張 容 陳士強 劉建鳳 王建華 范德佳 韓 燕 何震天

（江蘇里下河地區(qū)農業(yè)科學研究所，江蘇 揚州 225007）

小麥（Triticum aestivumL.）是世界上重要的糧食作物之一，提供人類約20%的食物能量。小麥穗部性狀由穗長、小穗數(shù)、穗粒數(shù)和穗緊密度等性狀綜合決定［1］，控制這些性狀的主要基因通常在數(shù)量性狀位點（quantitative trait loci， QTL）水平上呈現(xiàn)為多效應或連鎖現(xiàn)象［2］。通過研究小麥穗部發(fā)育異常突變體，有利于促進穗部性狀遺傳機理的解析［3］。宋全昊等［4］在育種材料中發(fā)現(xiàn)了一個穗部發(fā)育突變體sda1，并將突變基因SDA1定位于6B染色體，推測該基因是利用植株中同化產(chǎn)物的關鍵基因，同時影響花器官發(fā)育和抽穗期；周麗敏等［5］通過質譜分析表明TaSDA1基因具有多效性；Faris等［6］對野生小麥的緊湊穗基因進行分析，發(fā)現(xiàn)穗長和每穗小穗數(shù)是由不同基因控制；顧晶晶［7］研究穗發(fā)育障礙突變體sms1，推測位于6B染色體上SPT5-like是sms1的候選基因；杜啟迪等［8］經(jīng)甲基磺酸乙酯（ethyl methyl sulfonate，EMS）誘變獲得了表型穩(wěn)定的頂端小穗退化突變體asd1，將目標突變基因定位在7A染色體短臂上，推斷該區(qū)段存在一個新的控制小麥花器官發(fā)育及穗部形態(tài)發(fā)育的重要基因。由上述前人研究可以看出，小麥穗部性狀突變類型豐富，控制這些突變性狀的基因位點也各不相同。鑒定出更多的小麥穗型突變體，有利于進一步挖掘新的基因位點，繼而促進育種應用。

小麥穗部穗軸節(jié)縮短影響穗長和穗密度，同時影響小麥產(chǎn)量及抗性［9］。挖掘小麥穗軸節(jié)長短調控基因，闡述穗部發(fā)育異常的分子機制有助于選育穗部性狀優(yōu)良的高產(chǎn)小麥品種［10］，提升小麥產(chǎn)量、品質及抗性［11］。因此，本研究利用60Co-γ射線誘變處理，獲得一個穗軸節(jié)和穗下節(jié)明顯縮短的穩(wěn)定穗型突變體sui1，并對其進行表型鑒定，利用轉錄組測序技術對不同樣品間的差異表達基因進行功能注釋、富集分析和關鍵功能基因的挖掘，以期為小麥穗型突變體的分子機理研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2019—2020年以高產(chǎn)小麥品種揚輻麥4號（YFM4）作為野生型（wild-type， WT）對照，以突變體sui1為供試材料，按照25 cm的行距及10 cm的株距種植于江蘇里下河地區(qū)農業(yè)科學研究所萬?；卦囼炋?，試驗田前茬種植水稻，水肥管理同大田。sui1是由江蘇里下河地區(qū)農業(yè)科學研究所核技術應用研究室通過輻射誘變創(chuàng)制的穗型突變體。300 Gy60Co-γ射線輻射誘變YFM4小麥干種子，密播控分蘗種植M1代，隨機收取1 000個單穗，進行300 Gy60Co-γ射線二次輻照后種植成穗行。穗行中出現(xiàn)株高略矮、穗型極短突變體。單株收獲，經(jīng)多代自交，獲得穩(wěn)定穗型發(fā)育突變體，命名為sui1。

1.2 試驗方法

1.2.1 表型性狀調查 從小花原基分化期到灌漿期，分別于拔節(jié)前期、拔節(jié)期、孕穗期、花后20 d取sui1和YFM4的幼穗，進行解剖后利用PhenixXTL-165系列體式顯微鏡（鳳凰，江西）觀察穗部發(fā)育情況。成熟期調查株高、穗長、結實小穗數(shù)和單穗粒數(shù)等主要農藝性狀，統(tǒng)計分析sui1與YFM4各個農藝性狀之間的差異，采用獨立樣本t檢驗分析數(shù)據(jù)的差異顯著性。抽穗期田間拋灑含赤霉病菌麥粒誘導自然發(fā)病，用于鑒定sui1和YFM4赤霉病發(fā)病情況。

