趙家更，曾慶云，祝木星

（山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南 250355）

川芎-延胡索藥對(duì)選自曹貽訓(xùn)名老中醫(yī)治療腰椎間盤(pán)突出癥的經(jīng)典驗(yàn)方“腎痹湯”，在曹老多年治療腰椎間盤(pán)突出的過(guò)程當(dāng)中，發(fā)現(xiàn)其對(duì)腰椎間盤(pán)突出癥的療效顯著。方中延胡索能夠活血、行氣、止痛，川芎則在此基礎(chǔ)上具有祛風(fēng)除濕之效?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明，川芎主要由揮發(fā)性油類、苯酞內(nèi)酯、有機(jī)酚酸和板栗多糖等物質(zhì)所構(gòu)成；到目前為止，川芎中共記載有149個(gè)化合物，其已報(bào)道的生物學(xué)活性主要涉及對(duì)心血管疾病的療效、作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抗炎和抗氧化等功能，對(duì)細(xì)胞發(fā)炎因子和凋亡因子的控制也是川芎中表達(dá)這些生物學(xué)活性物質(zhì)的主要機(jī)制[1]。延胡索所具有的各種化學(xué)成份在中樞神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)、消化吸收網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)、人體心血管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)和垂體腎上腺皮層網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中均能形成影響，從而起到鎮(zhèn)定、抗緊張、催眠現(xiàn)象、止痛、抗心律失常、耐潰瘍、抗缺氧性心肌等功效[2]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，藥物的配伍一般遵循君臣佐使等觀念，而現(xiàn)代藥理研究多關(guān)注于單個(gè)藥物或單個(gè)成分對(duì)于相關(guān)疾病或靶點(diǎn)的作用。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)多層次、多角度網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，通過(guò)分析川芎-延胡索藥對(duì)的有效成分和藥效靶點(diǎn)，進(jìn)一步篩選并進(jìn)行富集分析，為臨床研究和應(yīng)用提供相關(guān)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 化學(xué)成分的獲取與篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）中輸入川芎、北紫堇等進(jìn)行檢索，并以生物有效利用量（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18的條件，篩選出潛在的生物活性成份。

1.2 潛在有效成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的獲取與整理 從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)一步檢測(cè)出川芎、北紫堇等潛在有效成分及其所對(duì)應(yīng)的靶位，并于Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（http://lsp.nwu.edu.cn/tcm-spsearch.php）中找到對(duì)應(yīng)的人類基因，將其導(dǎo)出至Excel以備后續(xù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.3 腰椎間盤(pán)突出癥靶點(diǎn)獲取 登錄GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/），并以Lumbar Disc Herniation、Lumbar Disc Protrusion、Lumbar Intervertebral Disc Protrusion和Prolapse of Lumbar Intervertebral Disc等關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，以獲取有關(guān)腰椎間盤(pán)突出癥的各種關(guān)鍵靶點(diǎn)信息，并導(dǎo)出至Excel中，為后期數(shù)據(jù)處理做好準(zhǔn)備。

1.4 繪制韋恩圖并獲取交集靶點(diǎn) 運(yùn)用Venny網(wǎng)站，通過(guò)上傳川芎、北紫堇藥物相對(duì)的相互作用靶位和腰椎間盤(pán)突出癥的相關(guān)靶位，完成韋恩圖的描繪并獲得藥物和患者的交集靶位。

1.5 藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過(guò)Cytoscape軟件對(duì)收集到的藥品潛在活性成份和藥品與患者的交叉靶位進(jìn)行分類處理，形成藥品-成分-病變-靶點(diǎn)系絡(luò)圖。

1.6 富集分析利用David數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)（https://David.ncifcrf.gov/）對(duì)交集靶基因?qū)崿F(xiàn)go解析和KEGG解析。

2 結(jié)果

2.1 潛在有效成分篩選結(jié)果 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索，并在以生物有效利用量（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18的條件下進(jìn)行篩選，川芎的化學(xué)成分組成中有7個(gè)潛在有效成分，延胡索有49個(gè)潛在有效成分，其中谷甾醇（sitosterol）是二者中共同的重復(fù)成份，故總共得到了55個(gè)潛在活性成份，即谷甾醇、槲皮素、大豆甾醇、黃連素、延胡索堿等，詳見(jiàn)表1。

