研究大多集中在動(dòng)物組織及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，近年來也在植物種子研究中大放異彩。傳統(tǒng)的脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)主要包括脂質(zhì)的提取、富集、分離及檢測鑒定，其中生物質(zhì)譜技術(shù)是當(dāng)前脂質(zhì)組學(xué)研究中的核心工具。此外，質(zhì)譜成像技術(shù)作為一種新興的無標(biāo)記、可視化檢測手段，可以補(bǔ)充傳統(tǒng)脂質(zhì)組學(xué)缺少的空間分辨信息，實(shí)現(xiàn)不同功能和種類的脂質(zhì)分子在植物中的精準(zhǔn)空間定位，為傳統(tǒng)的脂質(zhì)組學(xué)研究提供多維的信息深度和全新視角。

1.2 脂質(zhì)提取和富集

常用的脂質(zhì)提取方法主要有固相萃?。⊿olid phase extraction，SPE）和液液萃?。↙iquid-liquid extraction，LLE）等［24］。SPE 過程經(jīng)歷分離和富集步驟，可大幅降低非目標(biāo)物質(zhì)的背景干擾，有利于一類或幾類靶向物質(zhì)的高靈敏度檢測，因此常被用于針對(duì)脂質(zhì)分子的靶向代謝組學(xué)分析；與之相比，LLE 可以提取出范圍更廣的脂質(zhì)分子，常被用于非靶向脂質(zhì)組學(xué)分析。與簡單的單一溶劑萃取不同，LLE 主要利用代謝物在兩種互不相溶溶劑中分配系數(shù)不同來進(jìn)行分離的，也是脂質(zhì)組學(xué)中最常用的萃取策略。LLE 方法主要包括Folch 法［25］、Bligh-Dyer 法［26］和Matyash 法［27］。Folch 法是利用氯仿-甲醇-水混合溶劑體系（體積比為8∶4∶3）進(jìn)行生物樣品的全脂質(zhì)提取。Bligh-Dyer 法則是對(duì)Folch 法進(jìn)行改進(jìn)，采用相同溶劑體系，但體積比優(yōu)化為2∶2∶1.8，不僅降低溶劑（特別是有毒溶劑氯仿）的使用量，還大幅縮短提取時(shí)間。值得一提的是，甲醇-氯仿的混合有機(jī)相可以非特異性地提取多種脂質(zhì)分子，且水相的引入可以增強(qiáng)相分離能力、提高萃取效率。Matyash 方法則是采用低密度的甲醇-甲基叔丁基醚（Methanol-methyl tert-butyl ether，MTBE）與甲醇/水組成混合萃取溶劑，通過使用MTBE 取代原來的氯仿溶劑，降低操作過程中的高毒性，簡化相分離步驟，從而獲得更高的回收率［27］。

與LLE 不同，SPE 方法的原理主要是利用不同組分在固-液相中的相互作用差異來進(jìn)行分離提取的。首先，將被分析物吸附到固定相中，隨后通過不同洗脫能力的流動(dòng)相進(jìn)行逐級(jí)洗脫，實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)分析物的分離和富集。由于SPE 可以很好地去除萃取體系中的干擾物質(zhì)，因此非常適合靶向富集某一類或多類脂質(zhì)，用于靶向脂質(zhì)組學(xué)檢測。近年來，固相微萃?。⊿olid phase microextraction，SPME）因具有溶劑使用量少、分析速度快、易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為一種強(qiáng)有力的脂質(zhì)提取和分析策略，適用于微量樣品或大批次樣品的快速分析。相比于SPE 方法，SPME 通常采用一根帶有特定涂層的纖維，并基于疏水相互作用、靜電作用等原理提取待測物質(zhì)，還可與氣相色譜（Gas chromatography，GC）或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）結(jié)合，通過頂空采樣的方式對(duì)固體、液體和氣體樣品進(jìn)行萃取吸附，實(shí)現(xiàn)快速解/吸附進(jìn)樣分析。此外，近年還陸續(xù)出現(xiàn)微波輔助萃取法（Microwave-assisted extraction，MAE）、超臨界流體萃取法（Supercritical fluid extraction，SFE）、超聲輔助萃取法（Ultrasoundassisted extraction，UAE）等方法，極大提升了脂質(zhì)組學(xué)的鑒定數(shù)量和數(shù)據(jù)深度［28］。

