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        甘肅藜麥霜霉病調(diào)查及其病原菌鑒定

        2023-01-18 14:39:24李敏權(quán)楊發(fā)榮陸建英魏玉明趙桂琴
        核農(nóng)學(xué)報(bào) 2023年3期
        關(guān)鍵詞:干旱區(qū)生態(tài)區(qū)霜霉病

        王 昶 李敏權(quán) 楊發(fā)榮 陸建英 魏玉明 呂 瑋 趙桂琴

        (1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070; 2甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所,甘肅 蘭州 730070;3甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,甘肅 蘭州 730070; 4甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所,甘肅 蘭州 730070;5國家半干旱農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心,河北 石家莊 050000)

        藜麥(Chenopodium quinoa)是原產(chǎn)于南美洲安第斯山區(qū),具有7 000多年栽培歷史的古老作物[1],因其富含全面均衡的營養(yǎng)[2-4]和具有突出的抗逆性[1,5-6]而受到廣泛關(guān)注,現(xiàn)該作物的種植已突破南美洲傳統(tǒng)種植區(qū),擴(kuò)延至全球[7]。近年來,我國藜麥種植面積不斷增加,2019年全國藜麥種植總面積接近1.67萬公頃,而甘肅種植面積超過0.6萬公頃,居全國之首,占全國藜麥面積的40%[8]。

        藜麥霜霉病是危害藜麥最嚴(yán)重的全球性病害之一[9],其破壞性極強(qiáng),嚴(yán)重影響藜麥生產(chǎn)。該病主要危害藜麥葉片,侵染后葉片褪綠,形成壞死斑,直至脫落,常造成藜麥減產(chǎn),即使應(yīng)用抗病品種,仍至少減產(chǎn)30%~50%,當(dāng)環(huán)境條件適宜病害發(fā)生時(shí),感病品種減產(chǎn)甚至高達(dá)100%[10]。但藜麥霜霉病病原菌的分類鑒定長期存在混亂,最初由于受研究技術(shù)限制,研究者僅基于形態(tài)學(xué)特征將藜麥霜霉病病原菌鑒定為Peronospora farinosa[11]。后來,隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展,Choi等[12]基于形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)將其更正為Peronospora variabilis,此后,該結(jié)果得到了其他學(xué)者的支持[13]。P.variabilis是來自卵菌(Oomycetes)的一種專性活體營養(yǎng)寄生物,屬霜霉屬(Peronospora)。由于卵菌的生長習(xí)性和養(yǎng)分吸收特性與真菌非常相似,之前一直歸為菌物界(Fungi kingdom)。后來,考慮到卵菌的遺傳和生殖特性及游動孢子形態(tài)、rRNA的核苷酸序列,將其歸為假菌界(Chromista)[14]。隨著我國藜麥種植面積的不斷擴(kuò)大,霜霉病危害日益突出,而國內(nèi)關(guān)于藜麥霜霉病的發(fā)生危害、病原菌種類、致病力分化等研究鮮見系統(tǒng)報(bào)道。基于此,本研究通過病害系統(tǒng)調(diào)查,采集典型病葉,并利用柯赫氏法則、形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)方法及室內(nèi)人工接菌葉盤等技術(shù),明確甘肅藜麥產(chǎn)區(qū)霜霉病的發(fā)生危害情況、病原菌種類及致病力分化情況,旨在為藜麥霜霉病綜合防控奠定理論基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        1.1.1 供試病原菌及藜麥材料 藜麥典型霜霉病癥狀病葉分別采集自甘肅白銀干旱區(qū)、蘭州半干旱區(qū)、天祝高寒區(qū)、臨夏二陰氣候區(qū)和甘南高寒陰濕區(qū)等5個(gè)不同生態(tài)區(qū),置于裝有冰袋的保鮮箱中帶回實(shí)驗(yàn)室備用。供試藜麥材料為QA065,由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所提供。

