羅永堅，葛 蓉，劉 軍，李 清

（廣東省農業(yè)科學院農業(yè)生物基因研究中心/廣東省農作物種質資源保存與利用重點實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】生長素是一種普遍存在的激素，在多種植物發(fā)育過程中起著重要作用，如細胞分裂、胚胎發(fā)生、維管束伸展、側根起始、葉片伸展、開花、果實成熟、頂端優(yōu)勢、向下生長和抗逆性［1］。生長素并不直接參與這些調節(jié)作用，而是通過的生長素信號的轉導的受體，如AUX/IAA（auxin/indole-3-acetic acid）、ARF（auxin response factor）、GH3（Gretchen hagen 3）和SAUR（small auxin-up RNA）［2-3］。其中，AUX/IAA 蛋白作為生長素信號通路的重要組成部分，該蛋白主要存在細胞質和細胞核中且存在時間較短［4-5］，通過釋放生長素反應因子（Auxin Response Factors）參與生長素信號通路調控下游大量的基因表達［6-8］。小豆（Vigna angularis），又名紅豆、紅小豆，豆科（Leguminosae）蝶形花亞科（Papilionoideae）豇豆屬（Vigna）的一種1 年生直立或纏繞草本作物［9］，已有12 000 年的栽培歷史［10］。在當今大力發(fā)展優(yōu)質、高效農業(yè)的時代背景下，小豆已成為首選作物之一。但在實際生產中，作物常常會因不可避免的環(huán)境脅迫而減產，甚至絕收［11］。而AUX/IAA基因家族在植物的生長發(fā)育和植物逆境脅迫應答過程中都起著重要作用，目前已在多種植物中開展了相關研究，但在小豆中AUX/IAA基因家族還尚未進行系統(tǒng)研究和報道?！厩叭搜芯窟M展】Aux/IAA蛋白一般具有4 個典型的保守結構域（Domain Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），該基因家族中也包括缺失一個或兩個結構域的蛋白質［7］。其中，Domain Ⅰ是由一個亮氨酸重復基序（“LxLxL”）組成，充當乙烯應答因子（ERF）與EAR 基序結合的阻遏域［12-14］，結構域Ⅱ是AUX/IAA 不穩(wěn)定的關鍵成分，存在與降解子高度保守序列（GWPPV），能被泛素酶體蛋白（TIP1）所識別并降解［15-17］。結構域Ⅲ和Ⅳ中C 末端結構域上存在介導AUX/IAA 蛋白和生長素反應因子同源或異源二聚化［7,18-19］。自從AUX/IAA基因首次從大豆中被鑒定出來［20］，目前，已從多個植物的全基因組中鑒定出AUX/IAA基因家族，其中擬南芥（Arabidopsis thaliana）［21］、毛果楊（Populus trichocarpaTorr）［22］、番茄（Lycopersicon esculentum）［23］、高粱（Sorghum bicolor）［24］、葡萄（Vitis vinifera）［25］、水稻（Oryza sativa）［26］和玉米（Zea mays）［27］。據相關報道，AUX/IAA基因家族的成員在植物的生長發(fā)育過程中具有不同的生物學功能，對植物的性狀起著重要的調控作用［28］。如：在白花蛇舌草（Hedyotis diffusa）中，HcIAA2和HcIAA4在花香形成過程中起著重要作用［29］。紫花苜蓿（Medicago sativa）的MtIAA6和MtIAA7具有根特異性表達，MtIAA9在花中的表達水平較高［30］。在中華龍竹（Dendrocalamus barbatus）中，DsIAA3、DsIAA4、DsIAA15和DsIAA20可能是調控新梢發(fā)育的重要基因［31］。VvIAA4［32］、VvIAA9［33］、SlIAA15［34］、SlIAA17［35］是果實結實過程的關鍵調節(jié)因子。OsIAA5［36］和OsIAA6［37］與水稻的耐旱性具有關聯(lián)性。在擬南芥中，AtIAA5、AtIAA6和AtIAA9阻遏蛋白通過特異性調控脂肪族芥子油苷的表達來影響植物的耐旱性［38］?！颈狙芯壳腥朦c】基于已公布的小豆基因組和轉錄組數據，利用生物信息學方法鑒定小豆中的AUX/IAA基因，并從理化性質、系統(tǒng)進化、基因結構、蛋白質互作分析、各組織的基因表達水平等進行分析?！緮M解決的關鍵問題】本研究為后續(xù)闡明AUX/IAA基因的相關功能研究提供一定的試驗基礎和理論依據。