1.2.2 轉錄組測序分析 分別于孕穗期（T1）、灌漿期（T2）取樣，T1取穗軸節(jié)和穗下節(jié)，T2取穗軸節(jié)，2個生物學重復。取樣后迅速放到液氮中，然后移至-80 ℃冰箱中備用。

采用Trizol法分別提取突變體與野生型的總RNA。采用NanoDrop 2000超微量分光光度計（賽默飛，美國）測定RNA濃度和純度，采用Agilent 2100生物分析儀（安捷倫，美國）分析評估RNA完整性。樣品檢測合格后，送往北京百邁客公司進行轉錄組測序（RNA-Seq）。

利用BioMag-Oligo（dT）的磁珠富集純化mRNA；在富集到的mRNA中加入Fragmentation Buffer，將mRNA隨機打斷；以打斷的mRNA為模板，用六堿基隨機引物合成第一條cDNA鏈（由北京百邁客公司合成），然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二條cDNA鏈，利用AMPure XP beads純化cDNA；對純化的雙鏈cDNA再進行末端修復、加A尾并連接測序接頭，然后用AMPure XP beads進行目的片段（300～400 bp）選擇；最后通過PCR富集得到cDNA文庫，由北京百邁客公司完成。文庫構建完成后，用Illumina高通量測序平臺對cDNA文庫進行測序。

測序的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過濾得到干凈數(shù)據(jù)（clean data），利用HISAT2軟件對小麥參考基因組進行序列的比對，利用StringTie對比對上的讀長（reads）進行組裝和定量；使用DESeq2軟件對突變體和野生型間差異表達基因（differentially expressed genes， DEGs）進行篩選，在百邁客云平臺（www.biocloud.net）對DEGs做基因本體論（gene ontology， GO）功能 分類 和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）Pathway富集分析。

2 結果與分析

2.1 穗型突變體表型與生物學特征

與野生型YFM4相比，突變體sui1分蘗數(shù)增加，孕穗期至成熟期株高降低（圖1-A），穗部排列緊密（圖1-B），穗軸節(jié)及穗下節(jié)長度縮短（圖1-C、D），小穗、劍葉及葉鞘長度sui1與YFM4差異不明顯（圖1-E～G）。

圖1 小麥穗型突變體表型Fig.1 Phenotype of wheat spike mutant

由圖2可以看出，拔節(jié)之前，sui1與YFM4幼穗發(fā)育差異不明顯（圖2-A）；拔節(jié)后，YFM4幼穗穗軸開始伸長，sui1幼穗穗軸伸長緩慢（圖2-B）；孕穗期之后，YFM4穗軸繼續(xù)伸長，而sui1穗軸未伸長，小穗在穗軸上緊密排列（圖2-C、D）；花后20 d調查自然發(fā)病田塊突變體和野生型赤霉病發(fā)病情況，可知sui1較YFM4赤霉病發(fā)病程度加重（圖2-E）。

圖2 YFM4和sui1穗型發(fā)育Fig.2 Spike growth of YFM4 and mutant sui1

農藝性狀調查結果顯示，突變體sui1株高、穗長、穗下節(jié)間長度極顯著低于野生型，可孕穗數(shù)、每穗粒數(shù)、千粒重與野生型無顯著差異（表1）。由此可見，突變體表型差異主要來自穗軸節(jié)和穗下節(jié)間長度的縮短，與小穗數(shù)、穗粒數(shù)及粒重等穗部性狀關系不明顯。推斷突變體穗軸長度的變化與幼穗早期發(fā)育、小穗和小花分生組織及花器官原基的分化無明顯關系，突變來自拔節(jié)抽穗后期的生長發(fā)育。