表1 川芎-延胡索藥對(duì)的潛在有效成分

續(xù)表

2.2 藥物、疾病交集靶點(diǎn)篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中共發(fā)現(xiàn)與川芎、北紫堇等潛在活性成份對(duì)應(yīng)的靶位共858個(gè)，將上述靶位信息輸入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)中可以找到相應(yīng)的人類基因；從GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中，搜索得到的腰椎間盤(pán)突出癥相關(guān)靶位共396個(gè)，在利用Venny網(wǎng)站進(jìn)行大數(shù)據(jù)分析之后，得出藥物與病變所共同的靶位共46個(gè)，并進(jìn)行韋恩圖的繪制，見(jiàn)圖1。

圖1 藥物-疾病靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖繪制 將藥品活性成份和靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)信息輸入Cytoscape軟件，得到構(gòu)成藥品-成份-病情-靶點(diǎn)的網(wǎng)路圖，見(jiàn)圖2。圖中節(jié)點(diǎn)分為病癥、藥品、藥品成份、靶位，連線說(shuō)明了病癥、藥品、藥品成份和靶位之間所存在的交叉關(guān)聯(lián)（其中紅色六邊形代表病癥，綠色六邊形代表藥品，藍(lán)色六邊形代表藥品成份，黃色圓圈代表交集靶點(diǎn)）。此圖可以明確顯示川芎-延胡索藥對(duì)通過(guò)多種成分、多種靶點(diǎn)對(duì)腰椎間盤(pán)突出癥發(fā)揮治療作用，其中度值（Degree值及節(jié)點(diǎn)連線數(shù)量）最高的5種成分為：槲皮素、二氫血根堿、荷包牡丹堿、13-甲基棕櫚酸酯、Izoteolin，說(shuō)明這些成分為川芎-延胡索藥對(duì)治療腰椎間盤(pán)突出癥的主要成分。

圖2 藥物-疾病-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO分析 將藥物與疾病交集靶點(diǎn)的相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入David數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行富集分析，以P Value≤0.05為條件篩選出靠前的分子功能、生物學(xué)過(guò)程及細(xì)胞組分，繪制成柱形圖，見(jiàn)圖3～圖5。其中BP分析（圖3）排名靠前的有核糖核酸聚合酶ii啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄正調(diào)控（positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter，18個(gè)靶點(diǎn)，39.13%）、信號(hào)傳導(dǎo)（signal transduction，15個(gè)靶點(diǎn)，32.61%）、基因表達(dá)的正向調(diào)節(jié)（positive regulation of gene expression，13個(gè)靶點(diǎn)，28.26%）、炎癥應(yīng)答（inflammatory response，13個(gè)靶點(diǎn)，28.26%）、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)節(jié)（negative regulation of cell proliferation，13個(gè)靶點(diǎn)，28.26%）等生物學(xué)過(guò)程。MF分析（圖4）排名靠前的有蛋白活性（cytokine activity，39個(gè)靶點(diǎn)，84.78%）、酶 結(jié) 合（enzyme binding，10個(gè) 靶 點(diǎn)，21.74%）、蛋 白 結(jié) 合（protein binding，10個(gè) 靶 點(diǎn)，21.74%）、細(xì)胞因子活性（cytokine activity，9個(gè)靶點(diǎn)，19.57%）、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性（7個(gè)靶點(diǎn)，15.22%）等分子功能。CC分析（圖5）中排名靠前的有細(xì)胞外空間（extracellular space，26個(gè)靶點(diǎn)，56.52%）、細(xì)胞外區(qū)域（extracellular region，22個(gè)靶點(diǎn)，47.82%）、細(xì)胞溶質(zhì)（cytosol，19個(gè)靶點(diǎn)，41.30%）、質(zhì)膜（plasma membrane，17個(gè)靶點(diǎn)，36.96%）、細(xì)胞外外體（extracellular exosome，13個(gè)靶點(diǎn)，28.26%）等細(xì)胞組分。