1 材料與方法

1.1 家族成員鑒定及蛋白質理化性質分析

從Esembl Plant 數據庫（http://plants.ensembl.org/index.html）下載小豆全部蛋白質序列，從Pfam 數據庫（http://pfam.xfam.org/）中下載AUX/IAA 保守結構域的HMM 模型，利用HMMER3.0軟件和本地BLASTP 程序設置閾值E-value 值≤e-10 鑒定含有AUX/IAA 蛋白結構域的序列，通過SMARTG1，CDD［39-40］在線軟件預測候選蛋白質序列。利用Expasy［41］分析小豆AUX/IAA成員的蛋白質序列長度、分子量及等電點。利用Euk-mP-Loc2.0 進行亞細胞定位。利用prabi（https://npsa-prabi.ibcp.fr/）在線分析軟件進行二級結構分析。

1.2 系統(tǒng)進化樹構建

AUX/IAA 氨基酸序列在MEGA X 軟件采用鄰近法（Neighbor-joining）構建系統(tǒng)進化樹，其中Bootstrap 設置為1000，構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，用iTOL（https://itol.embl.de/itol.cgi）對進化樹進行分類和注釋。

1.3 保守基序和基因結構分析

利用在線軟件MEME（https://meme-suite.org/meme/doc/meme.html）對小豆AUX/IAA 蛋白保守基序，其中利用在線網站CSDS2.0（https://www.csds2.0.in/）對小豆AUX/IAA基因家族成員進行結構分析，通過Tbtools 軟件對小豆AUX/IAA 蛋白保守基序和保守結構域結合其系統(tǒng)進化樹進行可視化分析。

1.4 加倍復制分析及Ka、Ks 計算

使用Linux 版本的MCScan-X［42］軟件，分別對小豆基因組內共線性進行分析，并利用TBtools［43］軟件和繪圖程序將結果可視化，將共線性基因計算Ka/Ks 值。

1.5 順式作用元件分析

提取AUX/IAA家族基因上游1 500 bp 長度的序列作為啟動子序列，提交到Plant CARE［44］（http://bioinformatics.psb.ugent.be/）數據庫，對小豆AUX/IAA家族基因進行上游順式作用元件分析，預測轉錄因子可識別并特異性結合的順式作用元件。

1.6 蛋白-蛋白互作網絡及GO 功能注釋

基于在線分析軟件STRING（https://string-db.org/），將小豆AUX/IAA基因家族氨基酸序列與模式植物擬南芥庫作為參考進行比對，對AUX/IAA基因的蛋白-蛋白互作信息進行評估和預測。

1.7 基因表達模式分析

在NCBI 的SRA 數據庫下載8 個小豆組織（葉、根、胚軸、花、根瘤、頂端、幼莢、子葉）以及0.9 mmol/L NaCl 幼苗鹽脅迫的RNA-seq 數據（PRJDB3778,PRJNA576763）［45］，計算表達量FPKM，繪制表達圖譜。

2 結果與分析

2.1 基因家族成員鑒定及理化性質分析

從小豆全基因組中篩選出41 個完整和非重復冗余的AUX/IAA 蛋白序列，根據基因在染色體位置上進行排序，分析AUX/IAA基因的理化性質。結果（表1）表明，小豆AUX/IAA基因編碼的多肽為86～1 120 個氨基酸殘基，相對分子質量為9 461.5～125 292.9 u，等電點為4.53～10.37。在蛋白親水性方面41 個VaIAA蛋白親水性系數均小于1，為親水性蛋白，亞細胞定位顯示均為定位為細胞核，與其響應生長素轉導位置相同。預測蛋白的二級結構，α-螺旋占比為7.93%～43.02%，β-轉角占比為1.86%～8.39%，延伸鏈占比為12.88%～25.00%，無規(guī)則卷曲占比為34.88%～65.37%，從結果來看，VaIAA蛋白以無規(guī)則卷曲和a-螺旋為主體結構，β-轉角及延伸鏈為次要結構。

表1 小豆AUX/IAA 家族成員理化性質分析Table 1 Analysis of physicochemical properties of AUX/IAA family members in Vigna angularis

