王 昶 李敏權(quán) 楊發(fā)榮 陸建英 魏玉明 呂 瑋 趙桂琴

（1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 2甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，甘肅 蘭州 730070；3甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 4甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所，甘肅 蘭州 730070；5國(guó)家半干旱農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050000）

藜麥（Chenopodium quinoa）是原產(chǎn)于南美洲安第斯山區(qū)，具有7 000多年栽培歷史的古老作物［1］，因其富含全面均衡的營(yíng)養(yǎng)［2-4］和具有突出的抗逆性［1，5-6］而受到廣泛關(guān)注，現(xiàn)該作物的種植已突破南美洲傳統(tǒng)種植區(qū)，擴(kuò)延至全球［7］。近年來(lái)，我國(guó)藜麥種植面積不斷增加，2019年全國(guó)藜麥種植總面積接近1.67萬(wàn)公頃，而甘肅種植面積超過(guò)0.6萬(wàn)公頃，居全國(guó)之首，占全國(guó)藜麥面積的40%［8］。

藜麥霜霉病是危害藜麥最嚴(yán)重的全球性病害之一［9］，其破壞性極強(qiáng)，嚴(yán)重影響藜麥生產(chǎn)。該病主要危害藜麥葉片，侵染后葉片褪綠，形成壞死斑，直至脫落，常造成藜麥減產(chǎn)，即使應(yīng)用抗病品種，仍至少減產(chǎn)30%～50%，當(dāng)環(huán)境條件適宜病害發(fā)生時(shí)，感病品種減產(chǎn)甚至高達(dá)100%［10］。但藜麥霜霉病病原菌的分類鑒定長(zhǎng)期存在混亂，最初由于受研究技術(shù)限制，研究者僅基于形態(tài)學(xué)特征將藜麥霜霉病病原菌鑒定為Peronospora farinosa［11］。后來(lái)，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，Choi等［12］基于形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)將其更正為Peronospora variabilis，此后，該結(jié)果得到了其他學(xué)者的支持［13］。P.variabilis是來(lái)自卵菌（Oomycetes）的一種專性活體營(yíng)養(yǎng)寄生物，屬霜霉屬（Peronospora）。由于卵菌的生長(zhǎng)習(xí)性和養(yǎng)分吸收特性與真菌非常相似，之前一直歸為菌物界（Fungi kingdom）。后來(lái)，考慮到卵菌的遺傳和生殖特性及游動(dòng)孢子形態(tài)、rRNA的核苷酸序列，將其歸為假菌界（Chromista）［14］。隨著我國(guó)藜麥種植面積的不斷擴(kuò)大，霜霉病危害日益突出，而國(guó)內(nèi)關(guān)于藜麥霜霉病的發(fā)生危害、病原菌種類、致病力分化等研究鮮見系統(tǒng)報(bào)道。基于此，本研究通過(guò)病害系統(tǒng)調(diào)查，采集典型病葉，并利用柯赫氏法則、形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)方法及室內(nèi)人工接菌葉盤等技術(shù)，明確甘肅藜麥產(chǎn)區(qū)霜霉病的發(fā)生危害情況、病原菌種類及致病力分化情況，旨在為藜麥霜霉病綜合防控奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試病原菌及藜麥材料 藜麥典型霜霉病癥狀病葉分別采集自甘肅白銀干旱區(qū)、蘭州半干旱區(qū)、天祝高寒區(qū)、臨夏二陰氣候區(qū)和甘南高寒陰濕區(qū)等5個(gè)不同生態(tài)區(qū)，置于裝有冰袋的保鮮箱中帶回實(shí)驗(yàn)室備用。供試藜麥材料為QA065，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所提供。