1.3 脂質(zhì)分離和檢測

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）和液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）已成為當(dāng)前脂質(zhì)組學(xué)研究的主流方法［29-30］。通過利用不同性質(zhì)的脂質(zhì)分子在色譜柱中保留時(shí)間不同的特性，大幅提高它們在質(zhì)譜分析中的檢出數(shù)量和動(dòng)態(tài)范圍。其中，GC-MS 主要適用于易揮發(fā)性的小分子脂質(zhì)檢測，對(duì)于不易揮發(fā)的脂質(zhì)分子則需通過衍生化處理提高其揮發(fā)性，從而實(shí)現(xiàn)分離檢測。因此，該方法在脂質(zhì)組學(xué)分析中不具有普適性，更適用于靶向脂質(zhì)組學(xué)分析。相比于GC-MS，LC-MS 無需繁瑣的衍生化前處理，可以快速分離復(fù)雜的脂類物質(zhì)，兼具優(yōu)異的分離能力和鑒定能力，因此常被用于非靶向脂質(zhì)組學(xué)分析。LC 還包括正相液相色譜（Normal phase LC，NPLC）、反相液相色譜（Reversed phase LC，RPLC）、親水相互作用液相色譜（Hydrophilic-interaction LC，HILIC）、親和色譜（Affinity LC）等。其中RPLC 是目前應(yīng)用最廣泛的一類分離方法，主要通過非極性固定相（如C18 柱等）和極性流動(dòng)相進(jìn)行脂質(zhì)洗脫，可以獲得較高的分離效率。NPLC 雖然也可用于脂質(zhì)分離，但由于非極性流動(dòng)相對(duì)一些極性脂質(zhì)的溶解性較差，限制其廣泛使用。相比之下，HILIC主要采用極性固定相和混合溶劑（如水-有機(jī)溶劑等）作為流動(dòng)相，非常適合極性脂質(zhì)（如磷脂等）的分離。針對(duì)一些脂質(zhì)組成復(fù)雜的樣品，還可采用在線/離線二維色譜方法進(jìn)行分離，提高脂類物質(zhì)的分離能力［31］。對(duì)于質(zhì)譜檢測，目前脂質(zhì)組學(xué)主要采用電噴霧電離質(zhì)譜（Electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）和大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜（Atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry，APCI-MS），前者可普適于電離各類脂質(zhì)分子，而后者更適合于分析脂肪酸類物質(zhì)和弱極性脂質(zhì)等［32］?？蛇x擇的質(zhì)量分析器有四極桿、三重四極桿、飛行時(shí)間、高分辨率軌道阱等，可根據(jù)不同的分析需求（如質(zhì)量分辨率、靈敏度、分析通量等）進(jìn)行合理選擇。盡管當(dāng)前脂質(zhì)組學(xué)的分離和檢測方法眾多，但在實(shí)際分析中仍然面臨諸多挑戰(zhàn)，如脂質(zhì)分子種類繁多、質(zhì)譜電離效率存在較大差異；實(shí)際樣品中脂質(zhì)含量動(dòng)態(tài)范圍寬、信號(hào)過飽和及檢測靈敏度不足時(shí)常發(fā)生；缺少合適的脂質(zhì)內(nèi)標(biāo)分子，導(dǎo)致定量能力有限；脂質(zhì)分子存在大量的同分異構(gòu)體，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)鑒定存在困難等。因此，除開發(fā)更高靈敏度和普適性的質(zhì)譜離子源外，還可開發(fā)合適的衍生化策略［33-34］、紫外光照裂解方法［35-36］、離子淌度數(shù)據(jù)庫［37-39］等，用以提高脂質(zhì)分子的電離效率、同分異構(gòu)體的鑒別能力等。

1.4 脂質(zhì)的質(zhì)譜成像方法

脂類的空間定位?？山Y(jié)合熒光染料或化學(xué)染色和顯微鏡技術(shù)進(jìn)行可視化，然而顯微鏡只能提供脂質(zhì)定位的定性信息，不能提供脂質(zhì)確切的化學(xué)組成。雖然核磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI）可以用來對(duì)植物組織中整體的脂質(zhì)分子進(jìn)行成像，提供無損且細(xì)致的代謝物三維成像［40］，但該技術(shù)常常受限于樣品性質(zhì)，同時(shí)無法原位分辨脂質(zhì)代謝物的不同脂質(zhì)類型和分子種類。因此，除傳統(tǒng)的基于勻漿制樣方式的脂質(zhì)組學(xué)策略外，近年來質(zhì)譜成像（Mass spectrometry imaging，MSI）技術(shù)因其具有無標(biāo)記、可視化等優(yōu)勢而被逐漸引入研究并形成空間分辨脂質(zhì)組學(xué)（Spatially resolved lipidomics）。該技術(shù)不僅具有一定程度的脂質(zhì)鑒定能力，還可非靶向提供多種脂質(zhì)分子在動(dòng)物、植物甚至單細(xì)胞水平的空間分布，為傳統(tǒng)的脂質(zhì)組學(xué)研究提供全新視角。此外，MSI 的另一優(yōu)勢在于可將具有前體/產(chǎn)物關(guān)系或參與某些相互關(guān)聯(lián)代謝途徑的代謝物進(jìn)行空間上的關(guān)聯(lián)定位。通過將動(dòng)/植物組織層面的PCs 與TAGs 的前體/產(chǎn)物等目標(biāo)脂質(zhì)可能存在的共定位進(jìn)行可視化分析，有助于在組織水平上揭示TAG生物合成的空間位置和活性。

