楊雪， 顏志豪， 劉錦， 胡玉萍， 黎淑芳

1.柳州市人民醫(yī)院，廣西壯族自治區(qū) 柳州（545006）； 2.右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西壯族自治區(qū) 百色（533000）

直接蓋髓術(shù)的目的是利用蓋髓材料物理性封閉露髓點，直接與牙髓組織接觸的蓋髓材料同時起到消除牙髓感染和炎癥的作用，保持牙髓內(nèi)穩(wěn)態(tài)，同時誘導(dǎo)露髓處鈣化橋形成，最終形成鈣化屏障以達到生物性封閉露髓孔的作用。富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）作為第二代血小板凝聚物，具有抑制牙髓炎癥反應(yīng)，刺激成牙本質(zhì)細胞分化的作用［1］。而相較于單獨使用PRF 或三氧化礦物凝聚體（mineral trioxide aggregate，MTA）來培養(yǎng)人牙髓細胞，PRF 與MTA 聯(lián)合培養(yǎng)的細胞具備更高的形成牙本質(zhì)的能力［2］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用錐形束CT 從影像學(xué)角度觀察PRF 聯(lián)合MTA 促進礦化組織形成的水平與MTA 無差異，都處于較高水平［3］，但牙髓組織狀態(tài)、生成的鈣化橋結(jié)構(gòu)仍需進一步深入研究。本研究擬從組織學(xué)角度，觀察炎癥細胞浸潤程度、鈣化橋形成程度及牙髓組織變性程度，比較各組實驗牙的牙髓損傷修復(fù)效果。

1 材料和方法

1.1 主要材料

低速冷凍離心機（miVac DUO，Genevac，英國）；硬組織切片機（RM2016，Leica，德國）；MTA（登士柏，德國）；常規(guī)手術(shù)器械。3%戊巴比妥鈉溶液（邁瑞達，中國）；玻璃離子水門?。ǘ?，日本）；14%EDTA 溶液（貝康，中國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物及分組 2019 年4 月22 日于實驗動物中心購買32 只健康雄性新西蘭兔（動物合格證號：000103292），體重2.5～3.0 kg，兔齡5 個月，隨機分為4 組，即PRF+MTA 組（P+M 組）、PRF 組（P 組）、MTA 組（M 組）、空白對照組（BC 組），每組8 只，同一只兔的2 顆下頜中切牙納入同一實驗組，整個實驗由兩組操作人員完成，即PRF 膜制備組、直接蓋髓術(shù)操作組。已通過實驗動物倫理委員會的審查（審批號：20190215016）。

1.2.2 PRF 膜的制備 為排除麻醉藥物對PRF 制備的影響，在麻醉前進行采血，采血完畢后立即進行動物麻醉，麻醉藥物為3%戊巴比妥鈉溶液，劑量為30 mg/kg。自兔耳緣靜脈采血，采血量為4～5 mL，在3 000 r/min 下離心10 min，靜置5 min，用無菌鑷鉗取凝膠狀復(fù)合物，剪掉下層紅細胞，剩余中間凝聚物為凝膠狀PRF，將凝膠狀PRF 置于2 個無菌板間輕壓，制成厚度約為0.5 mm 的PRF 膜。此過程由PRF 膜制備組操作人員完成。

1.2.3 直接蓋髓術(shù)操作過程 碘伏消毒牙齦，切開下頜中切牙頰側(cè)牙齦，翻瓣，去除頰側(cè)部分骨壁，充分暴露下頜中切牙，用006 號球鉆在下頜中切牙唇面?zhèn)涠粗炼吹淄讣t但無滲血時，用自制直徑為0.5 mm 的探針輕輕加壓穿髓，生理鹽水沖洗，10%NaClO 溶液棉球止血3～5 min（圖1a）。

根據(jù)不同分組放置相應(yīng)的蓋髓劑，P+M 組：將合適大小的PRF 膜覆蓋于暴露牙髓組織表面，再在PRF 膜表面及周圍大部分牙本質(zhì)覆蓋一層MTA。P 組：PRF 膜覆蓋于暴露牙髓組織表面。M組：MTA 覆蓋于暴露牙髓組織及周圍大部分的牙本質(zhì)。BC 組：穿髓孔處不放蓋髓劑。放置蓋髓劑后，所有樣本均用玻璃離子水門汀嚴密充填窩洞，嚴密縫合牙齦（圖1b～1d）。此過程由直接蓋髓術(shù)組操作人員完成。