2.2 AUX/IAA 蛋白的系統(tǒng)進化

將本研究鑒定出的41 個VaIAAs基因與擬南芥和水稻AUX/IAA基因構建系統(tǒng)發(fā)育樹，共分為6 個類別（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ），Ⅰ類包含10 個IAA 基因（9 個VaIAAs、1 個AtIAAs），Ⅱ類包含22 個IAA 基因（8 個AtIAAs、6 個OsIAAs、8 個VaIAAs），Ⅲ類包含20 個IAA 基因（6個AtIAAs、8 個OsIAAs、6 個VaIAAs），Ⅳ類包含21 個IAA 基因（10 個AtIAAs、5 個OsIAAs、6 個VaIAAs），Ⅴ類包含15 個IAA 基因（4 個AtIAAs、9 個OsIAAs、2 個VaIAAs），Ⅵ類包含31 個IAA 基因（12 個AtIAAs、6 個OsIAAs、13個VaIAAs）。進化關系中呈現(xiàn)7 對姐妹對，其余為擬南芥與水稻；旁系同源蛋白占75.86%（22對），小豆10 對、擬南芥11 對、水稻11 對，其余全為直系同源蛋白（圖1）。

圖1 小豆 AUX/IAA 基因家族進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of AUX/IAA gene family in Vigna angularis

2.3 蛋白基序及基因結構分析

為探究VaIAAs家族的保守性，在可信范圍（e-value ≤e-5）內，VaIAA家族成員編碼蛋白共含有10 種motif，分別命名為motif 1～motif 10。結果（圖2）顯示，共有41 個成員具有4 個完整的典型保守結構域（保守基序）：Domain Ⅰ（motif 3）、Domain Ⅱ（motif 9）、Domain Ⅲ（motif 10）、Domain Ⅳ（motif 2）。其中Domain Ⅰ（motif 3）在所有AUX/IAA基因中均鑒定到，有4 個成員（VaIAA08/04/015/07）發(fā)生了Domain Ⅳ（motif 9）缺失；而Domain Ⅱ（motif 9）、Domain Ⅲ（motif 10）只在部分基因中鑒定得到。而基因的結構在決定基因的表達和功能中起著重要因素，而且基因結構多樣性是許多基因家族進化的主要動力。因此，對小豆AUX/IAA基因家族結構進行分析。結果（圖2）表明，多數VaAUX/IAA包含4 個內含子，即多具有5 個外顯子和4 個內含子的典型基因結構模式，相同的基因結構和保守基序的基因在聚類在一起提高了系統(tǒng)發(fā)育樹的準確性。

圖2 小豆AUX/IAA 家族基因結構及保守基序Fig.2 Gene structure and conserved motifs of AUX/IAA family in Vigna angularis

2.4 小豆AUX/IAA 家族基因的染色體定位、種內共線性和選擇壓力分析

通過染色體定位，結果（圖3）表明41 條VaIAA基因不均勻地分布在9 條染色體上，其中2 號染色體上分布最多，有9 個VaIAA成員；共線性分析結果（圖3）顯示，41 個VaIAA家族成員存在13 對共線性關系，所有基因均為片段復制。通過計算基因對的Ka/Ks 值，發(fā)現(xiàn)Ka/Ks 值均小于1，說明VaIAA基因在進化過程中可能經歷受到純化選擇壓力的影響。

2.5 小豆AUX/IAA 轉錄因子順式作用元件分析

通過plantCARE 對VaIAAs基因上游1.5 kb進行啟動子順式作用元件分析，結果（圖4）發(fā)現(xiàn)共有51 種順式作用元件，對VaIAAs基因順式作用元件分類可分為響應生物/非生物脅迫、植物激素、生長發(fā)育的順式作用元件。其中參與響應生物/非生物脅迫順式作用元件最多，包括最常識別到的ATTATA.bos、G-box 和sp1 基序，還發(fā)現(xiàn)富集在厭氧誘導響應元件ARE 和植物抗逆相關的MYB 元件。植物激素響應元件共12 種，包括赤霉素響應元件（P-box）、茉莉酸響應元件（TGAGG-motif）和水楊酸響應元件（TCA-element）和乙烯響應元件（ERE）。在參與植物生長發(fā)育順式元件共有14 個，其中VaIAA基因富集在TATA.box、CAAT.box、ABRE，其 中TATA-box基序在預測元件中數目最多。順式作用元件分析結果表明，VaIAA基因存在不同的反應基序，不同的VaIAA成員在基序上富集情況和作用模式不盡相同，說明VaIAA基因在植物生長及逆境脅迫響應中發(fā)揮重要作用。

2.6 蛋白-蛋白互作網絡及GO 功能富集分析

為研究VaIAAs家族蛋白間的相互作用，以擬南芥為參考對象構建VaIAAs蛋白與其他蛋白的調控網絡。預測結果（圖5）表明，整個互作網絡中共有25 個節(jié)點，節(jié)點間存在227 組蛋白互作關系，所有VaIAAs均與ARF 蛋白產生互作關系，其中存在一些IAA 之間存在蛋白互作關系，15 個VaIAA基因與AXR3（生長素誘導阻遏因子），20 個VaIAAs基因與MP（轉錄因子B3 家族蛋白），暗示VaIAAs蛋白可能受多種蛋白調控。