        1.1.2 試劑和儀器 真菌DNA提取試劑盒(D3195-01),美國Omega公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。JY600C電泳儀,北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;A300 PCR儀、Long gene凝膠成像系統(tǒng),杭州朗基科學(xué)儀器有限公司;5425R冷凍離心機(jī),德國Eppendorf公司;ECLIPSE NI生物顯微鏡、DS-Fi1C顯微鏡成像系統(tǒng),日本Nikon公司。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 霜霉病調(diào)查 2019年7—8月份分別調(diào)查甘肅蘭州半干旱區(qū)、白銀干旱區(qū)、天祝高寒區(qū)、臨夏二陰氣候區(qū)和甘南高寒陰濕區(qū)等5個(gè)不同生態(tài)區(qū)藜麥?zhǔn)⒒ㄆ谒共“l(fā)生危害情況。選擇能代表該區(qū)典型氣候特征的3個(gè)村鎮(zhèn)進(jìn)行,每個(gè)村鎮(zhèn)選取3塊地,采用5點(diǎn)取樣法,每點(diǎn)調(diào)查6株,統(tǒng)計(jì)發(fā)病植株和病害嚴(yán)重度,記載樣點(diǎn)的地理坐標(biāo)、海拔高度等。嚴(yán)重度采用Mhada等[15]的0~5級病害分級標(biāo)準(zhǔn)(略有變動):0級:無病斑;1級:小而分散的病斑,病斑占葉片面積0%~10%;2級:病斑數(shù)量和面積明顯增加,病斑占葉片面積11%~25%;3級:病斑呈褐色,葉片背面開始形成孢子,病斑占葉片面積26%~50%;4級:病斑占葉片面積51%~90%;5級:病斑面積大于葉面積90%,葉片正面和背面形成大量孢子。采用三葉法[16]調(diào)查病害嚴(yán)重度。按照公式計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)(disease index,DI):

        1.2.2 病原菌形態(tài)觀察 選取不同生態(tài)區(qū)藜麥霜霉病典型癥狀病葉,用撥針挑取病葉背面獨(dú)立病斑的少許霉層和菌絲,置于載玻片上,用水做浮載劑,蓋上蓋玻片,置于顯微鏡下觀察病原菌形態(tài),對典型孢囊梗、孢子囊和卵孢子進(jìn)行拍照,同時(shí)測量孢囊??傞L、寬度、孢囊梗末端長、基部寬,孢子囊長和寬、卵孢子直徑等指標(biāo),統(tǒng)計(jì)孢囊梗分枝級別,每個(gè)指標(biāo)測量30個(gè)重復(fù)。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征,參考《真菌鑒定手冊》[17]和《中國真菌志·第六卷·霜霉目》[18]等進(jìn)行初步鑒定。

        1.2.3 菌株DNA提取、rDNA-ITS序列擴(kuò)增 選取與形態(tài)觀察相同的新鮮病葉,用無菌毛刷輕輕刷下葉背霉層,采用真菌DNA提取試劑盒提取基因組DNA,具體方法參照試劑盒說明書。應(yīng)用rDNA-ITS通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)∕ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[19]進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物由西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司合成。反應(yīng)體系共25 μL:Master Mix 12.5 μL,10 μmol·L-1引物ITS1∕ITS4各1 μL,30 ng·μL-1模板DNA 2 μL,ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性15 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸40 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸10 min;PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后,送西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司測序。

        1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將測序獲得菌株的rDNA-ITS序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對分析,下載同源性較高的rDNA-ITS序列。基于供試菌株和選取藜屬植物(Chenopodium sp.)霜霉病菌株的rDNA-ITS序列,采用Mega7.0軟件用最大似然法(maximum likelihood,ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[20],自舉檢驗(yàn)次數(shù)為1 000次。

        1.2.5 致病力測定

        1.2.5.1 孢子懸浮液的制備 將上述典型病葉新鮮孢子囊用無菌毛刷刷下,加入5 mL無菌水,用4層無菌紗布過濾,將濾液在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),調(diào)至孢子囊濃度為1×105個(gè)·mL-1,加入0.1%吐溫20,備用。

        1.2.5.2 離體葉片接菌測定 將藜麥Q(jìng)A065大田常規(guī)種植,選取成株期相同部位健康的葉片,采用葉盤法測定致病力。用70%酒精葉片表面消毒30 s,無菌水沖洗干凈,自然晾干,打孔器避開主脈取直徑10 mm的葉盤,置于鋪有2層無菌濾紙的培養(yǎng)皿中(直徑90 mm),每皿置10個(gè)葉盤,葉背朝上。每葉盤中央滴20 μL的孢子懸浮液,加無菌水使濾紙濕潤,保鮮膜封口。每菌株3次重復(fù),設(shè)置1個(gè)清水對照。將培養(yǎng)皿置于溫度20 ℃、相對濕度85%的人工氣候培養(yǎng)箱中,黑暗培養(yǎng)24 h后,用無菌濾紙吸掉葉盤表面液滴,封口后12 h黑暗∕12 h光照交替培養(yǎng),接種6 d后調(diào)查發(fā)病情況。病害嚴(yán)重度分級和病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)方法同1.2.1。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 霜霉病的發(fā)生情況