Figure 1 Direct capping procedure of mandibular central incisors in rabbit圖1 兔下頜中切牙直接蓋髓術(shù)操作過程

1.3 樣本HE 染色及觀察

1.3.1 取材及染色 術(shù)后7 d、術(shù)后28 d 從每個實驗組中隨機選擇4 只實驗兔并處死，立即用福爾馬林溶液對下頜骨進行固定，48 h 后棄固定液，分離實驗牙，用14%EDTA 溶液對實驗牙進行脫鈣2 個月?？v向包埋，切片，厚度為4 μm，選擇經(jīng)過穿髓孔中心的切片進行HE 染色，光鏡下進行讀片，綜合參考El-Din、Soliman 等［4-5］的評價標準進行分級。讀片由1 名牙體牙髓病?？漆t(yī)師、1 名病理科醫(yī)師完成，如遇意見不統(tǒng)一的情況，另外請1 名病理科醫(yī)師給予評價，最終確認分級。

1.3.2 直接蓋髓術(shù)的組織學(xué)療效評價指標 ①炎癥細胞浸潤，即穿髓孔周圍炎癥細胞浸潤程度，分為3 等級，1 為輕度炎癥（無或炎癥細胞散在分布），2 為中度炎癥（密集或帶狀炎癥細胞浸潤），3 為重度炎癥（大量炎癥浸潤，局灶性或大面積組織壞死）。②鈣化橋形成程度，即鈣化屏障覆蓋范圍，分為3 等級，1 為覆蓋大部分牙髓暴露面（≥50%露髓區(qū)域）；2 為覆蓋小部分牙髓暴露面（＜50%露髓區(qū)域）；3 為沒有鈣化橋形成。③牙髓變性程度，包括牙髓結(jié)構(gòu)及細胞形態(tài)，分為3 等級，1 為牙髓組織結(jié)構(gòu)、細胞形態(tài)正?；蚧菊?；2 為成牙本質(zhì)細胞層破壞，但深部牙髓組織結(jié)構(gòu)基本正常；3 為牙髓失去正常組織結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)壞死灶。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，多樣本比較選擇Kruskal-wallis 單因素ANOVA 分析法，同時進行多重比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

7 d 時，P+M 組有1 顆實驗牙暫封物脫落，排除1 顆實驗牙。28 d 時，P 組有1 只實驗兔死亡，排除2 顆實驗牙。最終實驗樣本數(shù)為61。

兔下頜中切牙正常牙髓的基本組織學(xué)的表現(xiàn)（圖2）：可見明顯的成牙本質(zhì)細胞層、多細胞層及髓核結(jié)構(gòu)，但未見乏細胞層。

2.1 各組實驗牙HE 染色結(jié)果

Figure 2 Basic histologic image of the normal pulp of the mandibular central incisors in rabbits(HE×100)圖2 兔下頜中切牙正常牙髓的基本組織學(xué)的表現(xiàn)（HE×100）

2.1.1 P+M 組 術(shù)后7 d，穿髓孔處出現(xiàn)少量炎癥細胞，穿髓孔稍下方見鈣化橋形成，鈣化橋與刺激性牙本質(zhì)幾乎完全相連，幾乎覆蓋整個穿髓孔；牙髓組織結(jié)構(gòu)、細胞形態(tài)基本正常，髓腔內(nèi)見炎癥細胞散在分布，血管稍充血。術(shù)后28 d，穿髓孔處壞死崩解物形成，稍下方見鈣化橋與刺激性牙本質(zhì)完全相連，鈣化橋形成覆蓋整個穿髓孔；牙髓組織結(jié)構(gòu)、細胞形態(tài)基本正常，髓腔內(nèi)見大量鈣化組織形成（圖3a1、3a2）。

2.1.2 P 組 術(shù)后7 d，穿髓孔處較多炎癥細胞浸潤，稍下方見不規(guī)則鈣化橋形成，覆蓋小部分穿髓孔；牙髓失去正常組織結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)壞死灶，大量血管擴張，髓腔內(nèi)見少量鈣化組織。術(shù)后28 d，穿髓孔處見部分壞死組織、牙本質(zhì)碎屑，稍向下方見較多炎癥細胞浸潤，幾乎未見鈣化橋封閉穿髓孔；但髓腔內(nèi)見大量不規(guī)則鈣化組織形成，牙髓組織結(jié)構(gòu)不清（圖3b1、3b2）。