圖5 小豆 VaIAAs 家族蛋白互作網絡Fig.5 Protein interaction network of VaIAAs family in Vigna angularis

為更好理解VaIAAs的功能，將所有VaIAAs轉錄因子進行基因本體注釋（Gene ontology），結果見圖6，GO 功能注釋主要富集在生物過程（Biological Process）、細胞組分（Cellular Component）和分子功能（Molecular Function）3大類。其中，生物進程富集的基因通路最多，分子功能次之，細胞成分最少，在生物過程分類中，所有主要富集在生長素信號激活通路和轉錄調控功能，細胞組成分類中AUX/IAA基因主要參與細胞和細胞核的組成，在分子功能中主要富集在DNA 結合和DNA 轉錄因子活性。

圖6 小豆 VaIAAs 家族基因GO 富集分析Fig.6 GO enrichment analysis of VaIAAs gene family in Vigna angularis

2.7 小豆不同組織基因表達分析

VaIAAs基因的組織特異性表達模式與生物學功能密切相關，利用小豆在葉、根、胚軸和花等不同組織的RNA-seq 數據對41 個VaIAAs成員在不同組織中的轉錄水平進行分析，結果（圖7A）表明有10 個基因在各組織表達量較低（FPKM＜10），包括7 個成員（VaI AA0 8/17/18/05/15/23/12/31/32/22）。大多數AUX/IAA基因在莖和花組織上表達較高，在幼莢和子葉這兩個組織中VaIAAs表達水平相對于其他組織低。還發(fā)現(xiàn)VaIAA08/17/22/15/12在組織間的表達差異最小，表明這些基因的調控可能主要發(fā)生在翻譯后水平。而VaIAA39/29在多個組中均表達較高，可這能參與小豆整個生長過程。此外還發(fā)現(xiàn)VaAUX/IAA基因在不同組織的優(yōu)先表達，表明這些基因可能在組織特異性轉錄因子下發(fā)揮作用，參與小豆特定組織的發(fā)育進程?；贜aCl脅迫下RNA-seq 數據比較18 個DlIAAs 的表達水平，結果（圖7B）顯示有10 個V aIAAs（VaI AA12/20/40/14/03/26/32/01/07/31）表達顯著上調，推測這10 個成員可能在鹽脅迫下起關鍵的作用。

圖7 小豆 VaIAAs 家族基因在RNA-seq 的表達Fig.7 Expression of VaIAAs gene f amily of Vigna angularis in different RNA-seq databases

3 討論

植物在生長過程中受到多種激素的影響，生長素是植物生長發(fā)育過程中的關鍵信號分子。作為最早發(fā)現(xiàn)的植物激素，其生理作用廣泛，影響細胞的分裂、擴大和分化。AUX/IAA 蛋白在植物生長素信號轉導通路中被認為與ARFs結合，在沒有生長素的情況下阻止生長素反應基因的激活，以調控植物的生長［46］。研究AUX/IAA 的功能和表達圖譜有助于揭示生長素是如何調控植物體的生長發(fā)育和響應特定時空上的環(huán)境變化。隨著高通量測序技術的發(fā)展，已經對許多植物的全基因組進行了測序，并在多種植物中發(fā)現(xiàn)了大量的AUX/IAA基因。小豆的全基因組公布使得在基因組水平上鑒定分析AUX/IAA 基因家族成為可能。在本研究中，在小豆全基因組中共鑒定出41個AUX/IAA 基因家族，而在前人的研究中如：擬南芥鑒定出29 個成員［21］，毛果楊中鑒定出35個成員［22］，番茄［23］、高粱［24］、葡萄［25］中均包含26 個成員，水稻［26］和玉米［27］中鑒定出31個成員，這表明不同植物物種之間AUX/IAA基因家族的數量存在很大差異。

利用NJ 法將41 個VaIAAs基因與雙子葉植物擬南芥和單子葉植物水稻AUX/IAA基因進行系統(tǒng)發(fā)育分析。結果分為6 類，其中VaIAAs主要集中在Ⅰ類和Ⅵ類（58.53%），因此，推斷聚類在一起的IAAs基因結構或功能可能為高度相同且具有保守性。在進化關系中呈現(xiàn)7 對姐妹對，其中3 對姐妹對是小豆與擬南芥，其余均為擬南芥與水稻形成的姐妹對，這可能是因為小豆和擬南芥都為雙子葉植物VaIAAs與AtIAAs在進化關系上更近，而相近的蛋白序列在植物生理上具有相似功能?；蚣易鍞U張的主要動力是片段復制和串聯(lián)復制［47］，VaIAAs家族中10 對旁系同源蛋白，均無串聯(lián)復制事件，由小豆基因組內共線性分析，發(fā)現(xiàn)VaIAAs基因家族中共有13 對復制基因，且Ka/Ks 均小于1，說明片段復制為VaIAAs基因家族進化擴張的主要動力，這可能與其基因組在進化過程中經歷了多次全基因組復制事件有關［48］。