1.1.2 試劑和儀器 真菌DNA提取試劑盒（D3195-01），美國(guó)Omega公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。JY600C電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；A300 PCR儀、Long gene凝膠成像系統(tǒng)，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；5425R冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；ECLIPSE NI生物顯微鏡、DS-Fi1C顯微鏡成像系統(tǒng)，日本Nikon公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 霜霉病調(diào)查 2019年7—8月份分別調(diào)查甘肅蘭州半干旱區(qū)、白銀干旱區(qū)、天祝高寒區(qū)、臨夏二陰氣候區(qū)和甘南高寒陰濕區(qū)等5個(gè)不同生態(tài)區(qū)藜麥?zhǔn)⒒ㄆ谒共“l(fā)生危害情況。選擇能代表該區(qū)典型氣候特征的3個(gè)村鎮(zhèn)進(jìn)行，每個(gè)村鎮(zhèn)選取3塊地，采用5點(diǎn)取樣法，每點(diǎn)調(diào)查6株，統(tǒng)計(jì)發(fā)病植株和病害嚴(yán)重度，記載樣點(diǎn)的地理坐標(biāo)、海拔高度等。嚴(yán)重度采用Mhada等［15］的0～5級(jí)病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（略有變動(dòng)）：0級(jí)：無(wú)病斑；1級(jí)：小而分散的病斑，病斑占葉片面積0%～10%；2級(jí)：病斑數(shù)量和面積明顯增加，病斑占葉片面積11%～25%；3級(jí)：病斑呈褐色，葉片背面開始形成孢子，病斑占葉片面積26%～50%；4級(jí)：病斑占葉片面積51%～90%；5級(jí)：病斑面積大于葉面積90%，葉片正面和背面形成大量孢子。采用三葉法［16］調(diào)查病害嚴(yán)重度。按照公式計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)（disease index，DI）：

1.2.2 病原菌形態(tài)觀察 選取不同生態(tài)區(qū)藜麥霜霉病典型癥狀病葉，用撥針挑取病葉背面獨(dú)立病斑的少許霉層和菌絲，置于載玻片上，用水做浮載劑，蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察病原菌形態(tài)，對(duì)典型孢囊梗、孢子囊和卵孢子進(jìn)行拍照，同時(shí)測(cè)量孢囊?？傞L(zhǎng)、寬度、孢囊梗末端長(zhǎng)、基部寬，孢子囊長(zhǎng)和寬、卵孢子直徑等指標(biāo)，統(tǒng)計(jì)孢囊梗分枝級(jí)別，每個(gè)指標(biāo)測(cè)量30個(gè)重復(fù)。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，參考《真菌鑒定手冊(cè)》［17］和《中國(guó)真菌志·第六卷·霜霉目》［18］等進(jìn)行初步鑒定。

1.2.3 菌株DNA提取、rDNA-ITS序列擴(kuò)增 選取與形態(tài)觀察相同的新鮮病葉，用無(wú)菌毛刷輕輕刷下葉背霉層，采用真菌DNA提取試劑盒提取基因組DNA，具體方法參照試劑盒說(shuō)明書。應(yīng)用rDNA-ITS通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）∕ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）［19］進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物由西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司合成。反應(yīng)體系共25 μL：Master Mix 12.5 μL，10 μmol·L-1引物ITS1∕ITS4各1 μL，30 ng·μL-1模板DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司測(cè)序。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將測(cè)序獲得菌株的rDNA-ITS序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，下載同源性較高的rDNA-ITS序列?；诠┰嚲旰瓦x取藜屬植物（Chenopodium sp.）霜霉病菌株的rDNA-ITS序列，采用Mega7.0軟件用最大似然法（maximum likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［20］，自舉檢驗(yàn)次數(shù)為1 000次。

1.2.5 致病力測(cè)定

1.2.5.1 孢子懸浮液的制備 將上述典型病葉新鮮孢子囊用無(wú)菌毛刷刷下，加入5 mL無(wú)菌水，用4層無(wú)菌紗布過(guò)濾，將濾液在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)至孢子囊濃度為1×105個(gè)·mL-1，加入0.1%吐溫20，備用。

1.2.5.2 離體葉片接菌測(cè)定 將藜麥Q(jìng)A065大田常規(guī)種植，選取成株期相同部位健康的葉片，采用葉盤法測(cè)定致病力。用70%酒精葉片表面消毒30 s，無(wú)菌水沖洗干凈，自然晾干，打孔器避開主脈取直徑10 mm的葉盤，置于鋪有2層無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中（直徑90 mm），每皿置10個(gè)葉盤，葉背朝上。每葉盤中央滴20 μL的孢子懸浮液，加無(wú)菌水使濾紙濕潤(rùn)，保鮮膜封口。每菌株3次重復(fù)，設(shè)置1個(gè)清水對(duì)照。將培養(yǎng)皿置于溫度20 ℃、相對(duì)濕度85%的人工氣候培養(yǎng)箱中，黑暗培養(yǎng)24 h后，用無(wú)菌濾紙吸掉葉盤表面液滴，封口后12 h黑暗∕12 h光照交替培養(yǎng)，接種6 d后調(diào)查發(fā)病情況。病害嚴(yán)重度分級(jí)和病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)方法同1.2.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 霜霉病的發(fā)生情況