2.1.3 M 組 術(shù)后7 d，穿髓孔處出現(xiàn)少量炎癥細胞，鈣化橋覆蓋小部分穿髓孔；牙髓結(jié)構(gòu)紊亂，髓腔內(nèi)見大量鈣化組織形成。術(shù)后28 d，穿髓孔處見部分壞死組織，稍下方見鈣化橋形成，覆蓋大部分穿髓孔區(qū)域；牙髓組織結(jié)構(gòu)、細胞形態(tài)基本正常（圖3c1、3c2）。

2.1.4 BC 組 術(shù)后7 d，穿髓孔處及髓腔內(nèi)大量炎癥細胞聚集分布，穿髓孔處無鈣化橋形成，深部牙髓見大量鈣化組織填滿髓腔，細胞成分減少，血管充血明顯。術(shù)后28 d，穿髓孔周圍及髓腔內(nèi)見大量無定形結(jié)構(gòu)的壞死組織（圖3d1、3d2）。

本研究各組實驗牙形成的鈣化橋具有相似的組織學(xué)特征，在其中選取清晰且視野較好的2 張圖片以比較骨小梁、骨樣牙本質(zhì)、鈣化橋的結(jié)構(gòu)，圖4a 來源于術(shù)后7 d 的BC 組，圖4b 來源于術(shù)后7 d 的P+M 組。骨樣牙本質(zhì)具有骨小梁的特征，即骨小梁內(nèi)部包埋著為卵圓形骨細胞（圖4a）。本實驗中，實驗牙髓腔可見修復(fù)性牙本質(zhì)形成，因形成的修復(fù)性牙本質(zhì)內(nèi)部含細胞，髓腔側(cè)為成牙本質(zhì)樣細胞層，也可稱為骨樣牙本質(zhì)（圖4b）；本研究中各組實驗牙形成的鈣化橋內(nèi)部含細胞成分，周圍牙本質(zhì)樣細胞包繞，其結(jié)構(gòu)似骨樣牙本質(zhì)（圖4b）。

2.2 各組牙髓組織學(xué)分級情況及統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果

對各組實驗牙牙髓組織學(xué)分級情況進行統(tǒng)計學(xué)分析，術(shù)后7 d、術(shù)后28 d 各組間的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1），組間多重比較結(jié)果如下。

表1 各組牙髓組織學(xué)分級情況及統(tǒng)計結(jié)果Table 1 Overview and statistical results of histological grading of dental pulp in each group

2.2.1 炎癥細胞浸潤程度 術(shù)后7 d 和28 d，P+M組、M 組均較BC 組炎癥細胞浸潤程度輕，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；P+M 組與M 組炎癥細胞浸潤程度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；術(shù)后28 d，P+M 組較P 組炎癥細胞浸潤程度輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖5a）。

2.2.2 鈣化橋形成程度 術(shù)后7 d 和28 d，P+M 組鈣化橋形成程度較P 組、M 組、BC 組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；術(shù)后28 d，M 組鈣化橋形成程度較BC 組高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；P組與M 組間鈣化橋形成程度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖5b）。

2.2.3 牙髓變性程度 術(shù)后7 d，P+M 組、M 組均較BC 組牙髓變性程度輕，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；術(shù)后28 d，P+M 組較P 組、BC 組牙髓變性程度輕，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；P+M 組與M組間牙髓變性程度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；P 組與M 組間牙髓變性程度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖5c）。