圖3 GO分析生物學(xué)過(guò)程

圖4 GO分析分子功能

圖5 GO分析細(xì)胞組分

2.5 KEGG通路分析 使用David數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)川芎-延胡索藥對(duì)與腰椎間盤(pán)突出癥的46個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行分析，得到P Value≤0.05的通路共84個(gè)，篩選其P Value最小的10條通路制成表格，見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，川芎-延胡索藥對(duì)治療腰椎間盤(pán)突出癥的機(jī)制主要涉及腫瘤壞死因子信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、恰加斯?。–hagas disease）、癌癥通路（pathways in cancer）、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis）、百日咳（pertussis）、膀胱癌（bladder cancer）、缺氧誘導(dǎo)因子-1信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway）、利什曼病（Leishmaniasis）、甲型流感（influenza A）、Toll樣受體信號(hào)通路（Toll-like receptor signaling pathway）等通路。因此，推測(cè)川芎-延胡索藥對(duì)治療腰椎間盤(pán)突出癥可能與上述通路關(guān)系密切。

表2 P Value最小的10條通路

3 討論

腰椎間盤(pán)突出癥是脊柱外科的常見(jiàn)病之一，近年久坐、缺乏鍛煉已成為現(xiàn)代人普遍的行為習(xí)慣，這也導(dǎo)致了腰椎間盤(pán)突出癥發(fā)病率日益增長(zhǎng)，患病年齡也在不斷減小。腰椎間盤(pán)突出癥主要表現(xiàn)為腰痛、下肢麻木及放射痛、肌力下降、活動(dòng)受限、感覺(jué)減退等,中醫(yī)學(xué)將其歸為“腰腿痛”范疇，主要治療大法為活血化瘀、行氣止痛、祛風(fēng)散寒、補(bǔ)益肝腎等。腎痹湯是曹貽訓(xùn)名老中醫(yī)的經(jīng)典驗(yàn)方，由芥子、獨(dú)活、三七、川芎、延胡索、白術(shù)、穿山龍、黃芪、黨參、全蝎、地龍、桂枝、茯苓、牛膝、丹參、當(dāng)歸、白芍、赤芍、續(xù)斷、杜仲、槲寄生、巴戟天、狗脊、葛根、木瓜、甘草等26味中藥組成。方中川芎、延胡索配伍發(fā)揮活血行氣、散瘀止痛的功效，在多年的臨床用藥中，通過(guò)加減化裁應(yīng)對(duì)不同腰椎間盤(pán)突出癥病例，配合其他藥物及鍛煉，在保守治療過(guò)程中療效顯著，但川芎-延胡索藥對(duì)治療腰椎間盤(pán)突出癥的作用機(jī)制尚不明確。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從川芎-延胡索藥對(duì)中檢索出55個(gè)有效成分，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)858個(gè)，其中與腰椎間盤(pán)突出癥致病靶點(diǎn)重合者共46個(gè)。在Cytoscape軟件構(gòu)成的藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中，共有101個(gè)節(jié)點(diǎn)、301個(gè)邊，證明川芎-延胡索從多個(gè)靶點(diǎn)、利用多種成分對(duì)腰椎間盤(pán)突出癥進(jìn)行治療。延胡索中的槲皮素作用于40個(gè)靶點(diǎn)，在所有成分中排名第一。槲皮素是一種天然的黃酮類物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗氧化、抗感染、免疫抑制、心血管保護(hù)和血糖調(diào)節(jié)等多種藥理作用[3]。王業(yè)楊等[4]研究表明，槲皮素可以抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡從而減輕脊髓損傷。盧桃利等[5]研究表明，槲皮素可以促進(jìn)小鼠脊髓損傷后巨噬細(xì)胞表型由M1向M2表型轉(zhuǎn)變，抑制炎性因子的表達(dá)，對(duì)炎性反應(yīng)的調(diào)控是其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的可能機(jī)制之一。二氫血根堿存在于多種植物的提取物中，具有廣泛的藥理作用。張乙濤等[6]研究表明，血根堿（sanguinarine）作為一種苯菲啶異喹啉類生物堿，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、改善肝功能及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用。馬寧寧等[7]研究表明，二氫血根堿通過(guò)作用于ERK2、IKKβ、JAK1、PKC，影響下游蛋白表達(dá)，阻礙抗炎信號(hào)的傳遞，從而發(fā)揮抗炎作用。荷包牡丹堿，別名山烏龜堿，具有陣痛、鎮(zhèn)靜等功效。郭錳等[8]研究表明，荷包牡丹堿可以抑制人肝癌MHCC97-H細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲，該作用與下調(diào)VEGF、MMP-2、MMP-9基因表達(dá)及抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的活化有關(guān)。汪詩(shī)卉等[9]研究表明，荷包牡丹堿在體外對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖與生長(zhǎng)具有抑制作用，可促進(jìn)其凋亡，其作用可能與Bcl-2/Bax降低導(dǎo)致Caspase-3活化有關(guān)。劉巖等[10]研究表明，荷包牡丹堿能有效抑制人肺腺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng)，使細(xì)胞周期阻滯在S期，進(jìn)一步誘導(dǎo)其凋亡，并使caspase-3蛋白活化。由此可見(jiàn)，川芎-延胡索藥對(duì)中的槲皮素、二氫血根堿、荷包牡丹堿等有效成分，具有抗炎、抗氧化、改善肝功能、抗腫瘤等功效，可能是治療LDH的有效成分。