表1 YFM4和突變體sui1主要農藝性狀Table 1 Major agronomic traits of YFM4 and mutant sui1

2.2 穗型突變體轉錄組分析

2.2.1 RNA-Seq結果分析 為了明確YFM4背景的sui1突變體穗型變化的分子基礎，分別選取T1野生型穗軸節(jié)（A1、A2）、T1突變體穗軸節(jié)（B1、B2）、T2野生型穗軸節(jié)（C1、C2）、T2突變體穗軸節(jié)（D1、D2）和T1野生型穗下節(jié)（E1、E2）、T1突變體穗下節(jié)（F1、F2）為材料提取總RNA，進行RNA-Seq。經(jīng)過測序質量控制（去除含有接頭的reads；去除N比例大于10%的reads；去除質量值Q≤10的堿基數(shù)占整條read的50%以上的reads），共得到1.7×105M clean data，各樣品Q30堿基百分比均≥95.26%。將每個樣本的高質量reads比對到小麥中國春參考基因組（RefSeq v.1.1）上，對比率在91.32%～94.73%之間（表2）。

表2 測序數(shù)據(jù)評估Table 2 Statistics results of sequencing raw data

2.2.2 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP）位點 根據(jù)SNP位點堿基替換的不同方式，可以將SNP位點分為轉換（transition）和顛換（transversion）兩種類型。根據(jù)SNP位點的等位（allele）數(shù)目，可以將SNP位點分為純合型SNP位點（只有一個等位）和雜合型SNP位點（兩個或多個等位）。對各樣品篩選出的SNP位點數(shù)目、轉換類型比例、顛換類型比例以及雜合型SNP位點比例進行統(tǒng)計（表3），SNP位點雜合性比例低于16.04%，SNP位點堿基轉換多于顛換。

表3 SNP位點統(tǒng)計Table 3 Statistics results of SNP locus

2.2.3 差異表達基因 基因表達具有時間和空間特異性，為了確定YFM4和sui1之間基因表達的差異，根據(jù)每千個堿基轉錄每百萬映射讀取的值（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments， FPKM）對基因表達水平進行標準化。所有唯一映射讀取的fragments被用來計算基因FPKM值。根據(jù)DESeq2分析結果，以差異倍數(shù)（fold change）≥2，且錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate， FDR）<0.01作為標準進行篩選。由表4和圖3可知，T1階段，穗軸節(jié)在突變體和野生型之間共篩選出11 200個差異表達基因（differential expressed genes， DEGs），其 中 上調 基因6 182個（占 比55.2%），下 調 基 因5 018個（占 比44.8%）；穗下節(jié)間在突變體和野生型之間共篩選出28 641個DEGs，其中上調基因14 632個（占總DEGs的51.1%），下調基因14 009個（占總DEGs的48.9%）。

表4 差異表達基因數(shù)目Table 4 Number of differentially expressed genes

T2階段，穗軸節(jié)在突變體和野生型之間共篩選出5 810個DEGs，其中上調基因2 138個（占總DEGs的36.8%），下調基因3 672個（占總DEGs的63.2%）。不同器官組織，野生型和突變體穗下節(jié)的DEGs多于穗軸節(jié)；不同表達時期，T1野生型和突變體穗軸節(jié)的DEGs多于T2。將三組差異基因進行維恩圖繪制，有差異共表達基因2 526個，其中上調基因890個（圖3-A），下調基因1 636個（圖3-B）。

圖3 差異表達基因韋恩圖Fig.3 Wayn plot of DEGs

2.2.4 差異表達基因GO分類分析 為了解析YFM4和sui1差異表達基因的生物學意義，對上述基因進行GO富集分類。差異表達基因分別注釋在生物學過程（biological process）、細胞組分（cellular component）和分子功能（molecular function）的55個分類條目上。對T1突變體和野生型穗軸節(jié)11 200個差異表達基因進行GO功能注釋，共有7 736個基因獲得注釋（圖4-A）；對T2突變體和野生型穗軸節(jié)5 810個差異表達基因進行GO功能注釋，共有3 344個基因獲得注釋（圖4-B）；對T1突變體和野生型穗下節(jié)間28 641個差異表達基因進行GO功能注釋和分析，共有20 878個基因獲得注釋（圖4-C）。