3 討 論

3.1 直接蓋髓術(shù)的療效分析

PRF 由自體血制成，以自身結(jié)構(gòu)為支架，能夠釋放多種直接密切參與細胞生長、增殖、調(diào)節(jié)炎性活動和血管生成過程的生長因子，自身可降解從而被新生的組織替代［6］，已逐漸被應(yīng)用于牙髓再生［7］、活髓保存［8］和根尖手術(shù)［9］等牙體牙髓臨床治療措施中。Dou 等［10］通過體外細胞學(xué)實驗研究發(fā)現(xiàn)PRF 具有良好的生物相容性、低細胞毒性和促進人牙髓細胞增殖和分化功能，同時能提高堿性磷酸酶活性，促進礦化，具備直接蓋髓材料的優(yōu)良特性。但因PRF 膜濕潤、易溶解吸收［11］的理化性質(zhì)，PRF 作為直接蓋髓材料并未廣泛應(yīng)用于臨床，國內(nèi)外的相關(guān)研究主要集中在PRF 誘導(dǎo)牙髓細胞/牙髓干細胞向成牙本質(zhì)細胞分化的能力和機制研究［12-14］，PRF 用于直接蓋髓術(shù)的動物實驗研究卻較為少見。有動物實驗研究發(fā)現(xiàn)PRF 用于直接蓋髓術(shù)時，幾乎無修復(fù)性牙本質(zhì)形成，且牙髓內(nèi)呈現(xiàn)程度較重的炎癥反應(yīng)［15］。本研究中，P 組開髓孔稍下方可見少量鈣化橋形成，炎癥細胞浸潤程度較BC組輕，但較M 組和P+M 組重。分析其原因，PRF 膜的降解時間最短為4 d，最長為8 d［16］，其降解的同時自身釋放抗炎因子轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1），當PRF 膜降解后，具有一定細胞毒性的玻璃離子水門汀［17］直接與牙髓組織接觸，但抗炎因子的作用與玻璃離子水門汀產(chǎn)生的細胞毒性起到一定中和作用，從而使得P 組的炎癥細胞浸潤程度較BC 組低；PRF 單獨應(yīng)用時，邊緣封閉性較差，因此炎癥細胞浸潤程度比M 組和P+M 組更重。

Figure 3 Histological images of pulp in each group 7 days and 28 days after direct pulp capping of rabbit teeth圖3 兔牙直接蓋髓術(shù)術(shù)后7 d、28 d 各組牙髓組織學(xué)表現(xiàn)

Figure 4 Histological features of bone trabecula,osteodentin and calcified bridge 7 days after direct pulp capping of rabbit teeth圖4 兔牙直接蓋髓術(shù)術(shù)后7 d 骨小梁、骨樣牙本質(zhì)及鈣化橋組織學(xué)表現(xiàn)

Figure 5 Pairwise comparisons of histological grading of dental pulp between groups圖5 各組牙髓組織分級組間兩兩比較

MTA 是一種具有高密封性能、優(yōu)良抗菌性能和良好生物相容性的生物活性材料，研究表明，與氫氧化鈣相比，MTA 用于直接蓋髓后形成的牙本質(zhì)橋質(zhì)量更高，即孔隙少，鈣化橋厚，且牙髓炎癥較輕［18-20］。MTA 已應(yīng)用于齲源性露髓成熟恒牙的直接蓋髓術(shù)，實現(xiàn)恒牙的活髓保存，取得較好臨床效果［21-22］。本研究中，對比P+M 組與M 組，發(fā)現(xiàn)P+M 組炎癥反應(yīng)與M 組相當，但形成鈣化橋的程度較MTA 組高，說明PRF 聯(lián)合MTA 作為蓋髓劑應(yīng)用于直接蓋髓術(shù)具有較高可行性。