        甘肅白銀干旱區(qū)、蘭州半干旱區(qū)、天祝高寒區(qū)、臨夏二陰氣候區(qū)和甘南高寒陰濕區(qū)等不同生態(tài)區(qū)霜霉病調(diào)查結(jié)果見表1。白銀干旱區(qū)霜霉病平均發(fā)病率為19.26%,病情指數(shù)為16.67;在蘭州半干旱區(qū),隨著海拔升高,發(fā)病率下降,平均發(fā)病率為24.45%,病情指數(shù)也依次降低,平均病情指數(shù)為21.44;天祝高寒區(qū)平均發(fā)病率為45.92%,病情指數(shù)為40.11;甘南高寒陰濕區(qū),隨著海拔升高,發(fā)病率和病情指數(shù)均依次降低,平均發(fā)病率為72.59%,病情指數(shù)為69.22;臨夏二陰氣候區(qū)的平均發(fā)病率和病情指數(shù)最高,分別為83.70%和80.44,該區(qū)康樂縣八松鄉(xiāng)藜麥霜霉病的發(fā)病率和病情指數(shù)均為所有調(diào)查點(diǎn)最高,分別為97.78%和95.00。不同生態(tài)區(qū)發(fā)病率和病情指數(shù)的變化趨勢完全一致,從高到低依次為:臨夏二陰氣候區(qū)>甘南高寒陰濕區(qū)>天祝高寒區(qū)>蘭州半干旱區(qū)>白銀干旱區(qū)。

        表1 甘肅不同生態(tài)區(qū)藜麥霜霉病發(fā)生情況Table 1 Occurrence of quinoa downy mildew of different ecological regions in Gansu Province

        2.2 霜霉病癥狀

        藜麥霜霉病主要危害葉片,也可侵染莖、枝、花序和籽粒,首先從植株下部的葉片開始發(fā)病,侵染初期,葉正面出現(xiàn)小而不規(guī)則的褪綠壞死斑,因藜麥品種不同,壞死斑呈現(xiàn)黃綠色(圖1-A)、淺紅色(圖1-B)、深紅色(圖1-C)和紫色(圖1-D)等不同顏色。病原菌在葉肉組織中不斷生長,破壞葉片機(jī)體,阻礙光合作用,當(dāng)孢囊梗從氣孔伸出后,在葉背形成灰色至黑色的絨毛狀霉層(圖1-E、F)。隨著病程的發(fā)展,褪綠斑不斷聚結(jié)、擴(kuò)展、融合變大,葉片開始變黃、干枯,最終導(dǎo)致脫落,嚴(yán)重影響藜麥的生長發(fā)育。

        圖1 藜麥霜霉病葉片癥狀Fig.1 Leaf symptoms of quinoa downy mildew disease

        2.3 病原菌的形態(tài)特征

        分別選取甘肅白銀平川區(qū)、蘭州市安寧區(qū)、武威市天??h、甘南州臨潭縣和臨夏州康樂縣等不同地區(qū)典型霜霉病葉片,菌株分別標(biāo)記為GSBY(白銀干旱區(qū))、GSLZ(蘭州半干旱區(qū))、GSTZ(天祝高寒區(qū))、GSLT(甘南高寒陰濕區(qū))和GSKL(臨夏二陰氣候區(qū)),對其形態(tài)特征進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示,5個(gè)菌株形態(tài)特征(表2)均與前人報(bào)道的藜麥霜霉菌P. variabilis形態(tài)特征[12]一致。孢囊梗(圖2-A)樹形,呈二叉狀分支(圖2-B),分枝級別為4~7級,孢囊梗長221.71~731.08 μm,寬8.94~12.80 μm;末端彎曲至弧形,末端尖呈鈍形,長5.51~27.91 μm,基部寬2.24~5.45 μm;無性生殖產(chǎn)生孢子囊(圖2-D~G),其著生于孢囊梗分枝末端(圖2-C~E),呈寬橢圓至橢圓形、淺褐色、表面光滑,末端有突出的梗(圖2-F、G),呈短圓柱形;孢子囊長20.19~39.02 μm,寬16.01~29.69 μm,長寬比1.00~1.56;有性生殖產(chǎn)生卵孢子(圖2-H、I),呈球形,黃褐色、壁雙層,表面凹凸不平,直徑為22.91~31.57 μm。不同生態(tài)區(qū)霜霉病菌株除孢囊梗末端基部寬度不顯著外,孢囊??傞L和寬度、孢囊梗末端長、孢子囊長和寬、卵孢子直徑均存在顯著差異(P<0.05)。