根據(jù)離子源不同，目前可將MSI 技術(shù)分為基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜成像（Matrix-assisted laser desorption/ionization MSI，MALDI-MSI）、二次離子質(zhì)譜成像（Secondary ion mass spectrometry imaging，SIMS imaging）和解吸電噴霧電離質(zhì)譜成像（Desorption electrospray ionization MSI，DESIMSI）等［41］。其中，MALDI-MSI 是當(dāng)前在動(dòng)/植物脂質(zhì)成像應(yīng)用最廣泛的一類技術(shù)。Woodfield等［42］利用MALDI-MSI 技術(shù)揭示了油菜（Brassica napus）中甘油三酯和部分磷脂前體在子葉和胚軸中的組織特異性分布；Horn 等［19］通過MALDIMSI 技術(shù)，發(fā)現(xiàn)TAGs 和PCs 等脂質(zhì)分子主要貯存于陸地棉（Gossypium hirsutum）種子的胚中。然而，受限于光學(xué)衍射極限，MALDI-MSI技術(shù)的空間分辨率一般為20～100 μm，較難實(shí)現(xiàn)細(xì)胞甚至亞細(xì)胞器尺度的成像分析。最近，Yin等［43-44］為突破光學(xué)衍射極限以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞質(zhì)譜成像分析，研制了基于納米有孔光纖的近場激光解吸后電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，成功實(shí)現(xiàn)小分子藥物、代謝物及部分脂質(zhì)碎片在HeLa 細(xì)胞中的可視化定位；基于此，Li 等［45］和Meng 等［46］還成功實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞的三維質(zhì)譜成像，并對(duì)靶向抗癌藥物從進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核，并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡這一動(dòng)態(tài)過程實(shí)現(xiàn)可視化檢測。SIMS 技術(shù)是目前空間分辨率最高的一類MSI 技術(shù)，一般可根據(jù)離子束類別和束流大小分為動(dòng)態(tài)SIMS 和靜態(tài)SIMS。前者可獲得低至50 nm 的成像分辨率，但由于束流過大，所有分子結(jié)構(gòu)都會(huì)被打碎和電離為原子離子，因此主要適用于元素成像或同位素標(biāo)記成像；而靜態(tài)SIMS 兼具高空間分辨率和保留部分完整分子信息等優(yōu)點(diǎn)，可以獲得少量的脂質(zhì)分子或特征碎片離子，在脂質(zhì)成像應(yīng)用中有待進(jìn)一步發(fā)展。與MALDI 和SIMS 技術(shù)不同，DESI-MSI 技術(shù)是在大氣壓下進(jìn)行采樣電離，制樣簡單且更接近于原位檢測。通過將萃取溶劑在霧化氣和電壓的雙重作用下形成電噴霧，并以一定角度掃描樣品表面，從而快速萃取組織中的代謝物和脂質(zhì)分子，并形成帶電液滴以合適的角度進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)樣口，從而被質(zhì)譜檢測。例如，Morse等［47］通過DESI-MSI 技術(shù)對(duì)前列腺癌組織進(jìn)行成像分析，獲得25 個(gè)差異脂質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)癌變組織中的脂肪酸和腦磷脂會(huì)顯著上調(diào)；Sun 等［48］進(jìn)一步開發(fā)了空氣動(dòng)力輔助解吸電噴霧電離（Airflow-assisted desorption electrospray ionization，AFADESI）技術(shù)，以256 例人鱗片狀食管癌組織樣品為研究對(duì)象，成功實(shí)現(xiàn)篩選出與癌細(xì)胞代謝相關(guān)的差異代謝物和脂質(zhì)，并揭示包括脯氨酸合成、谷氨酸代謝和多胺生物合成等6 個(gè)代謝通路的含量及空間分布變化，為深入探究腫瘤的代謝過程提供全新視角。然而，DESI-MSI 技術(shù)由于空間分辨率（一般為幾百微米）較低，較難進(jìn)行一些微觀結(jié)構(gòu)的成像分析，且其在植物組織原位成像中容易受到樣品表面起伏和不平整等影響。