甘肅白銀干旱區(qū)、蘭州半干旱區(qū)、天祝高寒區(qū)、臨夏二陰氣候區(qū)和甘南高寒陰濕區(qū)等不同生態(tài)區(qū)霜霉病調(diào)查結(jié)果見表1。白銀干旱區(qū)霜霉病平均發(fā)病率為19.26%，病情指數(shù)為16.67；在蘭州半干旱區(qū)，隨著海拔升高，發(fā)病率下降，平均發(fā)病率為24.45%，病情指數(shù)也依次降低，平均病情指數(shù)為21.44；天祝高寒區(qū)平均發(fā)病率為45.92%，病情指數(shù)為40.11；甘南高寒陰濕區(qū)，隨著海拔升高，發(fā)病率和病情指數(shù)均依次降低，平均發(fā)病率為72.59%，病情指數(shù)為69.22；臨夏二陰氣候區(qū)的平均發(fā)病率和病情指數(shù)最高，分別為83.70%和80.44，該區(qū)康樂(lè)縣八松鄉(xiāng)藜麥霜霉病的發(fā)病率和病情指數(shù)均為所有調(diào)查點(diǎn)最高，分別為97.78%和95.00。不同生態(tài)區(qū)發(fā)病率和病情指數(shù)的變化趨勢(shì)完全一致，從高到低依次為：臨夏二陰氣候區(qū)>甘南高寒陰濕區(qū)>天祝高寒區(qū)>蘭州半干旱區(qū)>白銀干旱區(qū)。

表1 甘肅不同生態(tài)區(qū)藜麥霜霉病發(fā)生情況Table 1 Occurrence of quinoa downy mildew of different ecological regions in Gansu Province

2.2 霜霉病癥狀

藜麥霜霉病主要危害葉片，也可侵染莖、枝、花序和籽粒，首先從植株下部的葉片開始發(fā)病，侵染初期，葉正面出現(xiàn)小而不規(guī)則的褪綠壞死斑，因藜麥品種不同，壞死斑呈現(xiàn)黃綠色（圖1-A）、淺紅色（圖1-B）、深紅色（圖1-C）和紫色（圖1-D）等不同顏色。病原菌在葉肉組織中不斷生長(zhǎng)，破壞葉片機(jī)體，阻礙光合作用，當(dāng)孢囊梗從氣孔伸出后，在葉背形成灰色至黑色的絨毛狀霉層（圖1-E、F）。隨著病程的發(fā)展，褪綠斑不斷聚結(jié)、擴(kuò)展、融合變大，葉片開始變黃、干枯，最終導(dǎo)致脫落，嚴(yán)重影響藜麥的生長(zhǎng)發(fā)育。

圖1 藜麥霜霉病葉片癥狀Fig.1 Leaf symptoms of quinoa downy mildew disease

2.3 病原菌的形態(tài)特征

分別選取甘肅白銀平川區(qū)、蘭州市安寧區(qū)、武威市天?？h、甘南州臨潭縣和臨夏州康樂(lè)縣等不同地區(qū)典型霜霉病葉片，菌株分別標(biāo)記為GSBY（白銀干旱區(qū)）、GSLZ（蘭州半干旱區(qū)）、GSTZ（天祝高寒區(qū)）、GSLT（甘南高寒陰濕區(qū)）和GSKL（臨夏二陰氣候區(qū)），對(duì)其形態(tài)特征進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，5個(gè)菌株形態(tài)特征（表2）均與前人報(bào)道的藜麥霜霉菌P. variabilis形態(tài)特征［12］一致。孢囊梗（圖2-A）樹形，呈二叉狀分支（圖2-B），分枝級(jí)別為4～7級(jí)，孢囊梗長(zhǎng)221.71～731.08 μm，寬8.94～12.80 μm；末端彎曲至弧形，末端尖呈鈍形，長(zhǎng)5.51～27.91 μm，基部寬2.24～5.45 μm；無(wú)性生殖產(chǎn)生孢子囊（圖2-D～G），其著生于孢囊梗分枝末端（圖2-C～E），呈寬橢圓至橢圓形、淺褐色、表面光滑，末端有突出的梗（圖2-F、G），呈短圓柱形；孢子囊長(zhǎng)20.19～39.02 μm，寬16.01～29.69 μm，長(zhǎng)寬比1.00～1.56；有性生殖產(chǎn)生卵孢子（圖2-H、I），呈球形，黃褐色、壁雙層，表面凹凸不平，直徑為22.91～31.57 μm。不同生態(tài)區(qū)霜霉病菌株除孢囊梗末端基部寬度不顯著外，孢囊?？傞L(zhǎng)和寬度、孢囊梗末端長(zhǎng)、孢子囊長(zhǎng)和寬、卵孢子直徑均存在顯著差異（P<0.05）。