3.2 鈣化橋組織學(xué)結(jié)構(gòu)特征

當修復(fù)性牙本質(zhì)以較快速度形成時，成牙本質(zhì)細胞常還未移行至髓腔側(cè)就被自身分泌的牙本質(zhì)基質(zhì)包裹，進而被包埋在間質(zhì)中，以后這些細胞變性，在該處遺留一空隙，很像骨組織，具備這樣結(jié)構(gòu)的修復(fù)性牙本質(zhì)稱之為骨樣牙本質(zhì)［23］。本研究實驗牙穿髓孔下方形成的鈣化橋的結(jié)構(gòu)類似于骨樣牙本質(zhì)，具有類似于牙本質(zhì)和骨小梁的組織學(xué)特征，鈣化橋內(nèi)部未出現(xiàn)牙本質(zhì)小管樣結(jié)構(gòu)。本課題組發(fā)現(xiàn)，在構(gòu)建直接蓋髓術(shù)實驗?zāi)Ｐ蜁r，對牙髓組織形成一定刺激，導(dǎo)致實驗牙深部牙髓形成大量修復(fù)性牙本質(zhì)，內(nèi)部多含有細胞，髓腔側(cè)為成牙本質(zhì)細胞層，組織學(xué)表現(xiàn)為骨樣牙本質(zhì)，但此修復(fù)性牙本質(zhì)同樣未見明顯牙本質(zhì)小管。而Tran等［24］發(fā)現(xiàn)將硅酸鈣材料用于大鼠磨牙直接蓋髓術(shù)時，穿髓孔處可形成結(jié)構(gòu)類似于初期牙本質(zhì)的修復(fù)性牙本質(zhì)，可見排列紊亂的牙本質(zhì)小管。這可能是由于實驗動物不同造成的，兔屬于嚙齒動物，牙齒生長速度快，因此本研究觀察到兔正常牙髓組織中未見明顯乏細胞層，在外界刺激下，缺乏細胞突起的成牙本質(zhì)樣細胞被包埋在快速形成的間質(zhì)中，最終在深部牙髓中的原發(fā)性牙本質(zhì)的髓腔側(cè)形成缺乏小管樣結(jié)構(gòu)的骨樣牙本質(zhì)，在穿髓孔下方形成了類似骨樣牙本質(zhì)的鈣化橋。但也有研究發(fā)現(xiàn)，骨樣牙本質(zhì)或纖維樣牙本質(zhì)的形成先于管狀牙本質(zhì)的形成，當成牙本質(zhì)樣細胞層形成后，管狀牙本質(zhì)相繼形成，這一序列與實驗?zāi)Ｐ偷奈锓N、年齡和干預(yù)措施無關(guān)［25］。

3.3 直接蓋髓術(shù)后牙髓損傷修復(fù)過程

本實驗中，蓋髓劑下方以鈣化灶不斷融合形成鈣化橋的方式封閉穿髓孔，這與Suzuki 等［26］的研究有所差別，其研究發(fā)現(xiàn)低粘度粘結(jié)劑用于大鼠直接蓋髓術(shù)時，蓋髓劑下方以層層包裹式形成的牙本質(zhì)橋封閉穿髓孔。光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，術(shù)后7 d，散在鈣化灶并非出現(xiàn)在穿髓孔處，而是在穿髓孔稍下方生成，彌散的鈣化灶逐漸融合形成鈣化橋。備洞及穿髓、蓋髓劑的覆蓋都對實驗牙牙髓造成刺激，從而激發(fā)穿髓孔周圍原有的成牙本質(zhì)細胞的生物活性，形成刺激性牙本質(zhì)，最終鈣化橋與刺激性牙本質(zhì)相連以封閉穿髓孔。

在實驗初期，蓋髓劑與新生的鈣化橋之間存在少量混合著細胞、纖維、鈣化灶的組織，這三層組織類似于三明治結(jié)構(gòu)，此后，鈣化橋與蓋髓劑之間出現(xiàn)少量壞死組織。可能是因為蓋髓材料不斷釋放離子，導(dǎo)致夾在蓋髓劑和鈣化橋之間的組織處于酸堿平衡失調(diào)狀態(tài)，微環(huán)境改變，同時由于缺少營養(yǎng)供給進一步發(fā)生變性壞死，但穿髓孔及下方區(qū)域的牙髓損傷修復(fù)的細胞來源和過程較為復(fù)雜，此推論仍需大量研究進行驗證。

3.4 實驗設(shè)計不足與展望

本實驗尚存在一定不足，術(shù)后觀察時間設(shè)置不夠合理，本實驗只設(shè)置了2個時間點，在術(shù)后7 d，穿髓孔下方已觀察到鈣化橋形成，可設(shè)置更早期并延長后期觀察時間，如將觀察時間設(shè)置為術(shù)后3、7、14、28、54 d，這樣的設(shè)置可能更利于觀察牙髓損傷修復(fù)的動態(tài)過程。

綜上所述，PRF 聯(lián)合MTA 應(yīng)用于直接蓋髓術(shù)時，牙髓炎癥反應(yīng)程度較輕且與MTA 相當，但形成鈣化橋的能力較MTA 強，鈣化橋的結(jié)構(gòu)類似于骨樣牙本質(zhì)。但其促進鈣化橋形成的動態(tài)過程不明，且蓋髓材料是否會影響鈣化橋形成的方式，形成方式不同是否會影響鈣化橋的組織結(jié)構(gòu)和直接蓋髓的療效，仍需大量研究進行探討。

【Author contributions】 Yang X peformed the experiments, analyzed the data, and wrote the article. Yan ZH, Liu J, Hu YP revised the article. Li SF designed the study. All authors read and approved the final manuscript as submitted.