2 脂質(zhì)分析技術(shù)在植物種子脂質(zhì)代謝調(diào)控應(yīng)用研究

2.1 油菜（Brassica napus）種子

糧油作物的種子中含有大量的脂質(zhì)、淀粉和氨基酸，均為種子營養(yǎng)的來源。對(duì)糧油作物種子中與脂質(zhì)相關(guān)的潛在基因進(jìn)行探索，有利于種子的營養(yǎng)改良。甘藍(lán)型油菜是僅次于油棕和大豆的第三大植物油來源，產(chǎn)量約占全球食用油的15%［49］；且其與擬南芥中大部分基因序列高度一致，擁有約81%的保守序列［50］。因此，甘藍(lán)型油菜被認(rèn)為是一種理想的油料作物，可以將模式物種擬南芥的基礎(chǔ)知識(shí)直接進(jìn)行應(yīng)用轉(zhuǎn)化。在大多數(shù)植物中，油主要是以甘油三酯（TAG）形式儲(chǔ)存在種子組織中，主要聚集在胚和/或胚乳組織。最近，Woodfield 等［42］對(duì)甘藍(lán)型油菜籽粒進(jìn)行質(zhì)譜成像分析，揭示了油菜籽中主要儲(chǔ)存油脂的組織是子葉，但相當(dāng)一部分油脂可以在下胚軸、胚根和外周胚乳/糊粉層組織中積累。這些成像結(jié)果也表明種子中脂質(zhì)代謝可能在基因轉(zhuǎn)錄組和酶水平上存在差異調(diào)控機(jī)制［51-52］。同時(shí)，將MALDI-MSI 與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相結(jié)合的新策略，也有望揭示與脂質(zhì)組成和油脂含量相關(guān)的代謝產(chǎn)物和轉(zhuǎn)錄物的組織特異性差異原因［53］。Bhandari等［54］對(duì)萌發(fā)階段和成熟階段的油菜種子進(jìn)行質(zhì)譜成像分析，發(fā)現(xiàn)在種子萌發(fā)過程中，環(huán)亞精胺從種子的胚軸胚根區(qū)轉(zhuǎn)移到了正在萌發(fā)的幼根上，且三咖啡酰亞精胺表現(xiàn)出同樣的分布規(guī)律，表明亞精胺類物質(zhì)與胚軸胚根的發(fā)育息息相關(guān)，為揭示植物的生長發(fā)育提供了強(qiáng)有力的可視化研究工具。

最近，Lu 等［17］利用質(zhì)譜成像技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，深入探討影響油菜油脂代謝產(chǎn)物空間分布 的因素。以甘藍(lán)型油菜兩個(gè)具有高、低油脂積累特性的基因型（ZS11、WH5557）材料為研究對(duì)象，探究其油脂合成代謝產(chǎn)物和轉(zhuǎn)錄組的組織特異性差異。結(jié)果表明，兩種植物的PCs 和TAGs 代謝物均以組織特異性分布在整個(gè)胚中，其中C16∶0 ?；糠窒鄬?duì)于子葉來說會(huì)在胚軸（Embryonic axis，EA）富集。此外，高油脂積累特性的ZS11 基因型會(huì)使胚各部位的甘油三酯含量顯著升高，而磷脂酸（PA）含量顯著降低。單個(gè)種子組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析為脂質(zhì)的組織特異性分布以及油脂含量超過碳水化合物和脂肪酸（Fatty acid）代謝差異水平等提供了可能的解釋。基于此，上述研究結(jié)果為深入剖析油菜種子中脂質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)和油脂積累的潛在機(jī)制提供了重要見解。