圖4 差異表達基因GO注釋分類Fig.4 GO classification of differentially expressed genes

分析T1、T2不同時期YFM4和sui1差異表達基因發(fā)現(xiàn)（圖5-A，B），生物學過程中，T1時期以碳水化合物代謝過程（carbohydrate metabolic process）的基因數(shù)最多（7.36%），細胞壁組織（cell wall organization）次之（3.75%）；T2時期以防御反應（defence response）的基因數(shù)最多（9.73%），碳水化合物代謝過程次之（6.59%）。細胞組分中，T1時期以細胞膜（membrane）功能組擁有的基因數(shù)最多（6.72%），質膜（plasma membrane）功能組次之（4.20%）；T2時期以葉綠體（chloroplast）功能組擁有的基因數(shù)最多（4.80%），葉綠體類囊體膜（chloroplast thylakoid membrane）功能組次之（2.64%）。分子功能注釋的基因在T1、T2兩個時期富集相同，大部分集中在ATP結合（ATP binding）、蛋白激酶活性（protein kinase activity）上。

分析穗軸節(jié)、穗下節(jié)不同組織YFM4和sui1差異表達基因發(fā)現(xiàn)（圖5-B，C），生物學過程中，穗下節(jié)以轉變（translation）的基因數(shù)最多（6.71%）。細胞組分中，穗下節(jié)以核小體（nucleosome）功能組擁有基因數(shù)最多（3.66%）。分子功能注釋基因穗下節(jié)大部分基因除集中在ATP結合外，還主要富集在核糖體的結構成分（structural constituent of ribosome）上。

綜上分析認為，不同時期sui1較YFM4穗軸節(jié)的基因表達差異先來自碳水化合物代謝過程，后因穗軸伸長受到抑制及穗部病害的發(fā)生，導致防御反應的差異基因增多；不同組織代謝過程不同，生物學過程和細胞組分差異較大，但分子功能注釋大多集中在ATP結合上。

2.2.5 差異表達基因KEGG富集分析 通過對差異表達基因的KEGG富集分析，可以預測基因參與的關鍵代謝通路，通過對差異表達基因的通路注釋分析可以進一步解讀基因的功能。對T1突變體和野生型穗軸節(jié)注釋到的7 736個差異表達基因進行KEGG分析（圖5-A），發(fā)現(xiàn)這些基因富集到133個代謝通路中，選取富集分析結果中P值最?。ǜ患铒@著）的前20條通路途徑并繪制散點圖。富集因子最高的是光合生物中的碳固定（carbon fixation in photosynthetic organisms）途徑，富集因子2.80，富集差異表達基因數(shù)量最多的是植物-病原體互作（plant-pathogen interaction）途徑，富集到了518個差異表達基因。對T2突變體和野生型穗軸節(jié)注釋到的3 344個差異表達基因進行KEGG分析（圖5-B），發(fā)現(xiàn)這些基因富集到124個代謝通路中。富集因子最高的是光合作用-天線蛋白（photosynthesisantenna proteins）途徑，富集因子4.85，富集差異表達基因數(shù)量最多的是植物-病原體互作途徑，富集到了330個差異表達基因。推測上述途徑對小麥突變體的穗軸節(jié)及穗型變化具有重要作用。

對穗下節(jié)注釋到的20 879個差異表達基因進行KEGG分析（圖5-C），發(fā)現(xiàn)這些基因共富集到136個代謝通路中。富集因子最高的是光合作用-天線蛋白途徑，富集因子3.54，前20條通路中富集差異表達基因數(shù)量最多的是核糖體（ribosome）途徑，但所有通路中植物-病原體互作途徑富集差異表達基因數(shù)量仍為最多，有995個差異表達基因。推測上述途徑對小麥突變體的穗下節(jié)及株高的變化具有重要作用。穗下節(jié)的差異表達基因富集不同于穗軸節(jié)，可能與穗軸節(jié)是穗型變異直接功能器官，而穗下節(jié)間通過莖稈碳水化合物的運輸間接影響穗軸的伸長有關。在植物-病原體互作通路中進行差異共表達基因篩選，篩選出相關基因160個，主要含防御反應相關基因63個（39%），蛋白激酶活性相關基因21個（13%），ADP結合相關基因18個（11%），推測上述基因可能與sui1突變性狀相關。