基因的表達往往受到啟動子區(qū)域順式作用元件的調控，本研究鑒定了3 類直接參與生長素信號通路的順式元件。鑒于AUX/IAA蛋白作為光信號和生長素反應之間的連接物，在VaIAAs基因的啟動子區(qū)域中觀察到12 種對光信號有反應的順式元件。此外，生長素還可以在植物防御反應中發(fā)揮調節(jié)作用［49］。在VaIAAs基因啟動子序列中還發(fā)現(xiàn)了4 種與病原菌抗性相關的順式元件。此外，在VaIAA基因的啟動子區(qū)域還發(fā)現(xiàn)了與非生物脅迫適應相關的順式元件，如DRE（脫水反應元件）、LTRE（低溫反應元件）。VaIAAs基因啟動子中存在不同的順式元件說明生長素信號轉導可以與其他代謝途徑相互作用。生長素和非生物脅迫信號通路之間的串擾已經在水稻中得到證實［50］。毫無疑問，VaIAAs基因啟動子中順式元件的多樣性也與AUX/IAA蛋白在植物生命中起著關鍵作用有關。

植物的基因在不同組織中的特異性表達在不同發(fā)育階段調控中起著重要作用，基因表達調控導致植物對生長、發(fā)育、非生物和生物脅迫產生響應［51］。RNA-seq 顯示幾乎所有VaIAAs基因均有表達，但在不同發(fā)育階段，其表達水平有較大差異。許多變量可能導致Aux/IAA基因表達的差異，包括組織特異性生長素受體、細胞類型依賴性、游離生長素濃度的差異調節(jié)、生長素依賴性轉錄的不同模式和轉錄后調節(jié)等［52］。而值得注意的是，在本研究發(fā)現(xiàn)VaIAA41基因在小豆根瘤組織的基因中表達水平較高。豆科植物與根瘤菌共生固氮是植物氮素營養(yǎng)的一個重要來源［53］，因此根瘤的發(fā)育對節(jié)約氮肥具有重要作用，有研究表明IAA的積累對根瘤菌的形成具有正向效應［54］，推測該基因可能在小豆根瘤組織或者在根的發(fā)育和生長過程中發(fā)揮重要作用。而在0.9 mmol/L NaCl 脅迫處理的RNA-seq 數據中，有10個VaIAA（VaIAA12/20/40/14/03/26/32/01/07/31）在NaCl 處理1 h 后表達量顯著上調，是對照組的7 倍，此外對這10 個基因順式作用元件檢索發(fā)現(xiàn)含有多個MYB 和ARF 作用元件。有研究表明，Aux/IAA 通過與植株生長素反應因子ARF（auxin response factor）結合抑制了生長素誘導基因的表達，在生長素所調控的對鹽脅迫的響應過程中起著核心作用［55］,表明這些基因可能直接或間接響應調控小豆的抗鹽能力。

4 結論

本研究以小豆基因組數據為基礎，鑒定并分析了小豆中AUX/IAA轉錄因子家族成員的基因結構、理化性質、保守基序、系統(tǒng)發(fā)育關系、染色體定位、共線性關系和順式作用元件。分析結果表明，從小豆全基因組中共鑒定出41 個AUX/IAA基因，系統(tǒng)進化將其分為6 個亞族（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ）?；蚨ㄎ伙@示，41 個AUX/IAA基因不均勻地分布在9 條染色體上。基因結構分析表明，AUX/IAA中外顯子的數目從1～17 個不等，同一亞族內的成員具有相似的基因結構和基序組成。AUX/IAA轉錄因子氨基酸數目為86～1 120 個；蛋白質分子量為9 461.5～123 898.4 u；等電點在4.53～10.37，AUX/IAA基因都定位在細胞核上。順式作用元件分析表明，大多數AUX/IAA基因含有1 個或多個順式作用元件，表明AUX/IAA基因可能響應不同的非生物脅迫。不同條件下的表達模式分析結果為進一步研究AUX/IAA基因在小豆生長發(fā)育和非生物脅迫響應中潛在的功能提供有價值的信息，進而促進AUX/IAA基因在小豆抗逆分子育種中的應用。