2.2 陸地棉（Gossypium hirsutum L.）種子

陸地棉是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的多用途作物，如可以用于生產(chǎn)紡織品、食物配料籽油及飼養(yǎng)動(dòng)物的高蛋白飼料。除纖維或絨毛外，棉籽也是食用油的來源，同時(shí)油脂分離后的殘?jiān)部杀挥米鞣雌c牲畜的飼料或有機(jī)肥料。一般來說，棉籽含有大致相同含量的蛋白質(zhì)（20%～25%）和油脂（20%～25%）［55］。棉籽油組成約為26%棕櫚酸（C16∶0）、2% 硬脂酸（C18∶0）、15%油酸（C18∶1）和55%亞油酸（C18∶2）。此外，棉籽油還含有總含量約為1 000 mg/L 的生育酚，其中α 型和γ 型分別占生育酚含量的41%和58%。生育酚不僅具有重要的新陳代謝作用，還是一種強(qiáng)抗氧化劑，有助于延長棉籽油的保質(zhì)期，并保持油炸產(chǎn)品的新鮮度。Salimath 等［56］通過核特異性表達(dá)了HvHGGT基因，開發(fā)了轉(zhuǎn)基因棉系（HGGT1、HGGT2），實(shí)現(xiàn)棉籽營養(yǎng)價(jià)值的顯著增強(qiáng)。他們利用MALDI-MSI 技術(shù)驗(yàn)證了HGGT基因的種子特異性表達(dá)會(huì)導(dǎo)致生育三烯醇在棉花胚胎中合成和積累的假說。成像結(jié)果表明，α-生育酚主要集中在棉籽的子葉組織中，而γ-生育酚在Coker 312 和轉(zhuǎn)基因HGGT 胚系中相對(duì)富集在胚軸組織中，揭示了兩種生育酚差異性的空間分布。與之相比，新生成的γ-生育三烯酚相對(duì)均勻地分布在所有轉(zhuǎn)基因胚組織中，且HvHGGT在轉(zhuǎn)基因型胚中的表達(dá)量并不影響α-生育酚和γ-生育酚的分布［56］。同時(shí)，該研究探究了轉(zhuǎn)基因?qū)γ薹N生長發(fā)育、棉籽成分的總體影響，并評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因種子的抗氧化特性，選育了一個(gè)抗氧化特性增強(qiáng)和高生育三烯酚提取量的新型棉籽油品種［56］。

Liu 等［15］綜合利用代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)和MALDI-MSI 技術(shù)，探究兩個(gè)耐旱、耐鹽棉籽品種中差異代謝物和脂質(zhì)的空間分布規(guī)律。利用LC-MS/MS 鑒定得到17 種差異代謝物和125 種差異脂質(zhì)分子，并結(jié)合MALDI-MSI 技術(shù)對(duì)棉籽組織中9 個(gè)脂質(zhì)和4 個(gè)代謝物的含量及分布進(jìn)行了可視化分析。在負(fù)離子檢測模式下，成像結(jié)果表明PE（16∶0/18∶1）、PE（18∶2/18∶2）、PE（18∶1/18∶2）、PE（18∶1/18∶1）和PE（18∶0/18∶1）等脂質(zhì)在棉籽組織全身均有分布；而在正離子檢測模式下，顯著下調(diào)的DG（16∶0/14∶0）、TG（8∶0/10∶1/18∶2）和MePC（34∶1）以及上調(diào)的TG（19∶1/18∶2/18∶2）則主要積累在子葉位置。Liu 等推測這些中性甘油酯分子的組織特異性分布可能與干旱和鹽脅迫下其生物合成主要發(fā)生在子葉部位有關(guān)，這也進(jìn)一步證實(shí)子葉具有營養(yǎng)儲(chǔ)存的生理功能。綜上，通過整合LC-MS/MS 和MSI 技術(shù)，Liu 等揭示了差異性脂質(zhì)分子的代謝調(diào)控和空間分布特征，為后續(xù)進(jìn)一步研究棉花種子的耐旱和耐鹽機(jī)理提供了新的見解和理論依據(jù)。