        圖2 霜霉病病原菌形態(tài)特征Fig.2 Morphological characterization of quinoa downy mildew pathogen

        表2 不同生態(tài)區(qū)藜麥霜霉病菌株形態(tài)特征Table 2 Morphological characterization of quinoa downy mildew pathogen from different ecological regions

        2.4 病原菌分子鑒定

        采用引物ITS1∕ITS4將5株不同生態(tài)區(qū)代表性菌株rDNA-ITS基因片段進(jìn)行擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,均得到1條約800 bp的清晰條帶(圖3),測序后得知除菌株GSLZ序列為795 bp外,其余菌株GSBY、GSTZ、GSKL和GSLT等的序列大小均為800 bp。

        圖3 病原菌rDNA-ITS基因片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoresis pattern of rDNA-ITS gene fragments of pathogens

        將供試菌株GSBY、GSLZ、GSTZ、GSKL和GSLT基因組的ITS序列在GenBank中進(jìn)行同源性比對,結(jié)果顯示菌株GSBY和GSLZ均與登錄號EF614959和FM863724(寄主都為C. album)的P. variabilis序列的同源性達(dá)100%;菌株GSTZ與登錄號為KF269605(寄主為C. quinoa)和登錄號為FM863719(寄主為C. album)的P. variabilis序列的同源性達(dá)100%;菌株GSKL和GSLT 均與登錄號為KF269605(寄主為C. quinoa)的P. variabilis序列的同源性達(dá)98%?;诠┰嚲甑腎TS序列,比對獲取的同源性較高菌株的ITS序列和選取的藜麥(C. quinoa)、藜(C. album)、濱藜(Atriplex patula)及其他藜屬植物(Chenopodiumsp.)霜霉病菌株的ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4),結(jié)果顯示菌株GSBY、GSLZ和GSTZ分別與來自南美洲(厄瓜多爾、秘魯、阿根廷、玻利維亞)、歐洲(丹麥、西班牙)、北美洲(美國)和亞洲(中國、韓國)寄主為藜麥、藜和藜屬植物的P. variabilis以94%的自展率聚為一支。結(jié)合形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育分析,確定菌株GSBY、GSLZ和GSTZ為P. variabilis。侵染厄瓜多爾、秘魯、丹麥、韓國藜麥和藜的P. farinosa(P. variabilis的曾用名)與侵染藜麥和藜的P. variabilis同樣聚為一支,充分說明侵染藜麥和藜的霜霉菌P. farinosa應(yīng)更正為P. variabilis。系統(tǒng)發(fā)育說明菌株GSBY、GSLZ和GSTZ與來自藜麥、藜和藜屬植物的P. variabilis遺傳進(jìn)化關(guān)系更近。而菌株GSKL和GSLT以98%的自展率聚為一支,又以87%的自展率與P. variabilis聚為一支。結(jié)合形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育,確定菌株GSKL和GSLT為P. variabilis。系統(tǒng)發(fā)育說明菌株GSKL和GSLT二者的遺傳進(jìn)化關(guān)系更近,與其他地理來源的藜屬植物的P.variabilis存在地理種群遺傳分化。

        圖4 采用最大似然法基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The phylogenetic tree based on rDNA-ITS sequence by maximum likelihood method