圖2 霜霉病病原菌形態(tài)特征Fig.2 Morphological characterization of quinoa downy mildew pathogen

表2 不同生態(tài)區(qū)藜麥霜霉病菌株形態(tài)特征Table 2 Morphological characterization of quinoa downy mildew pathogen from different ecological regions

2.4 病原菌分子鑒定

采用引物ITS1∕ITS4將5株不同生態(tài)區(qū)代表性菌株rDNA-ITS基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，均得到1條約800 bp的清晰條帶（圖3），測(cè)序后得知除菌株GSLZ序列為795 bp外，其余菌株GSBY、GSTZ、GSKL和GSLT等的序列大小均為800 bp。

圖3 病原菌rDNA-ITS基因片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoresis pattern of rDNA-ITS gene fragments of pathogens

將供試菌株GSBY、GSLZ、GSTZ、GSKL和GSLT基因組的ITS序列在GenBank中進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果顯示菌株GSBY和GSLZ均與登錄號(hào)EF614959和FM863724（寄主都為C. album）的P. variabilis序列的同源性達(dá)100%；菌株GSTZ與登錄號(hào)為KF269605（寄主為C. quinoa）和登錄號(hào)為FM863719（寄主為C. album）的P. variabilis序列的同源性達(dá)100%；菌株GSKL和GSLT 均與登錄號(hào)為KF269605（寄主為C. quinoa）的P. variabilis序列的同源性達(dá)98%。基于供試菌株的ITS序列，比對(duì)獲取的同源性較高菌株的ITS序列和選取的藜麥（C. quinoa）、藜（C. album）、濱藜（Atriplex patula）及其他藜屬植物（Chenopodiumsp.）霜霉病菌株的ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），結(jié)果顯示菌株GSBY、GSLZ和GSTZ分別與來(lái)自南美洲（厄瓜多爾、秘魯、阿根廷、玻利維亞）、歐洲（丹麥、西班牙）、北美洲（美國(guó)）和亞洲（中國(guó)、韓國(guó)）寄主為藜麥、藜和藜屬植物的P. variabilis以94%的自展率聚為一支。結(jié)合形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育分析，確定菌株GSBY、GSLZ和GSTZ為P. variabilis。侵染厄瓜多爾、秘魯、丹麥、韓國(guó)藜麥和藜的P. farinosa（P. variabilis的曾用名）與侵染藜麥和藜的P. variabilis同樣聚為一支，充分說(shuō)明侵染藜麥和藜的霜霉菌P. farinosa應(yīng)更正為P. variabilis。系統(tǒng)發(fā)育說(shuō)明菌株GSBY、GSLZ和GSTZ與來(lái)自藜麥、藜和藜屬植物的P. variabilis遺傳進(jìn)化關(guān)系更近。而菌株GSKL和GSLT以98%的自展率聚為一支，又以87%的自展率與P. variabilis聚為一支。結(jié)合形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育，確定菌株GSKL和GSLT為P. variabilis。系統(tǒng)發(fā)育說(shuō)明菌株GSKL和GSLT二者的遺傳進(jìn)化關(guān)系更近，與其他地理來(lái)源的藜屬植物的P.variabilis存在地理種群遺傳分化。

圖4 采用最大似然法基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The phylogenetic tree based on rDNA-ITS sequence by maximum likelihood method