2.3 擬南芥（Arabidopsis thaliana）種子

擬南芥是甘藍(lán)型油菜和亞麻薺（Camelina sativa）的近緣種，是一種廣泛應(yīng)用于探索種子中脂質(zhì)代謝生物化學(xué)及其調(diào)控機(jī)制的模式植物。20世紀(jì)90 年代開始，擬南芥便被用于鑒定和表征許多與甘油脂合成和酰基鏈去飽和和延伸有關(guān)的基因［57-58］。擬南芥資源豐富，且可在相對(duì)小的空間內(nèi)快速繁殖，有利于遺傳研究。擬南芥單個(gè)種子尺寸較小（約為500 μm×300 μm），如何在組織層面（如胚芽、胚軸、胚根或子葉）進(jìn)行空間特異性生物化學(xué)研究有待進(jìn)一步探究。為此，Sturt evant 等［53,59］基于質(zhì)譜成像技術(shù)繪制了擬南芥種子中PC 和PI 兩類重要磷脂物質(zhì)的三維空間分布，空間分辨率為15 μm×15 μm×20 μm，并揭示了調(diào)控脂質(zhì)代謝的基因發(fā)生變化會(huì)對(duì)種子細(xì)胞膜上脂質(zhì)分布產(chǎn)生不可預(yù)料的變化，且無法完全通過轉(zhuǎn)錄機(jī)制解析。質(zhì)譜成像結(jié)果表明，PC（34∶2）在貫穿胚胎的所有連續(xù)切片中富集于胚軸組織，而PC（34∶3）富集于外周胚乳層，PC（38∶3）在子葉組織的所有連續(xù)切片中均有富集。與PC 不同的是，PI（34∶2）富集于胚胎軸組織中，PI（36∶3）則富集在子葉組織中。由于PI 的?；鶊F(tuán)通常不被認(rèn)為是TAGs 的合成中間體［59］，因此PIs 的特異性分布很可能與一些重要功能或者脂質(zhì)代謝物儲(chǔ)存（如信號(hào)、膜穩(wěn)定性）相關(guān)。

此外，Sturtevant 等［53，59］還比較了fad2-1基因型和野生型種子的脂質(zhì)含量及分布差異，結(jié)果表明對(duì)于不同碳數(shù)的PC 物質(zhì)（如C34、C36 和C38 等），它們在fad2-1基因型和野生型中分布差異最為顯著。其中，fad2-1基因型的脂質(zhì)變化大部分是由于脂肪酸組成的改變，如C18∶2和C18∶3 脂肪酸減少，而C18∶1 脂肪酸增加，從而產(chǎn)生占主導(dǎo)地位的含C18∶1 脂肪酸的PC 分子〔PC（34∶1）、PC（38∶2）和PC（36∶2）〕。同時(shí)，在fad2-1基因型的擬南芥種子中，PC（34∶1）、PC（38∶2）和PC（36∶2）也表現(xiàn)出不同程度的異質(zhì)性，如PC（38∶2）優(yōu)先定位于子葉組織，而PC（34∶1）和PC（36∶2）相對(duì)均勻分布在整個(gè)子葉和胚胎軸組織。由于FAD2 會(huì)影響含C18∶1 脂肪酸的PC 分子含量，且在fad2-1突變體中仍可觀測到外周胚乳組織中PC（34∶3）的空間分布，表明可能存在其他去飽和酶導(dǎo)致這些細(xì)胞類型中多不飽和脂肪酸的形成。同樣地，在fad2-1突變體種子中也形成少量PC（34∶2）、PC（36∶4）和PC（36∶3）等脂質(zhì)，但這主要局限于胚芽外周胚芽和胚根尖端組織，表明這些組織中C18∶2 和C18∶3 脂肪酸的合成可能有另一種途徑。PC（34∶3）在子葉和胚軸中含量降低、但在外周胚乳中仍存在，這與fad2-1突變體中多不飽和PC 分子主要在外周胚乳定位相似，表明可能存在相似的去飽和途徑。此外，在fad3-2突變體中，PC（36∶5）幾乎完全缺失，僅在外周胚乳中微量存在，這可能是由于C18∶3 脂肪酸含量減少。

除PC 磷脂分子外，Sturtevant 等在負(fù)離子檢測模式下，對(duì)PI 分子在野生型和突變體中的空間分布進(jìn)行了可視化檢測。結(jié)果表明，F(xiàn)AD2 突變在PI 中產(chǎn)生了包含C18:1 脂肪酸鏈的新脂質(zhì)種類，PI（34∶1）相對(duì)均勻地分布在子葉和軸之間，而PI（36∶2）相對(duì)于軸則更優(yōu)先分布在子葉中。同時(shí)，成像結(jié)果表明在fad2-1種子的外周胚乳和軸組織中仍然可以檢測到PI（34∶2），表明這些組織中可能存在C18∶1 和C18∶2 脂肪酸的其他去飽和方式［59］。這些分子種類組成和空間定位的差異與PC 可能用于PI 合成的二?；视筒糠忠恢隆？傮w來說，通過MALDI-MSI 獲得的PI 脂質(zhì)相對(duì)含量與通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)獲得的定量結(jié)果大體一致。通過質(zhì)譜分析確定各PI 分子的?；溄M成，為PI 分子的鑒定提供理論依據(jù)。