        2.5 病原菌致病力測定

        不同菌株致病力測定結(jié)果見圖5,菌株GSBY、GSLZ、GSTZ、GSKL和GSLT分別接菌后藜麥葉片均能發(fā)病,菌株GSKL和GSLT在接菌后第3天出現(xiàn)明顯褪綠斑點(diǎn),其他菌株在第4~第6天出現(xiàn)褪綠斑(圖6)。不同菌株侵染藜麥的病情指數(shù)之間差異顯著(P<0.05),菌株GSKL的病情指數(shù)最大,為90.00,其次為GSLT,為83.33,最低的為GSTZ,為44.67,其他介于二者之間,說明甘南高寒陰濕區(qū)和臨夏二陰氣候區(qū)霜霉菌致病力較強(qiáng)。致病力大小依次為菌株GSKL>菌株GSLT>菌株GSBY>菌株GSLZ>菌株GSTZ。對發(fā)病葉片的霜霉菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,確定其與原接種菌株一致,符合柯赫氏法則。

        圖5 不同霜霉病菌株致病力Fig.5 Pathogenicity of downy mildew pathogen on qunioa

        圖6 接種不同霜霉病菌株后葉盤的發(fā)病情況Fig.6 Disease incidence on leaf discs after inoculated with different strains of qunioa downy mildew

        3 討論

        我國藜麥種植面積在逐年增加的同時(shí),霜霉病的發(fā)生和危害也在不斷蔓延和加劇。本試驗(yàn)調(diào)查發(fā)現(xiàn),甘肅藜麥霜霉病發(fā)生危害普遍嚴(yán)重,發(fā)病率和病情指數(shù)分別為15.56%~97.78%和15.67~95.00,局部地方呈爆發(fā)態(tài)勢,但不同生態(tài)區(qū)差異較大。在調(diào)查的所有地區(qū)中,臨夏二陰氣候區(qū)霜霉病發(fā)生最嚴(yán)重,尤其是康樂縣八松鄉(xiāng),發(fā)病率和病情指數(shù)分別高達(dá)97.78%和95.00,該地區(qū)氣候涼爽,陰濕多雨,極利于病菌的生長;白銀干旱區(qū)則發(fā)病最輕,該地區(qū)氣候干燥少雨;其余生態(tài)區(qū)均介于其間。由此可見,霜霉病發(fā)生嚴(yán)重程度與當(dāng)?shù)氐臍夂颦h(huán)境密切相關(guān),多雨潮濕的地區(qū)發(fā)病重,干旱少雨的地區(qū)發(fā)病輕。這主要是因?yàn)樗咕钸m生長環(huán)境條件為:溫度18~22 ℃,相對濕度>80%[21]。分析認(rèn)為在此條件下葉片氣孔通常開放[22],而這利于病原菌孢子的萌發(fā)和侵入。鑒于藜麥霜霉病的防治十分困難[20],在今后藜麥種植區(qū)域布局中可以減少濕度大的地區(qū)的播種面積,適當(dāng)增加氣候偏干燥地區(qū)的種植面積。此外,在調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn),田間微環(huán)境同樣明顯影響病害的發(fā)生,種植密度過大,植株冠層相互重疊,造成微環(huán)境小氣候濕度過大,也會促進(jìn)病害的發(fā)生。因此,在實(shí)際生產(chǎn)中,應(yīng)適當(dāng)密植,及時(shí)排澇,保持田間植株通風(fēng)透氣,從而減輕病害的發(fā)生。

        病害的調(diào)查時(shí)期至關(guān)重要,恰當(dāng)?shù)臅r(shí)期能夠充分體現(xiàn)病害發(fā)生的嚴(yán)重程度。甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藜麥研究團(tuán)隊(duì)在前期病害調(diào)查的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn),藜麥?zhǔn)⒒ㄆ诓『Πl(fā)生嚴(yán)重,為霜霉病盛發(fā)期,因此確定盛花期為霜霉病調(diào)查的最佳時(shí)期。有學(xué)者認(rèn)為花芽分化期是藜麥抗性鑒定最重要和關(guān)鍵時(shí)期[23]。本研究確定的調(diào)查時(shí)期與其存在微小差異,這可能受寄主、氣候環(huán)境、病原菌特性等多種因素影響。此外,本研究發(fā)現(xiàn)藜麥葉片表現(xiàn)出不同顏色的褪綠斑,典型癥狀呈黃綠色至黃色,少數(shù)呈淺紅色、深紅色和紫色,其顏色主要與藜麥的品種有關(guān),取決于植物的色素種類[24-25],這為今后研究植物色素與病害發(fā)生的關(guān)系提供了新視角。