圖5 KEGG富集氣泡分析圖Fig.5 Bubble diagram of the KEGG enrichment

3 討論

基于RNA-Seq的轉錄組分析可以在整體轉錄水平揭示全基因組內基因的表達情況，通過轉錄組分析可以獲得所有基因的表達趨勢，從而用于基因功能和調控的深度研究［12-14］。溫宏偉等［15］和李玲紅等［16］基于轉錄組測序研究，發(fā)現(xiàn)了與蠟質功能相關的差異顯著表達基因；范小鋒等［17］對小麥直立突變體進行轉錄組分析，發(fā)現(xiàn)差異表達基因主要富集在植物激素信號轉導、淀粉和蔗糖的生物合成等通路。本研究通過轉錄組分析，在突變體和野生型之間篩選出差異表達基因2 526個，KEGG分析發(fā)現(xiàn)差異表達基因主要富集在植物-病原體互作-光合生物中的碳固定、光合作用-天線蛋白等通路?；谕蛔凅w與野生型相關表型鑒定和轉錄組分析，推測該通路中的關鍵基因和小麥穗型突變后赤霉病發(fā)病程度加重有關。

相同的穗長上容納更多的小穗數(shù)，可使穗密度增加［18］；但小穗數(shù)相同，穗軸節(jié)縮短也會導致穗密度增加。陳樹林［19］通過EMS誘變蘇麥3號獲得矮稈密穗突變體NAU164（Rht23），認為穗型變密是由穗軸節(jié)間變短所致，株高變矮是各節(jié)間長度變短所致。本試驗基于YFM4野生型的突變，研究發(fā)現(xiàn)穗軸節(jié)長度變短、小穗數(shù)不變，穗粒數(shù)相差不大，密穗產(chǎn)生的原因也主要在于穗軸節(jié)的長度縮短。不同于突變體NAU164，突變體sui1的突變主要來自拔節(jié)孕穗期之后，基部節(jié)間長度不變，穗下節(jié)間長度縮短，株高降低。前人研究還發(fā)現(xiàn)，小麥赤霉病抗性與株高及小穗密度具有相關性［20-22］，徐晴等［23］研究矮稈基因在我國不同麥區(qū)分布及其對赤霉病抗性的影響，發(fā)現(xiàn)不同矮稈基因對小麥穗性狀的遺傳差異可能是導致赤霉病抗性和不同麥區(qū)矮稈基因選擇利用差異的部分原因。本研究中突變體sui1穗型較野生型穗型變密、株高變矮后，赤霉病抗性減弱，與前人研究結果一致。

小麥的穗密度受多個遺傳位點控制［24-26］。其中，基因C的顯性作用使得密穗小麥穗部比普通小麥穗部更緊湊。基因C被定位在小麥2D染色體上，通過研究四倍體小麥和六倍體小麥的密穗突變體，發(fā)現(xiàn)并定位了4個決定穗密度的位點（C739、C17648、Cpm和Cp）［27］。Q基因是重要的馴化基因，具有多向性，可以同時影響小麥穎殼強度、穗軸韌性、穗長、株高、抽穗期等多個性狀［28］。5A染色體上的Q基因是控制馴化相關性狀的主效基因。本研究在植物-病原體互作通路中篩選出160個差異共表達基因，其中有8個基因位于2D染色體上，3個基因位于5A染色體上，篩選到的位于2D和5A染色體上的基因位點不同于C基因和Q基因控制穗密度的相關位點，可能為新的突變基因位點。為進一步挖掘和驗證突變基因與sui1穗部性狀相關性，后續(xù)工作還需要建立遺傳群體，進行相關基因位點的驗證和功能分析。

4 結論

本研究在揚輻麥4號突變體庫中獲得一個穗軸節(jié)和穗下節(jié)明顯縮短、穗密度增加、株高降低、赤霉病抗性變差的穗型突變體sui1。通過對小麥植株不同時期、不同組織的轉錄組分析，比較突變體和野生型間的基因表達水平，篩選出差異共表達基因2 526個，其中上調表達基因890個，下調表達基因1 636個。通過功能注釋和富集分析發(fā)現(xiàn)，差異基因主要涉及植物-病原體互作、光合生物中的碳固定和光合作用-天線蛋白等通路，推測通路中關鍵基因的表達可能與突變體sui1相較于野生型穗部性狀產(chǎn)生的差異有關。