2.4 玉米（Zea mays L.）種子

玉米油主要由59%多不飽和脂肪酸、24%單不飽和脂肪酸和13%飽和脂肪酸組成［60］。玉米含油量與其經(jīng)濟(jì)價(jià)值息息相關(guān)，而基因工程在提高玉米含油量方面功不可沒［61］。例如，玉米粒為玉米提供許多養(yǎng)分，包括脂肪、淀粉、蛋白質(zhì)，對(duì)玉米籽粒已鑒定脂質(zhì)的潛在基因資源進(jìn)行表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)［62］，編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的GPC1、GPC2、GPC3 和GPC4 在授粉后的不同時(shí)間點(diǎn)和不同內(nèi)核區(qū)室中在核細(xì)胞中高度表達(dá)。結(jié)合脂質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)譜能夠?yàn)樨S富玉米分子育種策略提供重要信息；Zheng 等［63］發(fā)現(xiàn)一個(gè)影響玉米籽粒油分以及油酸含量的高油QTL（qHO6）編碼二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（DGTA1-2），該基因的過表達(dá)能增加將近一倍的油酸含量，具有降低人體內(nèi)有害膽固醇、保留有益膽固醇以及軟化心腦血管的優(yōu)點(diǎn)。

種子萌發(fā)是一個(gè)高度復(fù)雜的過程，種子在相對(duì)干燥的狀態(tài)下進(jìn)行休眠，能夠長時(shí)間存活，并通過水的吸脹來觸發(fā)種子萌發(fā)過程。許多代謝物在種子萌發(fā)過程中都發(fā)生顯著變化，其中大多數(shù)與種子貯藏物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、多糖和脂類）的分解代謝相關(guān)。為此，F(xiàn)eenstra 等［18］利用質(zhì)譜成像技術(shù)對(duì)玉米籽粒萌發(fā)過程中的小分子代謝物進(jìn)行時(shí)空可視化分析。例如，脂質(zhì)會(huì)以TAG 分子形式儲(chǔ)存在一種特殊的玉米組織——盾片（Scutellum）以及通過β-氧化分解代謝脂肪酸的含量以提供拉長胚軸的一個(gè)能源來源，脂肪酸中的碳可以用來組裝新碳，支持胚生長的代謝中間體。同時(shí)隨著萌發(fā)開始，胚軸的胚根開始伸長，TAGs 開始非均勻性分布，與其他脂肪酸和磷脂分子分布一致［64］。在吸脹后36 h，F(xiàn)eenstra 等比較了4 種不同類型的脂質(zhì)分子（如PE、PA、PI 和PC）在萌發(fā)種子中的空間定位，為評(píng)估不同脂酰鏈組合產(chǎn)生的磷脂分子種類的分布提供了理論依據(jù)［64］。隨著胚的擴(kuò)張，胚乳被消耗，會(huì)產(chǎn)生新的細(xì)胞，而4 種磷脂在胚中是最豐富的。在兩個(gè)自交系中，不飽和?；溩疃嗟牧字?6∶4）在胚根和其他胚組織中分布均勻。對(duì)于PI、PC 和PA 來說，不飽和磷脂較多（如36∶3 和36∶2）在胚根中的濃度低于其他胚組織。相比之下，PE 具有獨(dú)特的定位模式，雙鍵數(shù)量為偶數(shù)的分子（如36∶4 和36∶2）在整個(gè)胚胎中均勻分布，包括胚根；但雙鍵數(shù)量為奇數(shù)的分子（如36∶3 和36∶1）在發(fā)育中的胚根中較少。在種子萌發(fā)過程中的所有時(shí)間點(diǎn)存在不同脂質(zhì)具有獨(dú)特的空間積累模式［64］。