2.5 病原菌致病力測(cè)定

不同菌株致病力測(cè)定結(jié)果見圖5，菌株GSBY、GSLZ、GSTZ、GSKL和GSLT分別接菌后藜麥葉片均能發(fā)病，菌株GSKL和GSLT在接菌后第3天出現(xiàn)明顯褪綠斑點(diǎn)，其他菌株在第4～第6天出現(xiàn)褪綠斑（圖6）。不同菌株侵染藜麥的病情指數(shù)之間差異顯著（P<0.05），菌株GSKL的病情指數(shù)最大，為90.00，其次為GSLT，為83.33，最低的為GSTZ，為44.67，其他介于二者之間，說(shuō)明甘南高寒陰濕區(qū)和臨夏二陰氣候區(qū)霜霉菌致病力較強(qiáng)。致病力大小依次為菌株GSKL>菌株GSLT>菌株GSBY>菌株GSLZ>菌株GSTZ。對(duì)發(fā)病葉片的霜霉菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，確定其與原接種菌株一致，符合柯赫氏法則。

圖5 不同霜霉病菌株致病力Fig.5 Pathogenicity of downy mildew pathogen on qunioa

圖6 接種不同霜霉病菌株后葉盤的發(fā)病情況Fig.6 Disease incidence on leaf discs after inoculated with different strains of qunioa downy mildew

3 討論

我國(guó)藜麥種植面積在逐年增加的同時(shí)，霜霉病的發(fā)生和危害也在不斷蔓延和加劇。本試驗(yàn)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，甘肅藜麥霜霉病發(fā)生危害普遍嚴(yán)重，發(fā)病率和病情指數(shù)分別為15.56%～97.78%和15.67～95.00，局部地方呈爆發(fā)態(tài)勢(shì)，但不同生態(tài)區(qū)差異較大。在調(diào)查的所有地區(qū)中，臨夏二陰氣候區(qū)霜霉病發(fā)生最嚴(yán)重，尤其是康樂(lè)縣八松鄉(xiāng)，發(fā)病率和病情指數(shù)分別高達(dá)97.78%和95.00，該地區(qū)氣候涼爽，陰濕多雨，極利于病菌的生長(zhǎng)；白銀干旱區(qū)則發(fā)病最輕，該地區(qū)氣候干燥少雨；其余生態(tài)區(qū)均介于其間。由此可見，霜霉病發(fā)生嚴(yán)重程度與當(dāng)?shù)氐臍夂颦h(huán)境密切相關(guān)，多雨潮濕的地區(qū)發(fā)病重，干旱少雨的地區(qū)發(fā)病輕。這主要是因?yàn)樗咕钸m生長(zhǎng)環(huán)境條件為：溫度18～22 ℃，相對(duì)濕度>80%［21］。分析認(rèn)為在此條件下葉片氣孔通常開放［22］，而這利于病原菌孢子的萌發(fā)和侵入。鑒于藜麥霜霉病的防治十分困難［20］，在今后藜麥種植區(qū)域布局中可以減少濕度大的地區(qū)的播種面積，適當(dāng)增加氣候偏干燥地區(qū)的種植面積。此外，在調(diào)查過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，田間微環(huán)境同樣明顯影響病害的發(fā)生，種植密度過(guò)大，植株冠層相互重疊，造成微環(huán)境小氣候濕度過(guò)大，也會(huì)促進(jìn)病害的發(fā)生。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中，應(yīng)適當(dāng)密植，及時(shí)排澇，保持田間植株通風(fēng)透氣，從而減輕病害的發(fā)生。

病害的調(diào)查時(shí)期至關(guān)重要，恰當(dāng)?shù)臅r(shí)期能夠充分體現(xiàn)病害發(fā)生的嚴(yán)重程度。甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藜麥研究團(tuán)隊(duì)在前期病害調(diào)查的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)，藜麥?zhǔn)⒒ㄆ诓『Πl(fā)生嚴(yán)重，為霜霉病盛發(fā)期，因此確定盛花期為霜霉病調(diào)查的最佳時(shí)期。有學(xué)者認(rèn)為花芽分化期是藜麥抗性鑒定最重要和關(guān)鍵時(shí)期［23］。本研究確定的調(diào)查時(shí)期與其存在微小差異，這可能受寄主、氣候環(huán)境、病原菌特性等多種因素影響。此外，本研究發(fā)現(xiàn)藜麥葉片表現(xiàn)出不同顏色的褪綠斑，典型癥狀呈黃綠色至黃色，少數(shù)呈淺紅色、深紅色和紫色，其顏色主要與藜麥的品種有關(guān)，取決于植物的色素種類［24-25］，這為今后研究植物色素與病害發(fā)生的關(guān)系提供了新視角。