從藥物-疾病-活性成分-靶點(diǎn)圖上可知，前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、μ型阿片受體（OPRM1）、雄激素受體（AR）、鈉依賴性血清素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SLC6A4）、雌激素受體蛋白（ESR1）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（NOS2）、乙酰膽堿酯酶（ACHE）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、縫隙連接α-1蛋白（GJA1）、原癌基因c-Fos（FOS）等可能是川芎-延胡索治療LDH的主要靶蛋白。GO富集分析得出，川芎-延胡索藥對(duì)治療腰椎間盤(pán)突出癥主要涉及核糖核酸聚合酶ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)的正向調(diào)節(jié)、炎癥應(yīng)答、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)節(jié)、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié)，DNA模板、血管生成、一氧化氮生物合成過(guò)程的正向調(diào)節(jié)、對(duì)脂多糖的細(xì)胞反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程；涉及蛋白質(zhì)異二聚活性、受體結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚活性、染色質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、絲氨酸內(nèi)肽酶活性、細(xì)胞因子活性、相同蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白結(jié)合等分子功能；涉及細(xì)胞外空間、細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞溶質(zhì)、質(zhì)膜、細(xì)胞外外體、線粒體、薄膜筏、細(xì)胞表面、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、神經(jīng)元投射等細(xì)胞組分，其過(guò)程較為復(fù)雜。

經(jīng)過(guò)KEGG富集分析得出，被明顯富集的信號(hào)通路共有10條。其中腫瘤壞死因子信號(hào)通路（TNF signaling pathway）可誘導(dǎo)多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，包括凋亡、細(xì)胞存活、炎癥和免疫。黃蓓等[11]研究發(fā)現(xiàn)，TNF信號(hào)通路中的TNF-α不僅可以使其信號(hào)通路發(fā)生異常，還可以與其他促炎性細(xì)胞因子刺激破骨細(xì)胞分化和活化，而引起骨丟失，刺激滑膜成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生降解軟骨的蛋白酶，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)和軟骨的破壞。張丹等[12]研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1在成血管-成骨耦連反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，作為上游基因調(diào)控著體內(nèi)多種成血管、成骨基因的表達(dá)，促進(jìn)血管形成的同時(shí)，協(xié)同促進(jìn)骨的再生。劉莉菲等[13]研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α通過(guò)直接調(diào)節(jié)多種骨組織細(xì)胞、促進(jìn)骨血管生成、改變糖酵解途徑等方式對(duì)骨組織的生長(zhǎng)和重塑過(guò)程進(jìn)行調(diào)控，從而對(duì)骨相關(guān)腫瘤、股骨頭壞死、HO等病理過(guò)程產(chǎn)生重要影響。此外，癌癥、恰加斯病、甲型流感等信號(hào)通路也富集了較多的基因，因此推斷川芎-延胡索藥對(duì)可能通過(guò)以上信號(hào)通路發(fā)揮治療腰椎間盤(pán)突出癥的作用。

綜上所述，川芎-延胡索在治療腰椎間盤(pán)突出癥上具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法初步預(yù)測(cè)了川芎-延胡索治療LDH的核心靶點(diǎn)，以期為進(jìn)一步的分子生物學(xué)和藥理學(xué)研究提供理論基礎(chǔ)。