2.5 其他物種的種子

Dalisay 等［65］利用基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)、質(zhì)譜成像和生物信息學(xué)等技術(shù)手段，研究亞麻（Linum usitatissimum）蒴果和種子組織中聚合木酚素和植物防御物質(zhì)氰基糖苷在不同生長發(fā)育階段的時(shí)空分布規(guī)律。油籽的工程成分變化通常通過引入新的酶促步驟和/或通過種子特異性的方式阻斷或增強(qiáng)現(xiàn)有的酶促步驟實(shí)現(xiàn)。而在實(shí)際生產(chǎn)中，種子中積累脂質(zhì)種類的數(shù)量往往與人們從酶表達(dá)水平預(yù)測的不同，這些不一致可能源于對(duì)細(xì)胞/組織水平上脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)的不完全理解。為此，Horn 等［66］通過質(zhì)譜成像方法發(fā)現(xiàn)三酰甘油及其磷脂前體在油料作物亞麻芥（Camelina sativa）胚胎的子葉和下胚軸/胚根軸內(nèi)分布不同，表明甘油三酯代謝物具有組織特異性分布。富含亞油酸18∶2 脂肪鏈的PCs和TAGs 優(yōu)先定位于軸狀組織，而富含甘碳烯酸C20∶1 的脂類代謝物優(yōu)先定位于子葉。通過異源過表達(dá)酰基-?；d體蛋白硫酯酶（Acyl-acyl carrier protein thioesterase），或通過抑制脂肪酸去飽和酶和延長酶來控制種子脂質(zhì)組成，導(dǎo)致新的種子存儲(chǔ)脂質(zhì)時(shí)磷脂和TAGs 在轉(zhuǎn)基因胚中的分布模式發(fā)生改變。該研究結(jié)果揭示了亞麻芥胚中先前未知的?；|(zhì)分布差異規(guī)律，并暗示這種脂質(zhì)的空間異質(zhì)性能否在轉(zhuǎn)基因種子中得到有效改變，主要取決于種子的靶向酶（Targeted enzyme）或代謝途徑。

3 結(jié)語

高通量基因組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組技術(shù)的相繼興起預(yù)示多組學(xué)時(shí)代的到來。脂質(zhì)組學(xué)作為代謝組學(xué)中的重要組成部分之一，在過去10 年已得到長足發(fā)展，脂質(zhì)提取、富集效率、鑒定數(shù)量上均得到極大提升。植物種子中含有大量的脂質(zhì)、淀粉和氨基酸，這些都是種子營養(yǎng)的來源。利用脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)挖掘這些植物種子，特別是糧油作物種子中脂質(zhì)相關(guān)的潛在基因，有助于植物種子的營養(yǎng)品質(zhì)改良［67-68］。此外，植物中的脂質(zhì)在逆境脅迫應(yīng)答過程中同樣扮演重要角色，不僅可以幫助植物抵御逆境脅迫，還可作為信號(hào)分子參與非生物脅迫過程中的信號(hào)傳導(dǎo)。今后研究可多關(guān)注植物在抗逆響應(yīng)過程中的脂質(zhì)合成、空間定位和信號(hào)傳導(dǎo)等，有望更加系統(tǒng)地揭示植物脂質(zhì)應(yīng)答逆境脅迫的機(jī)理。

隨著質(zhì)譜儀器的空間分辨率和檢測靈敏度的快速發(fā)展，基于質(zhì)譜成像的脂質(zhì)組學(xué)新方法得以興起，并為其拓展到植物領(lǐng)域研究帶來新契機(jī)。目前，質(zhì)譜成像技術(shù)已被廣泛應(yīng)用到植物種子中代謝物和脂質(zhì)分子的可視化成像中，為揭示植物種子生長發(fā)育過程中脂質(zhì)代謝調(diào)控機(jī)制提供了技術(shù)支撐和理論依據(jù)。然而，鑒于脂質(zhì)分類繁多且結(jié)構(gòu)多樣化，基于質(zhì)譜成像的脂質(zhì)組學(xué)策略仍然存在一些局限性，如無法同時(shí)獲得關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄（mRNA）和翻譯（蛋白質(zhì)）信息；針對(duì)種類繁多且豐度差異的不同脂質(zhì)，MSI 技術(shù)仍然面臨基質(zhì)不相容和檢測靈敏度不足等問題；受限于光學(xué)衍射極限，MSI 技術(shù)在單細(xì)胞層面的脂質(zhì)分布成像方法仍有待進(jìn)一步開發(fā)；由于在組織層面存在異質(zhì)性，導(dǎo)致目前定量質(zhì)譜成像分析仍然具有較大挑戰(zhàn)，通過開發(fā)新型衍生化試劑或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的均勻引入將有助于提高M(jìn)SI 定量能力。相信在不久的將來，隨著高空間分辨MSI 技術(shù)的不斷發(fā)展和新型基質(zhì)的不斷開發(fā)，該技術(shù)將會(huì)在植物細(xì)胞的脂質(zhì)代謝調(diào)控研究中展現(xiàn)更廣闊的應(yīng)用前景。同時(shí)，多組學(xué)技術(shù)（如基因組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組、蛋白組等）本身已經(jīng)提供了豐富的生物學(xué)信息，通過進(jìn)一步在高空間分辨率上對(duì)這些脂質(zhì)進(jìn)行空間定位，將有助于在組織甚至單細(xì)胞層面對(duì)脂質(zhì)代謝產(chǎn)生全新的認(rèn)識(shí)。