病原菌的形態(tài)特征是鑒別其歸屬的重要依據(jù)，也是病害鑒別過(guò)程中必不可少的環(huán)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)，甘肅不同生態(tài)區(qū)病原菌的形態(tài)特征與已報(bào)道藜麥霜霉病病原菌P. variabilis的形態(tài)特征［12，26］一致。孢子囊的長(zhǎng)寬比及梗的有無(wú)是從形態(tài)學(xué)鑒別不同藜屬植物（Chenopodiumspp.）霜霉屬（Peronospora）病原菌的重要特性［16］。本研究中，霜霉病病原菌孢子囊具有短而小的梗，長(zhǎng)寬比為1.00～1.56（平均1.21～1.42），這與Choi等［12］對(duì)P. variabilis的描述一致。甘肅不同生態(tài)區(qū)霜霉病菌株孢子囊大小存在差異，這與前人的研究結(jié)果相似［12，27］，這種差異可能與生長(zhǎng)環(huán)境、寄主植物、病原菌小種、孢子年齡等有關(guān)［28］。rDNA-ITS序列分析是比較藜屬近緣物種非常有用的一種工具，常應(yīng)用于霜霉屬近緣種［29］和近親屬內(nèi)不同菌種的分類和系統(tǒng)發(fā)育的研究。本研究基于rDNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，甘肅藜麥霜霉病病原菌與侵染藜麥和藜的P. variabilis聚為一支。結(jié)合形態(tài)特征和分子生物學(xué)將甘肅藜麥霜霉病病原菌鑒定為P. variabilis，這與殷輝等［30］對(duì)山西藜麥霜霉病的鑒定結(jié)果一致。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示甘肅藜麥霜霉病菌株GSKL、GSLT與GSBY、GSLZ、GSTZ及其他來(lái)源的P. variabilis聚為不同分支，說(shuō)明不同生態(tài)區(qū)霜霉病菌株之間存在地理種群遺傳分化，這與Nolen等［31］的研究結(jié)果相似。分析其原因可能是P. variabilis的有性生殖是卵配生殖（Oogamous），存在異宗配合（Heterothallic）現(xiàn)象［32］，導(dǎo)致種群發(fā)生變異［20］。

本研究發(fā)現(xiàn)甘肅藜麥霜霉病不同菌株的致病力之間存在顯著差異（P<0.05），尤其是菌株GSKL和GSLT與其他菌株相比表現(xiàn)出強(qiáng)致病力，說(shuō)明P. variabilis可能發(fā)生變異，產(chǎn)生新的毒力基因［33］，導(dǎo)致致病力增強(qiáng)，致病力產(chǎn)生分化，這與Ochoa等［34］研究結(jié)果相似。藜麥霜霉病P. variabilis種群的變異及致病力的增強(qiáng)，給其防治帶來(lái)了極大挑戰(zhàn)?；诖耍罄m(xù)應(yīng)該加強(qiáng)P. variabilis毒力的監(jiān)測(cè)，篩選鑒別寄主，構(gòu)建鑒別體系，加強(qiáng)病害的防控研究工作。但由于P. variabilis是活體營(yíng)養(yǎng)型病原菌，與其他能夠離體培養(yǎng)的病原菌相比，該病原菌的分離培養(yǎng)顯得更加困難［35］，從而限制了P.variabilis的研究，也給科研人員提出了更大的挑戰(zhàn)。

4 結(jié)論

甘肅不同生態(tài)區(qū)藜麥霜霉病發(fā)生普遍嚴(yán)重，局部地方呈爆發(fā)態(tài)勢(shì)，病害發(fā)生與氣候環(huán)境濕度密切相關(guān)；不同生態(tài)區(qū)病害發(fā)生危害嚴(yán)重程度由高到低依次為：臨夏二陰氣候區(qū)>甘南高寒陰濕區(qū)>天祝高寒區(qū)>蘭州半干旱區(qū)>白銀干旱區(qū)；結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)，將甘肅藜麥霜霉病病原菌鑒定為P. variabilis，不同生態(tài)區(qū)P. variabilis的孢子囊和卵孢子大小差異顯著；不同生態(tài)區(qū)P. variabilis菌株之間致病力差異顯著，從大到小依次為：菌株GSKL>菌株GSLT>菌株GSBY>菌株GSLZ>菌株GSTZ，不同菌株之間存在地理種群遺傳分化。