        病原菌的形態(tài)特征是鑒別其歸屬的重要依據(jù),也是病害鑒別過程中必不可少的環(huán)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn),甘肅不同生態(tài)區(qū)病原菌的形態(tài)特征與已報(bào)道藜麥霜霉病病原菌P. variabilis的形態(tài)特征[12,26]一致。孢子囊的長寬比及梗的有無是從形態(tài)學(xué)鑒別不同藜屬植物(Chenopodiumspp.)霜霉屬(Peronospora)病原菌的重要特性[16]。本研究中,霜霉病病原菌孢子囊具有短而小的梗,長寬比為1.00~1.56(平均1.21~1.42),這與Choi等[12]對P. variabilis的描述一致。甘肅不同生態(tài)區(qū)霜霉病菌株孢子囊大小存在差異,這與前人的研究結(jié)果相似[12,27],這種差異可能與生長環(huán)境、寄主植物、病原菌小種、孢子年齡等有關(guān)[28]。rDNA-ITS序列分析是比較藜屬近緣物種非常有用的一種工具,常應(yīng)用于霜霉屬近緣種[29]和近親屬內(nèi)不同菌種的分類和系統(tǒng)發(fā)育的研究。本研究基于rDNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,甘肅藜麥霜霉病病原菌與侵染藜麥和藜的P. variabilis聚為一支。結(jié)合形態(tài)特征和分子生物學(xué)將甘肅藜麥霜霉病病原菌鑒定為P. variabilis,這與殷輝等[30]對山西藜麥霜霉病的鑒定結(jié)果一致。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示甘肅藜麥霜霉病菌株GSKL、GSLT與GSBY、GSLZ、GSTZ及其他來源的P. variabilis聚為不同分支,說明不同生態(tài)區(qū)霜霉病菌株之間存在地理種群遺傳分化,這與Nolen等[31]的研究結(jié)果相似。分析其原因可能是P. variabilis的有性生殖是卵配生殖(Oogamous),存在異宗配合(Heterothallic)現(xiàn)象[32],導(dǎo)致種群發(fā)生變異[20]。

        本研究發(fā)現(xiàn)甘肅藜麥霜霉病不同菌株的致病力之間存在顯著差異(P<0.05),尤其是菌株GSKL和GSLT與其他菌株相比表現(xiàn)出強(qiáng)致病力,說明P. variabilis可能發(fā)生變異,產(chǎn)生新的毒力基因[33],導(dǎo)致致病力增強(qiáng),致病力產(chǎn)生分化,這與Ochoa等[34]研究結(jié)果相似。藜麥霜霉病P. variabilis種群的變異及致病力的增強(qiáng),給其防治帶來了極大挑戰(zhàn)?;诖?,后續(xù)應(yīng)該加強(qiáng)P. variabilis毒力的監(jiān)測,篩選鑒別寄主,構(gòu)建鑒別體系,加強(qiáng)病害的防控研究工作。但由于P. variabilis是活體營養(yǎng)型病原菌,與其他能夠離體培養(yǎng)的病原菌相比,該病原菌的分離培養(yǎng)顯得更加困難[35],從而限制了P.variabilis的研究,也給科研人員提出了更大的挑戰(zhàn)。

        4 結(jié)論

        甘肅不同生態(tài)區(qū)藜麥霜霉病發(fā)生普遍嚴(yán)重,局部地方呈爆發(fā)態(tài)勢,病害發(fā)生與氣候環(huán)境濕度密切相關(guān);不同生態(tài)區(qū)病害發(fā)生危害嚴(yán)重程度由高到低依次為:臨夏二陰氣候區(qū)>甘南高寒陰濕區(qū)>天祝高寒區(qū)>蘭州半干旱區(qū)>白銀干旱區(qū);結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué),將甘肅藜麥霜霉病病原菌鑒定為P. variabilis,不同生態(tài)區(qū)P. variabilis的孢子囊和卵孢子大小差異顯著;不同生態(tài)區(qū)P. variabilis菌株之間致病力差異顯著,從大到小依次為:菌株GSKL>菌株GSLT>菌株GSBY>菌株GSLZ>菌株GSTZ,不同菌株之間存在地理種群遺傳分化。

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